Para comenzar, obtenga las células madre embrionarias humanas en el medio de células madre con una densidad celular del 80 al 90%Después de eliminar el medio gastado, enjuague las células en cada pocillo con un mililitro de 1X DPBS. Incubar las colonias de células madre en cada pocillo con un mililitro de EDTA 0,5 milimolar durante aproximadamente cinco minutos a 37 grados centígrados. Revise la morfología de la colonia para confirmar que los bordes estén ligeramente enroscados con espacios sueltos.
Aspire el EDTA y, si es necesario, incube las células a 37 grados centígrados durante uno o dos minutos más, pero sin exceder los ocho minutos. Enjuague suavemente las células de cada pocillo con seis mililitros de medio A que contenga seis microlitros de solución de 10 milimolares de inhibidor de ROCK Y-27632. Golpea suavemente el fondo del plato para ayudar a enjuagar las células.
Después de 24 horas, observe las células bajo el microscopio para confirmar la formación del cuerpo embrionario. Con una pipeta de 10 mililitros, recoja los cuerpos embrionarios en un tubo centrífugo de 15 mililitros y espere a que los cuerpos embrionarios se asienten en el fondo durante cinco minutos. A continuación, aspire cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender los cuerpos embrionarios en seis mililitros de medio fresco A. Transfiéralos a un nuevo pocillo de baja adherencia de una placa de seis pocillos y cultive en una incubadora a 37 grados centígrados.
Al cuarto día, cubra un plato de 10 centímetros con tres mililitros de solución de gelatina de pescado al 0,1% e incube durante al menos una hora en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados. Luego retire la solución de gelatina y enjuague el plato una vez con cinco a seis mililitros de 1X DPBS. Recoja cuidadosamente los cuerpos embrionarios en un tubo centrífugo de 15 mililitros y espere a que los cuerpos embrionarios se asienten en el fondo en cinco minutos.
Vuelva a suspender suavemente los cuerpos embrionarios con 15 mililitros de B medio y transfiéralos al plato de 10 centímetros recubierto. Cultivo en una incubadora de 37 grados Celsius, 5% de dióxido de carbono durante una semana después de 49 días. Centrifugar las células a 200 x g durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Aspire cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender las células con dos mililitros de medio fresco C. Transfiera a un nuevo pocillo de baja adherencia de una placa de seis pocillos. Incube la placa en una incubadora de 5% de dióxido de carbono, a 37 grados centígrados. En el día 56, reemplace el medio gastado con dos mililitros de medio C por pocillo.
Examine la placa bajo un microscopio para identificar la microglía ramificada que se adhiere al fondo del pozo de baja adherencia. Para cosechar microglía para el cocultivo, reemplace suavemente el medio C en cada pocillo con un mililitro de Accutase e incube a 37 grados Celsius durante tres minutos. Con una pipeta de cinco mililitros, recoja las células de la microglía en un tubo de 15 mililitros y centrifugue las células a 200 x g durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Después de desechar el sobrenadante, suspenda la microglía con un mililitro de E medio.
