首先，在细胞密度为 80% 至 90% 的干细胞培养基中获得人胚胎干细胞去除用过的培养基后，用 1 毫升 1X DPBS 冲洗每个孔中的细胞。将每个孔中的干细胞集落与 1 毫升 0.5 毫摩尔 EDTA 在 37 摄氏度下孵育约 5 分钟。检查菌落形态，确认边缘略微卷曲，有松散的间隙。
吸出 EDTA，如有必要，将细胞在 37 摄氏度下再孵育 1 到 2 分钟，但不要超过 8 分钟。用 6 毫升含有 6 微升 10 毫摩尔 ROCK 抑制剂 Y-27632 溶液的培养基 A 轻轻冲洗每个孔中的细胞。轻轻敲击培养皿底部以帮助冲洗细胞。
24 小时后，在显微镜下观察细胞以确认胚胎体的形成。使用 10 毫升移液器，将胚胎体收集到 15 毫升离心管中，等待胚胎体沉降到底部 5 分钟。然后小心吸出上清液，将胚胎体重悬于 6 毫升新鲜培养基中 A.将它们转移到六孔板的新低粘附孔中，并在 37 摄氏度的培养箱中培养。
第 4 天，在 10 厘米的培养皿中涂上 3 毫升 0.1% 鱼明胶溶液，并在 5% 二氧化碳、37 摄氏度的培养箱中孵育至少 1 小时。然后去除明胶溶液，用 5 到 6 毫升 1X DPBS 冲洗培养皿一次。小心地将胚胎体收集到 15 毫升离心管中，等待胚胎体在 5 分钟内沉降到底部。
用 15 毫升培养基 B 轻轻重悬胚胎体，并将它们转移到涂层的 10 厘米培养皿中。49 天后在 37 摄氏度、5% 二氧化碳培养箱中培养一周。在室温下以 200 x g 离心细胞 5 分钟。
小心吸出上清液，并用 2 毫升新鲜培养基 C.Transfer 将细胞重悬于 6 孔板的新的低粘附孔中。将板在 5% 二氧化碳、37 摄氏度的培养箱中孵育。在第 56 天，用每孔 2 毫升培养基 C 替换用过的培养基。
在显微镜下检查板，以确定分枝的小胶质细胞粘附在低粘附力的底部。要收获用于共培养的小胶质细胞，请用 1 毫升 Accutase 轻轻替换每个孔中的培养基 C，并在 37 摄氏度下孵育 3 分钟。使用 5 mL 移液器，将小胶质细胞收集到 15 mL 试管中，并在室温下以 200 x g 的离心力离心细胞 5 分钟。
弃去上清液后，用 1 毫升培养基 E 悬浮小胶质细胞。
