먼저, 세포 밀도가 80-90%인 줄기 세포 배지에서 인간 배아 줄기 세포를 얻습니다.사용한 배지를 제거한 후 각 웰의 세포를 1X DPBS 1밀리리터로 헹굽니다. 각 웰의 줄기 세포 콜로니를 0.5 밀리몰 EDTA로 섭씨 37도에서 약 5분 동안 배양합니다. 콜로니 형태를 확인하여 가장자리가 느슨한 틈으로 약간 말려 있는지 확인합니다.
EDTA를 흡인하고 필요한 경우 섭씨 37도에서 1-2분 더 동안 세포를 배양하되 8분을 초과하지 않습니다. 6 마이크로 리터의 10 밀리몰 ROCK 억제제 Y-27632 용액을 함유 한 6 밀리리터의 배지 A로 각 웰의 세포를 부드럽게 헹굽니다. 접시 바닥을 가볍게 두드려 세포를 헹굽니다.
24시간 후 현미경으로 세포를 관찰하여 배아체 형성을 확인합니다. 10밀리리터 피펫을 사용하여 배아체를 15밀리리터 원심 튜브에 모으고 배아체가 바닥에 가라앉을 때까지 5분 동안 기다립니다. 그런 다음 상층액을 조심스럽게 흡인하고 배아체를 6밀리리터의 신선한 배지 A에 재현탁시킵니다. 섭씨 37도 인큐베이터에서 6웰 플레이트와 배양액의 새로운 저접착 웰로 옮깁니다.
넷째 날에는 10cm 접시에 0.1% 생선 젤라틴 용액 3ml를 코팅하고 이산화탄소 5%, 섭씨 37도의 인큐베이터에서 최소 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 젤라틴 용액을 제거하고 5-6 밀리리터의 1X DPBS로 접시를 한 번 헹굽니다. 배아체를 15밀리리터 원심관에 조심스럽게 모으고 배아체가 5분 안에 바닥에 가라앉을 때까지 기다립니다.
15ml의 배지 B로 배아체를 부드럽게 재현탁하고 코팅된 10cm 접시에 옮깁니다. 섭씨 37도, 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 49일 후 일주일 동안 배양합니다. 실온에서 200 x g에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다.
상층액을 조심스럽게 흡인하고 2ml의 신선한 배지 C로 세포를 재현탁시킵니다. 5% 이산화탄소, 섭씨 37도의 인큐베이터에서 플레이트를 배양합니다. 56일째에 사용한 매체를 웰당 2밀리리터의 매체 C로 교체합니다.
현미경으로 플레이트를 검사하여 분지화된 미세아교세포가 접착력이 낮은 웰의 바닥에 부착되어 있는지 확인합니다. 공동 배양을 위해 미세아교세포를 수확하려면 각 웰의 배지 C를 1밀리리터의 Accutase로 부드럽게 교체하고 섭씨 37도에서 3분 동안 배양합니다. 5밀리리터 피펫을 사용하여 미세아교세포를 15밀리리터 튜브에 모으고 실온에서 5분 동안 200 x g에서 세포를 원심분리합니다.
상층액을 버린 후 미세아교세포에 1밀리리터의 배지 E를 현탁시킵니다.
