Per iniziare, ottenere le cellule staminali embrionali umane nel terreno delle cellule staminali con una densità cellulare compresa tra l'80 e il 90%Dopo aver rimosso il terreno esaurito, sciacquare le cellule in ciascun pozzetto con un millilitro di 1X DPBS. Incubare le colonie di cellule staminali in ciascun pozzetto con un millilitro di EDTA 0,5 millimolare per circa cinque minuti a 37 gradi Celsius. Controlla la morfologia della colonia per confermare che i bordi siano leggermente arricciati con spazi vuoti allentati.
Aspirare l'EDTA e, se necessario, incubare le cellule a 37 gradi Celsius per altri uno o due minuti, ma non più di otto minuti. Sciacquare delicatamente le cellule in ciascun pozzetto con sei millilitri di terreno A contenente sei microlitri di soluzione di inibitore ROCK da 10 millimolari di Y-27632. Picchiettare delicatamente il fondo del piatto per aiutare a sciacquare le cellule.
Dopo 24 ore, osservare le cellule al microscopio per confermare la formazione del corpo embrionale. Utilizzando una pipetta da 10 millilitri, raccogli i corpi degli embrioni in una provetta centrifuga da 15 millilitri e attendi che i corpi degli embrioni si depositino sul fondo per cinque minuti. Quindi aspirare con cura il surnatante e risospendere i corpi embrionali in sei millilitri di terreno fresco A.Trasferirli in un nuovo pozzetto a bassa adesione di una piastra a sei pozzetti e coltura in un'incubatrice a 37 gradi Celsius.
Il quarto giorno, rivestire un piatto di 10 centimetri con tre millilitri di soluzione di gelatina di pesce allo 0,1% e incubare per almeno un'ora in un'incubatrice al 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius. Quindi rimuovere la soluzione di gelatina e sciacquare il piatto una volta con cinque o sei millilitri di 1X DPBS. Raccogli con cura i corpi degli embrioni in una provetta centrifuga da 15 millilitri e attendi che i corpi degli embrioni si depositino sul fondo in cinque minuti.
Risospendere delicatamente i corpi embrionali con 15 millilitri di terreno B e trasferirli nel piatto rivestito da 10 centimetri. Coltura in un incubatore a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per una settimana dopo 49 giorni. Centrifugare le celle a 200 x g per cinque minuti a temperatura ambiente.
Aspirare con cura il surnatante e risospendere le cellule con due millilitri di terreno fresco C.Trasferire in un nuovo pozzetto a bassa adesione di una piastra a sei pozzetti. Incubare la piastra in un incubatore al 5% di anidride carbonica, 37 gradi Celsius. Il giorno 56, sostituire il terreno esaurito con due millilitri di terreno C per pozzetto.
Esaminare la piastra al microscopio per identificare le microglia ramificate che aderiscono al fondo del pozzetto a bassa adesione. Per raccogliere le microglia per la co-coltura, sostituire delicatamente il terreno C in ciascun pozzetto con un millilitro di Accutase e incubare a 37 gradi Celsius per tre minuti. Utilizzando una pipetta da cinque millilitri, raccogliere le cellule della microglia in una provetta da 15 millilitri e centrifugare le cellule a 200 x g per cinque minuti a temperatura ambiente.
Dopo aver scartato il surnatante, sospendere la microglia con un millilitro di terreno E.
