הרכבת אורגנואידים ברשתית עם מיקרוגליה

כדי להתחיל, להשיג את תאי הגזע העובריים האנושיים בתווך תאי הגזע עם צפיפות תאים של 80 עד 90%לאחר הסרת המדיום ביליה, לשטוף את התאים בכל באר עם מיליליטר אחד של 1X DPBS. דגרו על מושבות תאי הגזע בכל באר עם מיליליטר אחד של 0.5 מילימולר EDTA למשך כחמש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. בדוק את המורפולוגיה של המושבה כדי לוודא שהקצוות מכורבלים מעט עם רווחים רופפים.

שואפים את ה-EDTA, ואם יש צורך, דוגרים על תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך דקה עד שתי דקות נוספות, אך לא יותר משמונה דקות. שטפו בעדינות את התאים בכל באר עם שישה מיליליטר של מדיום A המכיל שישה מיקרוליטרים של 10 מילימולרי מעכב סלע Y-27632 פתרון. טפחו בעדינות על תחתית הכלי כדי לסייע בשטיפת התאים.

לאחר 24 שעות, התבוננו בתאים מתחת למיקרוסקופ כדי לאשר את היווצרות גוף העובר. בעזרת פיפטה של 10 מיליליטר, אספו את גופי העובר לתוך צינור צנטריפוגלי של 15 מיליליטר והמתינו עד שגופי העובר ישקעו לתחתית במשך חמש דקות. לאחר מכן שאפו בזהירות את הסופרנאטנט והשעו מחדש את גופי העובר בשישה מיליליטר של מדיום טרי A. העבירו אותם לבאר הדבקה נמוכה חדשה של צלחת שש בארות ותרבית באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.

ביום הרביעי, מצפים צלחת של 10 ס"מ בשלושה מיליליטר של תמיסת ג'לטין דגים 0.1% ודגרים במשך שעה לפחות באינקובטור של 5% פחמן דו חמצני, 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן להסיר את תמיסת הג'לטין ולשטוף את הכלי פעם אחת עם חמישה עד שישה מיליליטר של 1X DPBS. אספו בזהירות את גופי העובר לתוך צינור צנטריפוגלי של 15 מיליליטר והמתינו עד שגופי העובר ישקעו לתחתית תוך חמש דקות.

בעדינות להשעות את גופי העובר עם 15 מיליליטר של בינוני B ולהעביר אותם צלחת 10 ס"מ מצופה. תרבית באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני למשך שבוע לאחר 49 ימים. צנטריפוגה את התאים ב 200 x גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

בזהירות לשאוף את supernatant ו resuspend את התאים עם שני מיליליטר של C.Transfer בינוני טרי לתוך באר הדבקה נמוכה חדשה של צלחת שש בארות. דוגרים על הצלחת באינקובטור של 5% פחמן דו חמצני, 37 מעלות צלזיוס. ביום 56, להחליף את המדיום בילה עם שני מיליליטר של C בינוני לכל באר.

בחנו את הצלחת תחת מיקרוסקופ כדי לזהות את תאי המיקרוגליה המסועפים נצמדים לתחתית באר ההדבקה הנמוכה. כדי לקצור מיקרוגליה לגידול משותף, החליפו בעדינות את ה-C המדיום בכל באר במיליליטר אקוטוטאז ודגרו בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות. באמצעות פיפטה של חמישה מיליליטר, אוספים את תאי המיקרוגליה לתוך צינור של 15 מיליליטר וצנטריפוגות את התאים במהירות של 200 x גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר השלכת supernatant, להשעות את microglia עם מיליליטר אחד של מדיום E.