Başlamak için, kök hücre ortamında %80 ila 90 hücre yoğunluğuna sahip insan embriyonik kök hücrelerini elde edinHarcanan ortamı çıkardıktan sonra, her bir kuyucuktaki hücreleri bir mililitre 1X DPBS ile durulayın. Her bir oyuktaki kök hücre kolonilerini bir mililitre 0.5 milimolar EDTA ile 37 santigrat derecede yaklaşık beş dakika inkübe edin. Kenarların gevşek boşluklarla hafifçe kıvrıldığını doğrulamak için koloni morfolojisini kontrol edin.
EDTA'yı aspire edin ve gerekirse hücreleri 37 santigrat derecede bir ila iki dakika daha inkübe edin, ancak sekiz dakikayı geçmeyin. Her bir oyuktaki hücreleri, altı mikrolitre 10 milimolar ROCK inhibitörü Y-27632 çözeltisi içeren altı mililitre ortam A ile nazikçe durulayın. Hücreleri durulamaya yardımcı olmak için tabağın altına hafifçe vurun.
24 saat sonra, embriyo gövdesi oluşumunu doğrulamak için hücreleri mikroskop altında gözlemleyin. 10 mililitrelik bir pipet kullanarak, embriyo cisimlerini 15 mililitrelik santrifüjlü bir tüpe toplayın ve embriyo cisimlerinin beş dakika boyunca dibe çökmesini bekleyin. Daha sonra süpernatanı dikkatlice aspire edin ve embriyo cisimlerini altı mililitre taze ortamda yeniden süspanse edin, A.Bunları altı oyuklu bir plakanın yeni bir düşük yapışma kuyusuna aktarın ve 37 derecelik bir inkübatörde kültürleyin.
Dördüncü günde, 10 santimetrelik bir tabağı üç mililitre% 0.1 balık jelatin çözeltisi ile kaplayın ve% 5 karbondioksit, 37 santigrat derece inkübatörde en az bir saat inkübe edin. Ardından jelatin çözeltisini çıkarın ve kabı bir kez beş ila altı mililitre 1X DPBS ile durulayın. Embriyo cisimlerini dikkatlice 15 mililitrelik santrifüjlü bir tüpe toplayın ve embriyo cisimlerinin beş dakika içinde dibe çökmesini bekleyin.
Embriyo cisimlerini 15 mililitre ortam B ile nazikçe yeniden süspanse edin ve bunları kaplanmış 10 santimetrelik kaba aktarın. 49 gün sonra bir hafta boyunca 37 santigrat derece,% 5 karbondioksit inkübatörde kültür. Hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
Süpernatanı dikkatlice aspire edin ve hücreleri iki mililitre taze ortam C ile yeniden süspanse edin. Altı oyuklu bir plakanın yeni bir düşük yapışma kuyusuna aktarın. Plakayı% 5 karbondioksit, 37 santigrat derece inkübatörde inkübe edin. 56. günde, harcanan ortamı kuyu başına iki mililitre ortam C ile değiştirin.
Düşük yapışma kuyusunun dibine yapışan dallı mikrogliayı belirlemek için plakayı mikroskop altında inceleyin. Birlikte kültürleme için mikroglia hasat etmek için, her bir oyuktaki orta C'yi nazikçe bir mililitre Accutase ile değiştirin ve üç dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Beş mililitrelik bir pipet kullanarak, mikroglia hücrelerini 15 mililitrelik bir tüpe toplayın ve hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
Süpernatanı attıktan sonra, mikrogliayı bir mililitre orta E ile askıya alın.
