حذف الجينات بوساطة CRISPR-Cas9 في الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات المزروعة في ظروف خالية من المغذيات

للبدء ، قم بزرع معلق الخلايا الجذعية الجنينية البشرية على صفيحة بئر P24 مطلية ب Matrigel مع 500 ميكرولتر من الوسائط. احتضن طوال الليل للسماح بارتباط الخلية. في اليوم التالي ، قم بإصابة الخلايا المرفقة بتعدد العدوى 10 ، إلى جانب ثمانية ميكروغرام لكل مليلتر من البوليبرين.

احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة ثماني ساعات. بعد الحضانة ، استبدل الوسائط بوسائط جديدة مكملة بستربتومايسين البنسلين ، ولكن بدون مثبط الصخور. عندما تصل الخلايا إلى 90٪ من التقاء ، استكمل الوسائط ب 0.8 ميكروغرام لكل مليلتر من بورومايسين لبدء عملية الاختيار.

بعد حوالي أربعة إلى ستة أيام ، قم بتقسيم الخلايا المستقرة بنسبة واحد إلى أربعة وقم بتوسيعها للحفظ بالتبريد ومزيد من التحليل. لإجراء اختيار خلية واحدة ، قم بإعداد معلق خلية يعادل 500 خلية في 10 ملليلتر من وسائط النمو الكاملة. قم بزرع 100 ميكرولتر من هذا التعليق في كل بئر من لوحة 96 بئر.

اترك الخلايا دون إزعاج في حاضنة لمدة ثلاثة أيام ، ثم راقبها لمزيد من النمو. ثم ضع علامة على الآبار التي تحتوي على نسخ مفردة. قم بتغيير الوسائط كل يومين واحتضانها حتى تصل المستعمرات إلى الحجم الكافي لمزيد من التوسع والحفظ بالتبريد والتحليل ، والذي يستغرق عادة أسبوعين.

للبدء ، احصل على خلايا جذعية جنينية بشرية متمايزة نحو مصير الأديم الظاهر العصبي. عندما تصل الخلايا إلى 90٪ من التقاء ، عالجها ب 200 نانومول من LDN193189 ، و 10 ميكرومول من SB431542 في وسائط استبدال المصل بالضربة القاضية بنسبة 100٪. بعد ال 24 ساعة الأولى ، احتضان الخلايا باثنين من الميكرومول من XAV939 لمدة يومين إضافيين.

بعد ثلاثة أيام ، قلل تدريجيا من الوسائط البديلة للمصل بالضربة القاضية على مدار ثمانية أيام من 75٪ إلى 50٪ ثم إلى 25٪ وأخيرا إلى 100٪ N2 الوسط. في اليوم 12 ، قم بإصلاح الخلايا للتلوين المناعي باستخدام Pax6 كعلامة للأديم الظاهر العصبي. لدراسات تحديد مصير الأديم المتوسط ، عالج 70٪ من خلايا التقاء بثلاثة ميكرومول من CHIR 99021 في وسائط الأديم الباطن النهائية لمدة 24 ساعة.

قم بإصلاح الخلايا بعد ذلك للتلوين المناعي باستخدام العضدية كعلامة خاصة بالأديم المتوسط. لدراسة مرحلة الأديم الباطن ، أضف وسائط الأديم الباطن النهائية بدون CHIR 99021 وقم بزراعة الخلايا لمدة 24 ساعة إضافية. بالنسبة لمقايسة تكوين الجسم الجنيني ، قم بزرع الخلايا على أسطح الخلايا منخفضة الارتباط مع حذف Matrigel لزراعتها في ظروف التعليق.

لم تظهر خطوط الخلايا بالضربة القاضية A1 و A5 و B4 أي تغيير في إمكانات تعدد القدرات على النحو الذي يحدده التلوين المناعي لعلامات OCT4 و NANOG و SOX2 مقارنة بخلايا التحكم. لم يظهر التلوين المناعي لعلامة تكاثر الخلايا ، KI67 ، أي تغيير في معدل تكاثر خطوط الخلايا بالضربة القاضية مقارنة بالسيطرة. لم يتأثر تكوين المستعمرة والجسم الجنيني في خطوط الخلايا بالضربة القاضية مقارنة بالسيطرة.

احتفظت خطوط الخلايا بالضربة القاضية A1 و A5 و B4 بالقدرة على التمايز إلى ثلاث خلايا طبقة جرثومية كما أكد من خلال التلوين المناعي لعلامات Pax6 و brachyuri و FOXA2 مع عدم وجود تغيير في إمكانات التمايز مقارنة بخلايا التحكم.