Delezione genica mediata da CRISPR-Cas9 in cellule staminali pluripotenti umane coltivate in condizioni prive di alimentatore

Per iniziare, seminare la sospensione di cellule staminali embrionali umane su una piastra a pozzetti P24 rivestita con Matrigel con 500 microlitri di terreno. Incubare durante la notte per consentire l'adesione delle cellule. Il giorno seguente, infettare le cellule attaccate a una molteplicità di infezione di 10, insieme a otto microgrammi per millilitro di polibrene.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per otto ore. Dopo l'incubazione, sostituire il terreno con un terreno fresco integrato con penicillina streptomicina, ma senza inibitore della roccia. Quando le cellule raggiungono il 90% di confluenza, integrare il terreno con 0,8 microgrammi per millilitro di puromicina per avviare il processo di selezione.

Dopo circa quattro-sei giorni, dividere le cellule stabili in un rapporto di uno a quattro ed espanderle per la crioconservazione e ulteriori analisi. Per eseguire la selezione di singole cellule, preparare una sospensione cellulare equivalente a 500 cellule in 10 millilitri di terreno di coltura completo. Seminare 100 microlitri di questa sospensione in ogni pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.

Lasciare le cellule indisturbate in un'incubatrice per tre giorni, quindi osservarle per un'ulteriore crescita. Quindi contrassegnare i pozzetti contenenti singoli cloni. Cambiare il terreno a giorni alterni e incubare fino a quando le colonie non raggiungono dimensioni sufficienti per un'ulteriore espansione, crioconservazione e analisi, che in genere richiede due settimane.

Per iniziare, ottenere cellule staminali embrionali umane differenziate verso il destino del neuroectoderma. Quando le cellule raggiungono il 90% di confluenza, trattarle con 200 nanomoli di LDN193189 e 10 micromoli di SB431542 in un terreno di sostituzione del siero knockout al 100%. Dopo le 24 ore iniziali, incubare le cellule con due micromoli di XAV939 per altri due giorni.

Dopo tre giorni, ridurre gradualmente la percentuale di terreni di sostituzione del siero knockout per un periodo di otto giorni dal 75% al 50%, quindi al 25% e infine al 100% di terreni N2. Il giorno 12, fissare le cellule per l'immunocolorazione utilizzando Pax6 come marcatore del neuroectoderma. Per gli studi sulla determinazione del destino del mesoderma, trattare le cellule di confluenza al 70% con tre micromoli di CHIR 99021 in terreno endodermico definitivo per 24 ore.

Fissare le cellule in seguito per l'immunocolorazione usando la brachiuria come marcatore specifico del mesoderma. Per studiare lo stadio endodermico, aggiungere un terreno endodermico definitivo senza CHIR 99021 e coltivare le cellule per altre 24 ore. Per il saggio di formazione del corpo embrioide, seminare le cellule su superfici cellulari a basso attaccamento omettendo Matrigel di coltivarle in condizioni di sospensione.

Le linee cellulari knockout A1, A5, B4 non hanno mostrato alcun cambiamento nel potenziale di pluripotenza come determinato dall'immunocolorazione per i marcatori OCT4, NANOG e SOX2 rispetto alle cellule di controllo. L'immunocolorazione per il marcatore di proliferazione cellulare, KI67, non ha mostrato alcun cambiamento nel tasso di proliferazione delle linee cellulari knockout rispetto al controllo. La formazione di colonie e corpi embrioidi non è stata influenzata nelle linee cellulari knockout rispetto al controllo.

Le linee cellulari knockout A1, A5, B4 hanno mantenuto la capacità di differenziarsi in tre cellule dello strato germinale, come confermato dall'immunocolorazione per i marcatori Pax6, brachyuri e FOXA2 senza alcun cambiamento nel potenziale di differenziazione rispetto alle cellule di controllo.