Başlamak için, insan embriyonik kök hücre süspansiyonunu 500 mikrolitre ortam içeren Matrigel kaplı bir P24 kuyu plakasına tohumlayın. Hücre bağlanmasına izin vermek için gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, bağlı hücreleri, mililitre polibren başına sekiz mikrogram ile birlikte 10'luk bir enfeksiyon çokluğunda enfekte edin.
Hücreleri sekiz saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, ortamı penisilin streptomisin ile desteklenmiş, ancak kaya inhibitörü olmayan taze ortamla değiştirin. Hücreler% 90 birleşmeye ulaştığında, seçim sürecini başlatmak için ortamı mililitre başına 0.8 mikrogram puromisin ile destekleyin.
Yaklaşık dört ila altı gün sonra, kararlı hücreleri bir ila dört oranında bölün ve kriyo koruma ve daha fazla analiz için genişletin. Tek hücre seçimini gerçekleştirmek için, 10 mililitre tam büyüme ortamında 500 hücreye eşdeğer bir hücre süspansiyonu hazırlayın. Bu süspansiyonun 100 mikrolitresini 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna tohumlayın.
Hücreleri üç gün boyunca bir inkübatörde rahatsız edilmeden bırakın, ardından daha fazla büyüme için onları gözlemleyin. Sonra tek klonlar içeren kuyuları işaretleyin. Besiyerini iki günde bir değiştirin ve koloniler tipik olarak iki hafta süren daha fazla genişleme, kriyo-koruma ve analiz için yeterli boyuta ulaşana kadar kuluçkaya yatırın.
Başlamak için, nöroektoderm kaderine göre farklılaşmış insan embriyonik kök hücrelerini elde edin. Hücreler% 90 birleşmeye ulaştığında, onlara% 100 nakavt serum replasman ortamında 200 nanomol LDN193189 ve 10 mikromol SB431542 ile muamele edin. İlk 24 saatten sonra, hücreleri iki gün daha iki mikromol XAV939 ile inkübe edin.
Üç gün sonra, sekiz günlük bir süre boyunca nakavt serum replasman ortamının yüzdesini kademeli olarak %75'ten %50'ye, ardından %25'e ve son olarak %100 N2 ortamına düşürün. 12. günde, nöroektoderm belirteci olarak Pax6 kullanarak hücreleri immün boyama için düzeltin. Mezoderm kader belirleme çalışmaları için,% 70 birleşme hücrelerini 24 saat boyunca kesin endoderm ortamında üç mikromol CHIR 99021 ile tedavi edin.
Hücreleri daha sonra mezoderm spesifik bir belirteç olarak brachyury kullanarak immün boyama için sabitleyin. Endodermal aşamayı incelemek için, CHIR 99021 içermeyen kesin endoderm ortamı ekleyin ve hücreleri 24 saat daha kültürleyin. Embriyoid vücut oluşumu tahlili için, hücreleri süspansiyon koşullarında kültürlemek için Matrigel'i atlayarak düşük bağlantılı hücre yüzeylerine tohumlayın.
Nakavt hücre hatları A1, A5, B4, kontrol hücrelerine kıyasla OCT4, NANOG ve SOX2 belirteçleri için immün boyama ile belirlenen pluripotens potansiyelinde hiçbir değişiklik göstermedi. Hücre proliferasyon belirteci KI67 için immün boyama, kontrole kıyasla nakavt hücre hatlarının proliferasyon hızında hiçbir değişiklik göstermedi. Koloni ve embriyoid cisim oluşumu, kontrole kıyasla nakavt hücre hatlarında etkilenmedi.
Nakavt hücre hatları A1, A5, B4, kontrol hücrelerine kıyasla farklılaşma potansiyelinde herhangi bir değişiklik olmaksızın Pax6, brakiyri ve FOXA2 belirteçleri için immün boyama ile doğrulandığı gibi üç germ tabakası hücresine farklılaşma yeteneğini korudu.
