Deleção gênica mediada por CRISPR-Cas9 em células-tronco pluripotentes humanas cultivadas em condições livres de alimentador

Para começar, semeie a suspensão de células-tronco embrionárias humanas em uma placa de poço P24 revestida com Matrigel com 500 microlitros de meio. Incube durante a noite para permitir a fixação das células. No dia seguinte, infecte as células anexadas a uma multiplicidade de infecção de 10, juntamente com oito microgramas por mililitro de polibreno.

Incube as células a 37 graus Celsius por oito horas. Após a incubação, substitua o meio por meio fresco suplementado com estreptomicina de penicilina, mas sem inibidor de rocha. Quando as células atingirem 90% de confluência, suplementar o meio com 0,8 microgramas por mililitro de puromicina para iniciar o processo de seleção.

Após cerca de quatro a seis dias, divida as células estáveis em uma proporção de um para quatro e expanda-as para criopreservação e análise posterior. Para realizar a seleção de célula única, prepare uma suspensão celular equivalente a 500 células em 10 mililitros de meio de crescimento completo. Semeie 100 microlitros desta suspensão em cada poço de uma placa de 96 poços.

Deixe as células intactas em uma incubadora por três dias e, em seguida, observe-as para maior crescimento. Em seguida, marque os poços que contêm clones únicos. Troque o meio a cada dois dias e incube até que as colônias atinjam tamanho suficiente para maior expansão, criopreservação e análise, o que normalmente leva duas semanas.

Para começar, obtenha células-tronco embrionárias humanas diferenciadas para o destino do neuroectoderma. Quando as células atingirem 90% de confluência, trate-as com 200 nanomoles de LDN193189 e 10 micromoles de SB431542 em meio de reposição de soro nocaute a 100%. Após as 24 horas iniciais, incube as células com dois micromoles de XAV939 por mais dois dias.

Após três dias, reduza gradualmente a porcentagem de meios de reposição de soro knockout durante um período de oito dias de 75% para 50%, depois para 25% e, finalmente, para 100% de N2. No dia 12, fixe as células para imunocoloração usando Pax6 como marcador de neuroectoderma. Para estudos de determinação do destino do mesoderma, trate 70% das células de confluência com três micromoles de CHIR 99021 em meio endodérmico definitivo por 24 horas.

Fixe as células posteriormente para imunocoloração usando braquiúria como marcador específico do mesoderma. Para estudar o estágio endodérmico, adicione meios endodérmicos definitivos sem CHIR 99021 e cultive as células por mais 24 horas. Para o ensaio de formação do corpo embrióide, semeie as células em superfícies celulares de baixa fixação, omitindo Matrigel para cultivá-las em condições de suspensão.

As linhagens celulares knockout A1, A5, B4 não mostraram alteração no potencial de pluripotência determinado pela imunomarcação para os marcadores OCT4, NANOG e SOX2 em comparação com as células controle. A imunomarcação para o marcador de proliferação celular, KI67, não mostrou alteração na taxa de proliferação de linhagens celulares knockout em comparação com o controle. A formação de colônias e corpos embrióides não foi afetada nas linhagens celulares knockout em comparação com o controle.

As linhagens celulares knockout A1, A5, B4 mantiveram a capacidade de se diferenciar em três células da camada germinativa, conforme confirmado pela imunocoloração para os marcadores Pax6, braquiuri e FOXA2, sem alteração no potencial de diferenciação em comparação com as células controle.