Zu Beginn säen Sie die Suspension der menschlichen embryonalen Stammzellen auf einer Matrigel-beschichteten P24-Well-Platte mit 500 Mikrolitern Medium. Über Nacht inkubieren, um die Zellanhaftung zu ermöglichen. Am nächsten Tag infizieren Sie die anhaftenden Zellen mit einer Infektionsvielfalt von 10, zusammen mit acht Mikrogramm pro Milliliter Polybrene.
Inkubieren Sie die Zellen acht Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation ist das Medium durch frisches Medium zu ersetzen, das mit Penicillin-Streptomycin, jedoch ohne Gesteinsinhibitor, ergänzt wurde. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 90 % erreichen, ergänzen Sie das Medium mit 0,8 Mikrogramm pro Milliliter Puromycin, um den Selektionsprozess zu starten.
Nach etwa vier bis sechs Tagen spalten Sie die stabilen Zellen im Verhältnis eins zu vier und expandieren sie für die Kryokonservierung und weitere Analyse. Um eine Einzelzellselektion durchzuführen, bereiten Sie eine Zellsuspension her, die 500 Zellen in 10 Millilitern vollständigem Wachstumsmedium entspricht. Säen Sie 100 Mikroliter dieser Suspension in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte.
Lassen Sie die Zellen drei Tage lang ungestört in einem Inkubator und beobachten Sie sie dann für das weitere Wachstum. Markieren Sie dann die Vertiefungen mit einzelnen Klonen. Wechseln Sie das Medium alle zwei Tage und inkubieren Sie, bis die Kolonien eine ausreichende Größe für die weitere Expansion, Kryokonservierung und Analyse erreicht haben, was in der Regel zwei Wochen dauert.
Zu Beginn erhalten Sie humane embryonale Stammzellen, die nach dem Schicksal des Neuroektoderms differenziert sind. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 90 % erreichen, behandeln Sie sie mit 200 Nanomol LDN193189 und 10 Mikromol SB431542 in 100 %-Knockout-Serumersatzmedien. Nach den ersten 24 Stunden inkubieren Sie die Zellen mit zwei Mikromol XAV939 für weitere zwei Tage.
Nach drei Tagen ist der Anteil der Knockout-Serumersatzmedien über einen Zeitraum von acht Tagen schrittweise von 75 % auf 50 %, dann auf 25 % und schließlich auf 100 % N2-Medien zu reduzieren. Fixieren Sie am 12. Tag die Zellen für die Immunfärbung mit Pax6 als Neuroektodermmarker. Behandeln Sie für Studien zur Bestimmung des Mesodermschicksals 70 % Konfluenzzellen mit drei Mikromol CHIR 99021 in definitiven Endodermmedien für 24 Stunden.
Fixieren Sie die Zellen anschließend für die Immunfärbung mit Brachyry als Mesoderm-spezifischem Marker. Um das endodermale Stadium zu untersuchen, fügen Sie definitive Endodermmedien ohne CHIR 99021 hinzu und kultivieren Sie die Zellen für weitere 24 Stunden. Für den Embryoidkörperbildungsassay säen Sie die Zellen auf Zelloberflächen mit geringer Bindung aus, wobei Matrigel weggelassen wird, um sie unter Suspensionsbedingungen zu kultivieren.
Die Knockout-Zelllinien A1, A5, B4 zeigten im Vergleich zu den Kontrollzellen keine Veränderung des Pluripotenzpotentials, das durch Immunfärbung für OCT4-, NANOG- und SOX2-Marker bestimmt wurde. Die Immunfärbung für den Zellproliferationsmarker KI67 zeigte keine Veränderung der Proliferationsrate von Knockout-Zelllinien im Vergleich zur Kontrolle. Die Kolonie- und Embryoidkörperbildung wurde in Knockout-Zelllinien im Vergleich zur Kontrolle nicht beeinflusst.
Die Knockout-Zelllinien A1, A5 und B4 behielten die Fähigkeit zur Differenzierung in drei Keimblattzellen bei, wie durch Immunfärbung für Pax6-, Brachyuri- und FOXA2-Marker bestätigt wurde, ohne dass sich das Differenzierungspotenzial im Vergleich zu den Kontrollzellen änderte.
