Délétion de gène médiée par CRISPR-Cas9 dans des cellules souches pluripotentes humaines cultivées dans des conditions sans nourrisseur

Pour commencer, ensemencez la suspension de cellules souches embryonnaires humaines sur une plaque à puits P24 recouverte de Matrigel avec 500 microlitres de milieu. Incuber pendant la nuit pour permettre la fixation des cellules. Le lendemain, infectez les cellules attachées à une multiplicité d’infection de 10, avec huit microgrammes par millilitre de polybrène.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant huit heures. Après l’incubation, remplacer le milieu par un milieu frais complété par de la pénicilline streptomycine, mais sans inhibiteur de roche. Lorsque les cellules atteignent 90 % de confluence, complétez le milieu avec 0,8 microgramme par millilitre de puromycine pour commencer le processus de sélection.

Après environ quatre à six jours, divisez les cellules stables dans un rapport de un à quatre et développez-les pour la cryoconservation et une analyse plus approfondie. Pour effectuer la sélection d’une seule cellule, préparez une suspension cellulaire équivalente à 500 cellules dans 10 millilitres de milieu de croissance complet. Semez 100 microlitres de cette suspension dans chaque puits d’une plaque de 96 puits.

Laissez les cellules intactes dans un incubateur pendant trois jours, puis observez-les pour une croissance ultérieure. Marquez ensuite les puits contenant des clones uniques. Changez le milieu tous les deux jours et incubez jusqu’à ce que les colonies atteignent une taille suffisante pour une expansion, une cryoconservation et une analyse ultérieures, ce qui prend généralement deux semaines.

Pour commencer, obtenez des cellules souches embryonnaires humaines différenciées vers le destin du neuroectoderme. Lorsque les cellules atteignent 90 % de confluence, traitez-les avec 200 nanomoles de LDN193189 et 10 micromoles de SB431542 dans un milieu de remplacement sérique à 100 %. Après les 24 premières heures, incubez les cellules avec deux micromoles de XAV939 pendant deux jours supplémentaires.

Après trois jours, réduisez progressivement le pourcentage de milieu de remplacement sérique knockout sur une période de huit jours de 75 % à 50 %, puis à 25 % et enfin à 100 % de milieu N2. Le 12e jour, fixez les cellules pour l’immunocoloration en utilisant Pax6 comme marqueur du neuroectoderme. Pour les études de détermination du devenir du mésoderme, traiter 70 % des cellules de confluence avec trois micromoles de CHIR 99021 dans un milieu endodermique définitif pendant 24 heures.

Fixez ensuite les cellules pour l’immunocoloration en utilisant la brachyurie comme marqueur spécifique du mésoderme. Pour étudier le stade endodermique, ajoutez un milieu endodermique définitif sans CHIR 99021 et cultivez les cellules pendant 24 heures supplémentaires. Pour l’essai de formation du corps embryoïde, ensemencez les cellules sur des surfaces cellulaires à faible fixation en omettant Matrigel pour les cultiver dans des conditions de suspension.

Les lignées cellulaires knock-out A1, A5, B4 n’ont montré aucun changement dans le potentiel de pluripotence tel que déterminé par immunocoloration pour les marqueurs OCT4, NANOG et SOX2 par rapport aux cellules témoins. L’immunocoloration du marqueur de prolifération cellulaire, KI67, n’a montré aucun changement dans le taux de prolifération des lignées cellulaires knock-out par rapport au contrôle. La formation de la colonie et du corps embryoïde n’a pas été affectée dans les lignées cellulaires knock-out par rapport au contrôle.

Les lignées cellulaires knock-out A1, A5, B4 ont conservé la capacité de se différencier en trois cellules de la couche germinale, comme le confirme l’immunocoloration pour les marqueurs Pax6, brachyuri et FOXA2, sans changement du potentiel de différenciation par rapport aux cellules témoins.