フィーダーフリー条件下で培養したヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-Cas9媒介遺伝子欠失

まず、ヒト胚性幹細胞懸濁液をマトリゲルでコーティングしたP24ウェルプレートに500マイクロリットルの培地を播種します。細胞が付着するまで一晩インキュベートします。翌日、付着した細胞に10の感染の多様性で感染し、ポリブレンのミリリットルあたり8マイクログラムを感染させます。

細胞を摂氏37度で8時間インキュベートします。インキュベーション後、培地をペニシリンストレプトマイシンを添加した新しい培地と交換しますが、岩石阻害剤は使用しないでください。細胞が90%の密度に達したら、培地に0.8マイクログラム/ミリリットルのピューロマイシンを補充して、選択プロセスを開始します。

約4〜6日後、安定細胞を1〜4の比率で分割し、凍結保存およびさらなる分析のためにそれらを増殖させます。シングルセル選択を行うには、10ミリリットルの全増殖培地に500細胞相当の細胞懸濁液を調製します。この懸濁液の100マイクロリットルを96ウェルプレートの各ウェルに播種します。

細胞をインキュベーターに3日間放置し、その後、さらなる成長のために観察します。次に、単一のクローンを含むウェルに印を付けます。1日おきに培地を交換し、コロニーがさらなる増殖、凍結保存、分析に十分なサイズに達するまでインキュベートします(通常2週間かかります)。

まず、神経外胚葉運命に向けて分化したヒト胚性幹細胞を入手します。細胞が90%のコンフルエント度に達したら、200ナノモルのLDN193189と10マイクロモルのSB431542を100%ノックアウト血清補充培地で処理します。最初の24時間後、2マイクロモルのXAV939で細胞をさらに2日間インキュベートします。

3日後、ノックアウト血清補充培地の割合を8日間にわたって75%から50%、次に25%、最後に100%N2培地に徐々に減らします。12日目に、Pax6を神経外胚葉マーカーとして使用して免疫染色のために細胞を固定します。中胚葉の運命決定研究では、70%コンフルエンス細胞を3マイクロモルのCHIR 99021で24時間治療します。

その後、中胚葉特異的マーカーとしてブラキュリーを使用して免疫染色のために細胞を固定します。内胚葉の病期を研究するには、CHIR 99021を含まない決定的な内胚葉培地を追加し、細胞をさらに24時間培養します。胚様体形成アッセイでは、マトリゲルを省略した低接着細胞表面に細胞を播種し、懸濁状態で培養します。

ノックアウト細胞株A1、A5、B4は、コントロール細胞と比較して、OCT4、NANOG、およびSOX2マーカーの免疫染色によって決定される多能性電位に変化を示さなかった。細胞増殖マーカーKI67の免疫染色では、対照と比較してノックアウト細胞株の増殖速度に変化は見られませんでした。コロニーおよび胚様体形成は、対照群と比較してノックアウト細胞株では影響を受けなかった。

ノックアウト細胞株A1、A5、B4は、Pax6、ブラキウリ、およびFOXA2マーカーの免疫染色により確認されたように、3つの生殖細胞層細胞に分化する能力を保持しており、対照細胞と比較して分化電位に変化はありませんでした。