CRISPR-Cas9 תיווך מחיקת גנים בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים שגודלו בתרבית בתנאים נטולי הזנה

כדי להתחיל, זרעו את תרחיף תאי הגזע העוברי האנושי על צלחת באר P24 מצופה מטריג'ל עם 500 מיקרוליטר של מדיה. יש לדגור למשך הלילה כדי לאפשר חיבור לתאים. למחרת, להדביק את התאים המחוברים בריבוי של זיהום של 10, יחד עם שמונה מיקרוגרם למיליליטר של פוליברן.

לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שמונה שעות. לאחר הדגירה, להחליף את המדיה עם מדיה טרייה בתוספת סטרפטומיצין פניצילין, אבל ללא מעכב סלעים. כאשר התאים מגיעים 90% confluency, להשלים את התקשורת עם 0.8 מיקרוגרם למיליליטר של puromycin כדי להתחיל את תהליך הבחירה.

לאחר כארבעה עד שישה ימים, פצלו את התאים היציבים ביחס של אחד עד ארבעה והרחיבו אותם לצורך שימור בהקפאה וניתוח נוסף. כדי לבצע בחירת תא בודד, הכינו תרחיף תאים שווה ערך ל-500 תאים ב-10 מיליליטר של מצע גידול שלם. זרעו 100 מיקרוליטר של תרחיף זה לתוך כל באר של צלחת 96 באר.

השאירו את התאים ללא הפרעה באינקובטור במשך שלושה ימים, ואז צפו בהם לצמיחה נוספת. לאחר מכן סמן את הבארות המכילות שיבוטים בודדים. החליפו את המדיה כל יומיים ודגרו עד שהמושבות יגיעו לגודל מספיק להרחבה נוספת, שימור הקפאה וניתוח, שבדרך כלל לוקח שבועיים.

כדי להתחיל, להשיג תאי גזע עובריים אנושיים ממוינים לקראת גורל neuroectoderm. כאשר התאים מגיעים למפגש של 90%, טפלו בהם עם 200 ננומול של LDN193189, ו-10 מיקרומול של SB431542 במדיית החלפת סרום נוקאאוט של 100%. לאחר 24 השעות הראשונות, לדגור על התאים עם שתי מיקרומול של XAV939 במשך יומיים נוספים.

לאחר שלושה ימים, הפחיתו בהדרגה את אחוז המדיה להחלפת סרום נוקאאוט במשך תקופה של שמונה ימים מ-75% ל-50%, לאחר מכן ל-25% ולבסוף, ל-100% מדיה N2. ביום ה-12, תקנו את התאים לצביעה חיסונית באמצעות Pax6 כסמן נוירואקטודרם. עבור מחקרים לקביעת גורל מזודרם, יש לטפל בתאי מפגש של 70% עם שלוש מיקרומול של CHIR 99021 במדיה אנדודרמת סופית למשך 24 שעות.

תקן את התאים לאחר מכן עבור immunostaining באמצעות brachyury כמו סמן ספציפי mesoderm. כדי לחקור את השלב האנדודרמלי, הוסף מדיה אנדודרם סופית ללא CHIR 99021 ותגדל את התאים בתרבית במשך 24 שעות נוספות. לבדיקת היווצרות הגוף העוברי, זרעו את התאים על משטחי תאים בעלי התקשרות נמוכה והשמיטו מטריג'ל לתרבית אותם בתנאי תרחיף.

קווי תאי הנוקאאוט A1, A5, B4 לא הראו שינוי בפוטנציאל הפלוריפוטנציה כפי שנקבע על ידי צביעה חיסונית עבור סמנים OCT4, NANOG ו- SOX2 בהשוואה לתאי הביקורת. בדיקה חיסונית של סמן התפשטות התא, KI67, לא הראתה שינוי בקצב ההתפשטות של שורות תאי נוקאאוט בהשוואה לקבוצת הביקורת. היווצרות המושבה והגוף העוברי לא הושפעו בשורות תאי נוקאאוט בהשוואה לקבוצת הביקורת.

קווי תאי נוקאאוט A1, A5, B4 שמרו על היכולת להתמיין לשלושה תאי שכבת נבט כפי שאושר על ידי צביעה חיסונית עבור סמנים Pax6, brachyuri ו- FOXA2 ללא שינוי בפוטנציאל ההתמיינות בהשוואה לתאי הביקורת.