投诉矩阵量化细胞收缩的准备工作

摘要

在这段视频中，我们展示了用于制造兼容，细胞外基质（ECM）适用于细胞培养镀膜基片的实验技术，适合牵引力显微镜观察细胞的行为流脑刚度的影响。

摘要

调节细胞粘附到细胞外基质（ECM）是细胞迁移和ECM重构是必要的。粘着斑大分子集会，情侣收缩的F -肌动蛋白细胞骨架的ECM。此连接可以穿过细胞膜，细胞内的机械力的传输底层基板。最近的工作表明ECM的力学性能调节粘着和F -肌动蛋白的形态以及众多的生理过程，包括细胞分化，分裂，增殖和迁移。因此，细胞培养基质的使用，已成为越来越普遍的方法，能够精​​确地控制和调节ECM的力学性能。

为了量化在粘着斑贴壁细胞的牵引力量，兼容基板结合高分辨率成像和计算技术中的一个方法被称为牵引力显微镜（TFM）。这种技术依赖于当地的基板变形诱发细胞收缩幅度和方向的测量。高分辨率荧光显微镜观察荧光标记的蛋白质相结合，这是可能的关联骨架组织和重塑与牵引力。

在这里，我们提出了一个详细的实验方案编制二维的兼容矩阵，为创造一个良好的特点，可调谐的机械刚度，这是适合测量细胞收缩的细胞培养基材的目的。这些协议包括聚丙烯酰胺凝胶的制备，ECM蛋白等凝胶涂料，电镀细胞凝胶，和高分辨率的共聚焦显微镜使用灌注室。此外，我们提供了一个代表性的样本数据表明使用列举的水杉协议的蜂窝力量的位置和震级。

研究方案

1。激活盖玻片表面

1. 盖玻片（＃1.5，22x40毫米）清洁使用在前面描述的协议（沃特曼斯托勒，1998年）的一系列肥皂和乙醇洗涤清洁和去除灰尘。
2. 放置在一个不锈钢架机架盖玻片，这样盖玻片间距不接触。
3. 在化学通风柜（丁腈手套和护目镜建议），终浓度为2％，在异丙醇稀释充满力量3 aminopropyltrimethoxysilane（2毫升硅烷/ 100毫升异丙醇），以填补一个正方形的玻璃盘（〜350毫升量）。由于塑料的反应，使用玻璃巴斯德吸管申请3 aminopropyltrimethoxysilane异丙醇。
4. 完全沉浸盖玻片从1.2到这10分钟的解决方案，同时轻轻搅拌在搅拌台通风柜。
5. 沉浸在DDH _{2 O（4}水交换）清洗盖玻片。允许浸泡10分钟，最终交换的时间，搅拌，。含氨基硅烷解决方案应作为危险废物处置。
6. 干盖玻片，在温暖的温度在孵化器（〜37 ° C）在无尘的环境中10分钟。
7. 冷却至室温。
8. 在通风柜中，浸泡在1％的戊二醛溶液在玻璃方_盘 2 DDH的盖玻片上搅拌30分钟盘。
9. 洗为10分钟，每交换3 DDH ₂ O的交流，并搅拌。戊二醛作为危险废物处置。
10. 在室温下干燥，用铝箔覆盖，以避免灰尘粘的盖玻片。
11. 储存在干燥的地方，远离灰尘，长达2个月。

2。制备聚丙烯酰胺（PAA）凝胶

1. 准备从40％的丙烯酰胺和双丙烯酰胺，2％以下表1丙烯酰胺/双丙烯酰胺组合的股票解决方案。我们坚持几个股票，不同刚度PAA凝胶优化的解决方案;在表1和表2中列出的例子。联合解决方案可以保持好几年了，只要他​​们在黑暗的瓶保持在4℃
2. 从库存解决方案，获得工作的解决方案，包含最终所需浓度的丙烯酰胺/双丙烯酰胺。例如，我们准备了7.5％acrylamide/0.10％双丙烯酰胺在DDH _{2 O的}工作解决方案，为2.8kPa PAA凝胶。
3. 德加在20分钟的真空室中的丙烯酰胺溶液，以减少氧气的解决方案，它可以防止临机聚合内。
4. 准备10％过硫酸铵（APS）解决方案（0.5g/5mL）。使用新的工作在3天之内股票。另外，股票被冻结要在以后的日期使用。
5. 尽管丙烯酰胺是脱气，雨- X的抹布擦拭一个1X3的“显微镜载玻片大力载玻片表面的疏水要除去多余的雨 - X，​​设置玻璃擦拭玻璃用湿布Kimwipe幻灯片。幻灯片一边，有盖。
6. 从真空室中取出丙烯酰胺溶液，添加荧光珠（量的1％，表1中列出的工作液5μL）。加入0.75μlTEMED和2.5μLAPS的10％，这将启动凝胶聚合。 〜5秒移液拌匀，以尽量减少引入的气泡，
7. 应用10-12μl丙烯酰胺溶液的疏水性显微镜幻灯片（在步骤2.4准备）和就地激活液滴顶部22x40mm盖玻片的。凝胶溶液应大衣整个盖玻片。平滑内解决可能出现的任何气泡。允许的凝胶溶液聚合在室温〜10分钟。
8. 聚合完成后，可以评估反相剩余工作的离心管中的解决方案。此外，聚合凝胶可拉离盖玻片边缘。宏观聚合后立即观察，独立的盖玻片从载玻片上。使用精尖的镊子或刀片边缘，小心地取出盖玻片，用凝胶附着，从显微镜玻片表面浸入凝胶和DDH _2，保持水化。

3。 PAA凝胶耦合细胞外基质（ECM）的蛋白质

三种不同的方法可用于附加的ECM蛋白的PAA凝胶的顶部表面（3.1和3.2），或含有凝胶体积（3.3）内的ECM蛋白。在这里，我们讨论PAA凝胶纤维连接蛋白的耦合，导致孵化后玻璃上的1小时10微克/毫升纤维连接蛋白溶液吸附量相当于一个表面配基密度。选择方法的注意事项有详细的讨论。

1. 交联对蛋白质的活性胺磺酸基SANPAH ECM蛋白PAA凝胶表面共价连接到PAA凝胶表面的异型交联剂氨基SANPAH
   1. 准备解散小号40μL氨基SANPAH工作等分 ulfo SANPAH粉在无水二甲基亚砜（DMSO）（20μL每毫克氨基SANPAH）。闪存冻结的股票在液氮储存于-80 ° C供以后使用。
   2. 取出凝胶表面使用盖玻片微调（<2秒）DDH _{2 O。}避免干燥的凝胶。
   3. DDH _{2 O（2mg/ml，pH}值7）使用前和大衣凝胶表面（约200μL）稀释磺酸基SANPAH二甲基亚砜等分。请注意，磺酸基SANPAH反应半衰期短（约5分钟）在室温下在水中，因此，这些措施应以迅猛的速度进行。
   4. 凝胶表面暴露在紫外线照射下，在紫外线的交联剂烤箱（8W，254 nm波长在2-3英寸1.5分钟的距离）。磺酸基SANPAH会改变颜色从橙色至褐色。
   5. 在一个烧杯用新鲜的DDH _{2 O}的DIP紫外线处理过的盖玻片和删除多余的水从凝胶表面使用盖玻片微调（<2秒） 。
   6. 移液器〜50μL上的封口膜冷1mg/ml的纤维连接蛋白（FN）（PBS，pH值7.4），在培养皿容器。反转盖玻片上的FN下降之上，凝胶方面暴露新生力量。
   7. 在室温下反应1-2小时或4℃过夜。
   8. 在6厘米的组织文化，包含PBS（pH 7.4）中菜放置盖玻片，足以覆盖盖玻片，在组织培养罩中的无菌条件下。
   9. 广泛与几个洗（3-5）的PBS液（pH 7.4），在无菌条件下清洗。
   10. 在组织培养罩中使用30分钟杀菌灯消毒盖玻片。
   11. 细胞介质中孵育30-45分钟前电镀细胞的盖玻片。
2. 交叉连接流脑水合肼碳水化合物对蛋白质组的临时机场管理局凝胶表面被氧化和耦合凝胶使用水合肼。
   1. 准备第2条所述的聚丙烯酰胺凝胶。
   2. PAA凝胶在塑料培养皿中，在通风柜和使用手套的盖玻片放置吸管上至少两个小时，每个PAA凝胶和孵化表面约1毫升未经稀释的水合肼，但最长不超过24小时
   3. 添加DDH _{2 O的}培养皿中;删除水合肼解决方案和处置危险废物。
   4. 培养皿中添加5％的醋酸浸泡盖玻片。封面和孵育1小时。
   5. 删除乙酸和洗DDH _{2 O}在DDH _{2 O的}孵育一小时。现在激活的盖玻片和交叉链接氧化纤维连接蛋白（FN）。
   6. 稀释10μL为1 mg / ml的FN溶液940μL的50 mM的醋酸钠缓冲液（pH值4.5）在一个黑暗的微离心管中，使终浓度为10微克/毫升。
   7. 50毫米醋酸钠缓冲液（pH值4.5），以1毫升加入80毫克的钠元碘酸20X元，高碘酸钠的股票。
   8. 3.2.6准备加入50μL20X钠元碘酸股票的FN解决方案，这样，最终工作浓度是10微克/毫升FN和4微克/毫升钠元碘酸。在室温下孵育30分钟，在黑暗中管。
   9. 3.2.5准备使用盖玻片微调（<2秒）的表面活化凝胶，删除多余_的DDH 2 O。避免干燥的凝胶。
   10. 吸取〜500μLFN到激活凝胶表面，在室温下1小时的孵化解决方案。
   11. 放置盖玻片的菜肴，含PBS液（pH 7.4），足以覆盖盖玻片。
   12. （3-5）的PBS（pH 7.4）中的几个洗洗净广泛。
   13. 在组织培养罩中使用30分钟杀菌灯消毒盖玻片。
   14. 细胞介质中孵育30-45分钟前电镀细胞的盖玻片。
3. ECM PAA凝胶蛋白丙烯- X的散装琥珀酰亚胺酯共轭，该协议是前2.5。对蛋白质的活性胺耦合与NHS酯化学丙烯酰胺单体，然后聚合成批量的PAA凝胶。
   1. 共轭ECM蛋白的丙烯- X的每制造商的说明选择。共轭蛋白联合解决方案应保存在4 ° C。
   2. 凝胶制造（如10％盖玻片UL）所需的临时机场管理局的工作解决方案的计算量。
   3. 减水从表1中的工作液配方上市量50μL（例如10％的体积），并引发聚合。
   4. 删除3.3.2计算的体积和10％的体积增加ECM​​ /丙烯- X的解决方案。 （如1μLECM /丙烯 - X 9μL的PAA溶液）。这一步应该是执行迅速，凝胶聚合。
   5. 如前所述，2.6和2.7的完整步骤。
   6. 广泛与几个洗（3-5）的PBS液（pH 7.4），在无菌条件下清洗。
   7. 在组织培养罩中使用30分钟杀菌灯消毒盖玻片。
   8. 细胞介质中孵育30-45分钟前电镀细胞的盖玻片。

乐“> 4。载入盖玻片到共焦成像室

这些步骤进行后，细胞已被允许传播ECM涂层凝胶基片（约6-12小时）。要组装的共焦成像室（RC - 30WA），它是有用的咨询指导华纳仪器网站。

1. 温暖的细胞介质和0.5％或0.25％胰蛋白酶和成5毫升或10ml注射器的负载。
2. 加载到华纳仪器共​​焦成像室（RC - 30WA）持有热门盖玻片22x30mm盖玻片，用真空油脂，以保持在盖玻片。
3. 将一腔形成盖玻片上的橡胶垫片，允许访问入口和出口聚乙烯管材。这将使顶部盖玻片和凝胶涂层22x40mm盖玻片，垫片的大小而定150-1000微米之间的间距。
4. 负载入口管注射器上，通过连接器套件，并检查，媒体流通过油管和到顶部盖玻片，无气泡，流线明显。
5. 应用到基地的商会和负载凝胶涂22x40mm盖玻片，细胞面朝上的真空油脂。温暖媒体应用细胞。
6. 放置到腔基地顶部盖玻片持有人，商会垫片分离的凝胶涂层的盖玻片。确保坐在内室基地的定位销定位孔在顶端盖玻片。
7. 应用压型钢板室基地，并使用螺丝和安全的压型钢板压型钢板扳手。
8. 检查通过油管和商会的流媒体监控室中的任何潜在的泄漏和消除细胞表面上的的任何媒体自由贸易区。注：用一个小针头注入画一个轻微的真空，同时与媒体，可以帮助消除媒体自由区。
9. 应用共焦成像室内成像显微镜持有人的舞台适配器。
10. 图片荧光标记蛋白和共聚焦荧光显微镜凝胶基材内嵌入的荧光珠。
11. 要获得的凝胶内无应变珠职位的形象，灌注胰蛋白酶从凝胶中分离的细胞粘连，和采取的，在相同的成像领域，坚持细胞的荧光珠的形象。比较紧张，无应变珠立场允许下收缩凝胶基材位移量化。

代表性的成果：

上述协议描述为准备符合PAA凝胶研究细胞收缩的实验过程，如图1所示。与本协议获得的凝胶表面相对平整，光滑，嵌入式均匀的荧光珠（图2A）。

如果在粘着斑的位置，细胞成像（图3A）和凝胶表面（图3B）测量凝胶收缩应该做的共焦光学平面粘着斑。凝胶的收缩，可在凝胶表面的可视化，当细胞贴壁（紧张）与分离（非应变）嵌入式荧光灯珠的位移（图3B）。计算算法的使用，可以产生与凝胶珠的位移和相应的弹性模量（图3C和3D）（Sabass等，2008 ）的牵引强调。如果成像发生在凝胶深，然后将珠的位移较小，不粘着斑产生的牵引力量的代表。

图1实验装置示意图。此过程的总体目标是创建兼容的矩阵为研究细胞收缩的目的。实验过程的第一步是激活amino-silane/glutaraldehyde治疗为目的的锚固聚合凝胶的盖玻片。第二步是聚合聚丙烯酰胺凝胶，含有荧光珠，到激活盖玻片。第三步涉及的化学交叉连接胞外配体的聚丙烯酰胺凝胶表面，使用第3步中列出的三个耦合技术之一。细胞，然后镀上凝胶，坚持和传播。根据活跃的细胞收缩，嵌入在凝胶珠取代。

图2。PAA凝胶的顶部表面的光学共焦片，可视化（A）内凝胶荧光的40nm嵌入式珠和纤维连接蛋白（B）免疫。

图3。牵引力实验代表性的结果。 （A）在人成骨肉瘤U2OS细胞的粘着斑是Marked GFP - Paxillin的嵌入在PAA底层紧张（绿色）和非应变（红色）的重点粘连凝胶的荧光珠（二）岗位。箭头指示珠位移的例子。 （三）牵引应力向量和（四）相应的热规模牵引地图强调来自凝胶收缩，采用计算算法（Sabass 等 ，2008）。比例尺= 5微米。

表1：

范例股票和工作的临机解决方案（表1中的数据是首次获得杨等人。，并独立在我们的实验室证实。）

股票临时机场管理局的解决方案
剪切模量（PA）的PAA凝胶	230	2833	8640	16344
40％丙烯酰胺（毫升）	1.25	3.12	2.34	2.50
2％双丙烯酰胺（毫升）	0.50	0.83	1.88	0.60
水（毫升）	3.25	1.04	0.78	1。 90
总体积（ml）：	5	5	5	5

工作临机解决方案
联合解决方案中使用（PA）	230	2833	8640	16344
股票溶液的体积（微升）	150	150	200	300
水（微升）	341.75	341.75	291.75	191.75
珠（微升）	5	5	5	5
TEMED（微升）	0.75	0.75	0.75	0.75
10％的APS（微升）	2.5	2.5	2.5	2.5
总体积（μL）：	500	500	500	500
最后丙烯酰胺％	3	7.5	7.5	12
最终双丙烯酰胺％	0.06	0.1	0.3	0.15

表2：

剪切模量的PAA基板的各种最终丙烯酰胺和双丙烯酰胺的百分比

12％丙烯酰胺			7.5％丙烯酰胺
％双丙烯酰胺	剪切模量（PA）		％双丙烯酰胺	剪切模量（PA）
0.145	16344		0.01	689
0.28	30067		0.03	1535
0.45	34263		0.05	2286
0.55	42375		0.075	2833
0.575	50873		0.1	4069
0.6	55293		0.2	5356
			0.3	8640
5％丙烯酰胺			3％丙烯酰胺
％双丙烯酰胺	剪切模量（PA）		％双丙烯酰胺	剪切模量（PA）
0.05	430		0.02	1.3
0.075	600		0.04	54
0.1	1431

讨论

这里描述的步骤设置牵引力显微镜（TFM）实验，计算跟踪程序的实施等，2008）（Sabass，可量化与微米级的空间分辨率的细胞力量。为了优化实验方案，关键是形成一个纯粹的和统一的凝胶基板与ECM的配体的镀层均匀。我们将讨论下面潜在的隐患：

非均匀的凝胶表面或眼泪：

在我们的经验，有几个步骤，似乎形成了一个漂亮的制服凝胶的关键。如果?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-aminopropyltrimethyoxysilane	Aldrich	28, 177-8
40% Acrylamide	Bio-Rad	161-0140
2% Bis-acrylamide	Fisher Scientific	BP1404
TEMED	Fisher Scientific	BP 150-20
Ammonium persulfate	Fisher Scientific	BP179
40nm fluorescent micro-spheres	Invitrogen	F8789
Sulfo-SANPAH	Pierce, Thermo Scientific	22589
Confocal imaging chamber (RC-30)	Warner Instruments	64-0320
Coverslip spinner	Home made	NA
Ultraviolet lamp CL1000	UVP Inc.	95-0228-01
Stainless steel rack	Electron Microscopy Sciences	72239-04
acryloyl-X, SE (6-((acryloyl)amino)hexanoic acid)	Invitrogen	A-20770
Hydrazine hydrate	Sigma-Aldrich	225819
Sodium meta-periodate	Thermo Fisher Scientific, Inc.	20504
Isopropanol	Fisher Scientific	A416-4
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F2006
Collagen	BD Biosciences	354236
Coverslips (#1.5)	Corning	2940‐224
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16120
Rain-X	SOPUS Products	www.rainx.com
Acetic Acid	Acros Organics	64-19-7