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神经网络发展的自发活动可以使用AM酯钙敏感的指标染料形式。神经元的激活,细胞内钙的变化,说明被检测为指标荧光瞬态变化与一个或两个光子成像。此协议可适应的发展依赖的神经元网络的范围在体外。
一个标志图案在发育中的神经系统的活动是自发的,同步的网络活动。同步活动已被观察到完整的脊髓,脑干,视网膜,大脑皮层和分离神经元文化的准备工作。在自发活动期间,神经元去极化火单或阵阵动作电位,激活许多离子通道。去极化激活电压门控钙通道介导钙离子内流的树突和棘。高度同步的电活动已经从本地使用领域电极的神经网络测量。这项技术使高的时间采样率,但空间分辨率较低,由于集成读出多个神经元,在一个电极。单细胞神经元活动的决议是可能的使用来衡量发射活动的单个神经元膜片钳电。然而,从网络的能力来衡量的神经细胞修补小号数量是有限的imultaneously,通常只有一个或两个神经元。钙依赖的荧光指示剂染料的使用,使测量同步整个网络的细胞的活性。这种技术提供了两个高空间分辨率和足够的时间取样,记录网络发展的自发活动。
前和产后早期发展过程中新形成的皮层和海马网络的一个主要特点是自发的,同步的神经元活动(卡茨和Shatz,1996年; Khaziphov与卢曼,2006年)。此相关的网络活动,被认为是神经系统发育的功能电路(斯皮策,2006年)代必要。在灵长类动物和啮齿动物脑,早期的电气和钙网络波观察前和出生后在体内和体外(Adelsberger等,2005; Garaschuk等,2000;。Lamblin等,1999)。这些早期的活动模式,这是众所周知的几个控制包括神经细胞的分化,突触和可塑性(Rakic及小室,1995年;斯皮策等人,2004年)的发展进程,为正确的发展和成熟的皮质电路至关重要。
我们在此朱庇特的视频,展示形象的自发活动,在发展皮质网络使用的方法。钙敏感的指标,如FURA 2 - AM穿过细胞膜酯弥漫在细胞内酯酶活性切割上午离开指示剂细胞impermeant形式的酯类。指标impermeant形式能够检测和绑定细胞内钙离子的羧酸基团..钙敏感染料的荧光钙结合后,瞬时改变。单或者多光子成像技术是用来衡量在染料发出的光子的变化,从而表明在细胞内钙的改变。此外,这些钙- Dependent指标可与其他荧光标记相结合,调查活动的网络内的细胞类型。
1。制作水平嗅海马脑片
嗅,海马脑片用解剖指南,详细的3D概述了该地区根据粤语,Wouterlood惠(2008)神经可塑性编号381243 9。
片解决方案(单位:mm) - 10 | |
110 | 氯化胆碱 |
25 | 碳酸氢钠3 |
11.6 | 11.6 |
10 | D -葡萄糖 |
7 | MgCl 2的 |
3.1 | sodiumpyruvate |
2.5 | 氯化钾 |
1.25 | 的NaH 2 PO 4 |
0.5 | 氯化钙 |
表1。食谱片解决方案。
学联(在MM) | |
125 | 氯化钠 |
26 | 碳酸氢钠3 |
10 | D -葡萄糖 |
3 | 氯化钾 |
2.5/1.5 | MgCl 2的 (复苏/实验) |
1.6 | 氯化钙 |
1.25 | 的NaH 2 PO 4 |
表2。食谱的恢复(R -学联)和实验(E -学联)解决方案。
2。制备染色CH琥珀
负载与钙依赖的指标或细胞特异性标记的细胞,切片需要被转移到染色过程室。虽然可能会商会,可以很容易地从标准实验室设备组装非常低的成本。这种分庭的主要特点是片预热30至35℃,在不断含氧介质和光屏蔽室培养。
方法图1。截面染色切片孵化室(以上)和钙敏感指标( 下文绿色染料,吸管)的应用。
3。染色切片
纵观任何涉及荧光染料的处理,避免由小光漂白和保持染料和THE染色组织处理之间的暗。
年龄(出生后) | 孵化时间(分钟) |
20 | |
P8 - P9 | 25 |
P10 - P11 | 30 |
P12 - 13 | 35 |
> P13 | 40 |
表3为不同年龄段的孵化时间,凭经验决定在实验室中。
4。其他染料和旧组织
也许由于在脑组织的髓鞘增加,从年纪较大的啮齿动物的切片不占用FURA 2 - AM酯,容易。为了方便的一个步骤,使用聚氧乙烯蓖麻油EL(Sigma公司)预孵育小鼠大脑使用P13和旧 11染料的吸收。聚氧乙烯蓖麻油是一种非离子表面活性剂,在许多制药辅料人的应用。如果没有这一步,我们发现,细胞特异性标记极差,整个皮质切片不一致。
钙染料负载在片制备的神经元和非神经元。为了识别和区分这些类型的细胞内的网络,可以使用sulforhodamine 101(SR101)标签星形胶质细胞内片。
切片染色sulforhodamine 101
前(第3)按照步骤1-3。
取1μL10MM sulforhodamine(Sigma公司),其储存在-20 ° C原液,并溶解在999μLR -学联10微米的解决方案。移液器的紫色染料OVER片前(步骤5-7),离开片15分钟内孵化。
小胶质细胞和血管内皮细胞标记使用FITC标记的番茄凝集素染料
像以前那样按照步骤1-3。
取25μL2mg/ml番茄(西红柿)凝集素FITC标记共轭(L0401,Sigma公司)的股票进入2.5毫升R -学联的解决方案,给予20微克/毫升的浓度。移液器前(步骤5-7)片染料,离开片45分钟内孵化。
注意,它是不可能像FURA 2 - AM或俄勒冈州绿色BAPTA - 1(OGB - 1)的频谱范围自两种染料的光子绿色荧光将发出钙敏感的指标结合起来,这种染料在重叠的波长。不过,也有其他的钙指标,如钙橙,FURA红染料,可以使用适当的过滤器或得克萨斯州红凝集素结合物相结合,结合机智h钙指示剂染料在绿色光谱。
5。将切片录音室
在成像片需要在显微镜下的稳定。一般金属竖琴放在按住组织,但它可以不均,扭曲片表面,使集中在成像领域的唯一部分。为了避免这种情况,切片坚持使用聚乙烯亚胺(PEI)的录音室。
裴解决方案 | |
1毫升 | 保利(ethyleneimine)解决方案 |
250ml中硼酸缓冲 | |
40MM | 硼酸 |
10MM | 硼砂十水钠 |
表4。食谱裴解决方案。
6。进出口老龄化
钙依赖的指标染料可以使用任何一个或双光子显微镜成像。使用双光子成像激活在感兴趣的区域中心量的指示剂,从而减少了在组织中的光散射量。此外,它能够更好地成片的深度渗透。
功能钙成像,我们用一个钛蓝宝石激光相干耦合Olympus显微镜20倍的目标(NA 0.95)和LaVision生物技术Trimscope系统提供。 Trimscope系统使帧同时扫描64 beamlets加上一个滨松C9100 EM - CCD相机进行快速的帧扫描速率。
7。代表性的成果
钙指标成功加载,FURA 2 - AM如图1所示,在使用多光子成像发展的新皮层和内嗅皮质网络。有些染料仍是目前的背景下,在组织,但细胞SOMA在某些情况下染色,近端树突清晰可见,周围神经纤维分离。如果加载没有成功,很少细胞特异性染色观察和染料点小群死膜碎片片表面上经常可见。
在这些截图中,细胞网络是在单一平面的同时细胞成像的重点清晰可见。使用一个金属片录音室的竖琴或不完整的坚持可能会导致不均匀的片表面进行成像。
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图1。 FURA 2 - AM酯加载开发新皮层(左)和嗅(乙右)网络。比例尺100微米。
为星形胶质细胞分开的神经元,与FURA sulforhodamine 101联合应用2 - AM酯使网络内的细胞类型的分离。
图2。星形胶质细胞的标签sulforhodamine 101。 FURA 2 - AM酯和sulforhodamine 101 共同的标签。激发波长:820nm。图像分色镜560/70nm波长分离的光电倍增管的集合,B代表从一个神经元(以上)和星形胶质细胞(下同)的荧光痕迹。比例尺60秒,ΔF10(AU荧光)。
图3。 FITC标记的番茄(番茄)凝集素染色小胶质细胞和血管内皮细胞的小鼠海马(A)和肤浅的嗅皮层(二)在发展中的标签。
钙染料是用来读出多个细胞的活动同时在发展中国家皮层和海马的网络。
图4。在海马和皮层网络的动态钙瞬变 。
电影1:FURA 2 - AM酯小鼠嗅皮层加载在第二次产后一周。
点击这里观看电影1。
电影2:FURA 2,在产后第一周上午酯小鼠海马加载。
点击这里观看电影2。
电影3:荧光4加载在产后第一周,小鼠皮层。
50movie3.avi">点击这里观看电影3。
FURA的情况下2 - AM酯,细胞活化涉及的钙去极化诱导的涌入,降低染料的荧光。如荧光染料,相反的是真实的,观察细胞去极化光子排放量的增加。体钙瞬变主要是测量,但较大的近端树突的活动也可以看出一些准备工作,如电影2所示。
读出网络活动可以量化使用商业或内部软件脚本。在我们的实验室,细胞识别和网络活动,是在一个半自动化的方式使用MATLAB(Mathworks公司)内部代码测量和分析。
图5。一个神经元的三维表示(代表分析,从一个发展中的皮层网络同步的钙瞬变。 )用于自动创建一个(二)从Z - Stack的神经元为神经元的自动化检测的面具。测量钙瞬变幅度,频率可以读取从单一的神经元数据(三)活跃的细胞和#。可以可视化使用栅格图(四)不同的痕迹同步。
在这里我们展示的方法显示合适的钙成像网络的动态识别细胞内鼠标,并在大鼠脑皮层和海马网络协议。这些方法提供了最佳的空间分辨率,同时可视化测量阈上活动的细胞胞体的本地网络。网络活动的时间分辨率可以是多种多样的,这取决于帧采集CCD相机设置,优化信号:持续时间长阈上通常在神经系统发育中的事件,噪声测量。这些协议不仅限于海马和皮质的网络,而且在整个神经系统发育的标签细胞。这种方法的限制是可以记录,只有阈上活动。
LaVision生物技术公司(德国Bielefeld)主办的这个手稿文章提交费。
在实验室的工作是由Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek(NWO)(917.10.372)RMM的支持。 JD是隶属于欧盟第七框架计划BrainTrain方案( www.brain train.nl )。我们感谢彼得劳伦斯Baljon和萨宾施密茨(包括CNCR,阿姆斯特丹VU大学)FP多电极阵列波形和视频序列中使用的神经元文化的图像。
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