Method Article
פעילות ספונטנית של פיתוח רשתות נוירונים ניתן למדוד באמצעות AM-אסתר צורות של סידן רגיש צבעים אינדיקטור. שינויים סידן תוך תאי, המציין ההפעלה העצבית, מזוהים כמו שינויים חולפות הקרינה אינדיקטור עם אחד או שני פוטונים הדמיה. פרוטוקול זה יכול להיות מותאמים עבור מגוון של רשתות נוירונים התפתחותית תלויי במבחנה.
דפוס סימן ההיכר של פעילות בפיתוח מערכות העצבים היא פעילות ספונטנית, רשת מסונכרן. פעילות מסונכרן נצפתה פגע בחוט השדרה, המוח קליפת המוח, הרשתית ניתק ההכנות תרבות עצביים. בתקופות של פעילות ספונטנית, הנוירונים depolarize לפטר אחד או התפרצויות של הפוטנציאלים לפעולה, הפעלת תעלות יונים רבות. שלילת קוטביות מפעיל מתח מגודרת ערוצי סידן על דנדריטים קוצים לתווך זרימת סידן. הפעילות החשמלית מסונכרן מאוד כבר נמדד מרשתות נוירונים המקומית באמצעות אלקטרודות השדה. טכניקה זו מאפשרת דגימה גבוה שיעורי הזמני אך ברזולוציה מרחבית נמוכה עקב משולב לקריאה מתוך נוירונים מרובים בו אלקטרודה אחת. ברזולוציה של תא יחיד הפעילות העצבית אפשרי באמצעות תיקון-clamp electrophysiology על נוירונים בודדים כדי למדוד פעילות ירי. עם זאת, היכולת למדוד מרשת מוגבל במספר הנוירונים תוקנו simultaneously, ובדרך כלל הוא רק אחד או שניים נוירונים. השימוש סידן תלויי צבעי ניאון אינדיקטור אפשרה מדידה של פעילות מסונכרנת ברשת של תאים. טכניקה זו מאפשרת הן ברזולוציה מרחבית גבוהה הדגימה הזמני מספיק כדי לתעד פעילות ספונטנית של הרשת המתפתחת.
תכונה מרכזית של החדש יוצרי רשתות הקורטיקליים בהיפוקמפוס במהלך התפתחות טרום לידה מוקדמת ספונטנית, מסונכרן הפעילות העצבית (כץ & שץ, 1996; Khaziphov & Luhmann, 2006). פעילות זו רשת בקורלציה הוא האמין להיות חיונית עבור הדור של מעגלים תפקודית במערכת העצבים המתפתח (שפיצר, 2006). ב הפרימטים וגם המוח מכרסם, חשמל מוקדם רשת גלי סידן הם נצפו מראש ו לאחר הלידה in vivo ו in vitro (Adelsberger et al, 2005;. Garaschuk et al, 2000;.. Lamblin et al, 1999). אלה דפוסי הפעילות המוקדמות, אשר ידועים לשלוט בכמהתהליכים התפתחותיים כולל synaptogenesis העצבית בידול, ואת הפלסטיות (Rakic & Komuro, 1995;. שפיצר et al, 2004) הם בעלי חשיבות קריטית לפיתוח התבגרות נכונה של המעגלים קליפת המוח.
בסרטון זה יופיטר, אנו מדגימים את שיטות לפעילות תמונה ספונטנית בפיתוח רשתות קליפת המוח. סידן רגיש אינדיקטורים, כגון Fura 2-AM אסתר מפוזר על פני קרום התא שבו פעילות esterase תאיים cleaves AM אסטרים לעזוב את צורת התא impermeant של צבע אינדיקטור. צורת impermeant של אינדיקטור יש קבוצות חומצה carboxylic אשר מסוגלים לזהות אז לאגד יוני סידן intracellularly .. הקרינה של סידן צבען רגיש משתנה transiently על כבילת סידן. שיטות הדמיה יחיד או רב פוטון משמשים למדידת השינוי הפוטונים הנפלטים להיות צבע, ובכך להצביע על שינוי בסידן תאיים. יתר על כן, אלה סידן-dהאינדיקטורים ependent יכול להיות משולב עם סמנים ניאון אחרים לחקור סוגי תאים בתוך רשת פעיל.
1. ביצוע אופקי entorhinal-בהיפוקמפוס פרוסות המוח
Entorhinal-בהיפוקמפוס פרוסות המוח נעשים באמצעות מדריכי אנטומי, מפורט סקירה 3D של האזור על פי קנטו, Wouterlood & לקשקש (2008) מזהה פלסטיות עצבית 381,243 9.
פורסים את פתרון (מ"מ) - 10 | |
110 | כולין כלוריד |
25 | NaHCO 3 |
11.6 | 11.6 |
10 | D-גלוקוז |
7 | MgCl 2 |
3.1 | sodiumpyruvate |
2.5 | KCl |
1.25 | לאא 2 PO 4 |
0.5 | CaCl 2 |
טבלה 1. מתכון לפתרון פרוסה.
ACSF (מ"מ) | |
125 | NaCl |
26 | NaHCO 3 |
10 | D-גלוקוז |
3 | KCl |
2.5/1.5 | MgCl 2 (התאוששות / ניסוי) |
1.6 | CaCl 2 |
1.25 | לאא 2 PO 4 |
טבלה 2. מתכון התאוששות הן (r-ACSF) ו ניסיוני (e-ACSF) פתרון.
2. הכנת פרק מכתיםענבר
כדי לטעון את התאים עם מחוון סידן תלויי או תאים ספציפיים סמן, פרוסות צריכים להיות מועברים לחדר עבור ההליך מכתים. למרות לתאי מסחריים יהיו זמינים, ניתן בקלות להרכיב מ ציוד מעבדה סטנדרטי עבור עלות קטנה מאוד. התכונות העיקריות של חדר כאלה כי הם חיממו את הפרוסות על בין 30 ל 35 מעלות צלזיוס, מודגרות בתווך מחומצן ברציפות וכי קאמרית הוא מוגן מפני אור.
מתודולוגיה באיור 1. חתך של החדר מכתים מראה הדגירה פרוסה (לעיל) יישום מחוון סידן רגיש (pipetted צבע ירוק, להלן).
3. הכתמה של פרוסות
לאורך כל הטיפול הכרוך צבעי ניאון, להימנע photobleaching ידי עבודה עם אור קטן ולשמור על צבע ו-tהוא מוכתם רקמות בחושך בין טיפול.
גיל (ימים לאחר הלידה) | זמן הדגירה (דקות) |
20 | |
p8-P9 | 25 |
P10-p11 | 30 |
P12-13 | 35 |
> P13 | 40 |
לוח 3. פעמים דגירה לגילאים שונים, באופן אמפירי שנקבע במעבדה.
4. צבעים אחרים רקמות מבוגרים
אולי בגלל myelination גדל רקמת המוח, פרוסות של מכרסמים מבוגרים אינם תופסים Fura 2-AM אסתר בקלות. כדי להקל על קליטת הצבע הזה צעד preincubation באמצעות Cremophor EL (Sigma) משמש במוחם של עכברים ב P13 ומעלה 11. Cremophor הוא שטח בלתי יוניים משמש excipient ב pharmaceutic רביםאל יישומים. ללא צעד זה, אנו מוצאים כי תא ספציפי תיוג הוא עני מאוד עקביים לאורך הפרוסה קליפת המוח.
צבעים סידן לטעון הן נוירונים שאינם נוירונים בהכנת פרוסה. כדי לזהות ולהבחין בין סוגי תאים בתוך הרשת, sulforhodamine 101 (SR101) ניתן להשתמש כדי האסטרוציטים התווית בתוך הפרוסה.
הכתמה של פרוסות עבור sulforhodamine 101
בצע את השלבים 1-3 כמו קודם (סעיף 3).
קח 1 μl של פתרון של המניה 10mm sulforhodamine (Sigma) מ האחסון שלה ב -20 מעלות צלזיוס, נמסים 999 μl r-ACSF לתת פתרון 10 מיקרומטר. פיפטה הסגול צבע ovאה את פרוסות כמו קודם (שלבים 5-7), עוזב את פרוסות דוגרים במשך 15 דקות.
Microglia ותאי האנדותל מסומנים באמצעות צבע FITC לקטינים עגבניות
בצע את השלבים 1-3 כמו קודם.
קח 25 μl של 2mg/ml Lycopersicon esculentum (עגבניות) לקטינים FITC המצומד (L0401, Sigma) פתרון המניות לתוך 2.5ml r-ACSF לתת 20 מיקרוגרם / מ"ל ריכוז. פיפטה לצבוע מעל את פרוסות כמו קודם (שלבים 5-7), עוזב את פרוסות דוגרים במשך 45 דקות.
שים לב, לא ניתן לשלב זה עם מחוון סידן צבען רגיש כמו Fura 2-AM או אורגון גרין BAPTA-1 (OGB-1) כי לזרוח בטווח ירוק של הספקטרום מאז פוטונים מקרינת צבעים הן יהיו הנפלטים באורכי גל חופפים. עם זאת, ישנם אחרים סידן אינדיקטור צבעים כגון סידן כתום, אדום Fura כי ניתן להשתמש בשילוב עם מסננים מתאימים או טקסס האדום conjugates לקטינים לשלב שנינותh סידן אינדיקטור צבעים בספקטרום הירוק.
5. הצמדת פרוסות לתא הקלטה
במהלך פרוסות הדמיה צריכים להיות יציבים מתחת למיקרוסקופ. בדרך כלל הנבל מתכת ממוקם להחזיק את הרקמות בצורה לא אחידה, אבל זה יכול לעוות את פני השטח של הפרוסה, נותן רק חלק בתחום להציג הדמיה בפוקוס. כדי להימנע מכך, פרוסות תקועים לתא הקלטה באמצעות Polyethylenimine (PEI).
PEI פתרון | |
1ml | פולי (ethyleneimine) פתרון |
במאגר בור 250 מ"ל | |
40mm | חומצה בורית |
10mm | tetraborate נתרן decahydrate |
4. טבלת מתכון PEI פתרון.
6. Imהזדקנות
סידן תלויי צבעים אינדיקטור ניתן הדמיה או באמצעות אחת או שתיים פוטון מיקרוסקופית. שימוש של שני פוטונים הדמיה רק מפעיל צבע אינדיקטור בתוך נפח המוקד של האזור של עניין, ובכך להקטין את כמות פיזור האור בתוך הרקמה. יתר על כן, היא מאפשרת חדירה טובה יותר של עומק האור לתוך הפרוסה.
הדמיה תפקודית סידן אנו משתמשים ספיר טיטניום לייזר מסופק על ידי מצמידים קוהירנט אל מיקרוסקופ אולימפוס במטרה 20x (NA 0.95) ומערכת Trimscope ידי LaVision BIOTEC. המערכת מאפשרת Trimscope מסגרת סריקה עם 64 beamlets בו זמנית, והוא יחד עם המצלמה C9100 EM-CCD Hamamatsu עבור מסגרת שיעורי סריקה מהירה.
7. נציג תוצאות
טעינה מוצלחת של אינדיקטורים סידן, Fura 2-AM מוצגים באיור 1 בפיתוח רשתות קליפת neocortical ו entorhinal באמצעות דימות multiphoton. לצבוע חלק עדיין קיים כפי מכתים רקע סומה רקמות אבל התא, ובמקרים מסוימים, דנדריטים הפרוקסימלי נראים בבירור להפריד בין הסביבה neuropil. אם הטעינה לא הייתה מוצלחת, מעט מאוד תאים ספציפיים מכתים הוא ציין ו אשכולות קטנים של נקודות צבע לעיתים קרובות נראו על פני השטח פרוסה פסולת קרום מת.
ב מסך האלה, רשת של תאים נראה בבירור במישור אחד של מוקד הדמיה התא בו זמנית. השימוש נבל מתכת או דבק שלם של הפרוסה לתא הקלטה יכול לגרום משטח אחיד פרוסה להיות הדמיה.
550fig1.jpg "alt =" איור 1 "/>
באיור 1. Fura 2-AM אסתר טעון פיתוח neocortical (א, משמאל) entorhinal (B, מימין) רשתות. ברים סולם 100 מיקרומטר.
כדי להפריד בין הנוירונים האסטרוציטים, שיתוף יישום sulforhodamine 101 עם Fura 2-AM אסתר מאפשרת הפרדה של סוגי תאים בתוך הרשת.
באיור 2. תיוג Astrocyte עם sulforhodamine 101. Co-תיוג של Fura 2-AM ו - אסתר sulforhodamine 101. גל עירור: 820nm. אוסף תמונות על PMTs עם מראה dichroic ב 560/70nm להפרדת אורכי גל. B נציג עקבות הקרינה מן הנוירון (לעיל) astrocyte (להלן). סולם ברים 60 שניות, ΔF 10 (au fluo).
באיור 3. FITC-מצומדות Lycopersicon esculentum (עגבניות) לקטינים מכתים . Labelling של microglia ותאי האנדותל בפיתוח ההיפוקמפוס עכבר (א) ו בקליפת entorhinal שטחית (B).
אינדיקטור צבעים סידן משמשים לקריאה מתוך פעילות של תאים מרובים בו זמנית בפיתוח רשתות הקורטיקליים בהיפוקמפוס.
איור 4. סידן הארעיים דינמי ברשתות בהיפוקמפוס קליפת המוח.
סרט 1: Fura 2-AM הטעינה של אסתר עכבר entorhinal הקורטקס במהלך השבוע לאחר הלידה השנייה.
לחץ כאן לצפייה בסרט 1.
סרט 2: Fura 2-AM טעינת אסתר של ההיפוקמפוס עכבר במהלך השבוע לאחר הלידה הראשונה.
לחץ כאן לצפייה בסרט 2.
סרט 3: Fluo-4 הטעינה של העכבר קליפה, במהלך השבוע לאחר הלידה הראשונה.
50movie3.avi "> לחצו כאן כדי לצפות בסרט 3.
במקרה של Fura 2-AM, אסתר תא ההפעלה מעורבים שלילת קוטביות זרם המושרה של סידן, מקטין צבע פלואורסצנטי. עבור צבעים כגון Fluo-4, ההיפך הוא הנכון ואת שלילת קוטביות התא כפי שנצפה גידול פליטת פוטון. הארעיים סומטיים סידן נמדדים בעיקר, אך פעילות יותר דנדריטים הפרוקסימלי ניתן לראות בהכנות מסוימים, כפי שמוצג סרט 2.
לקריאה מתוך פעילות הרשת ניתן לכמת באמצעות תסריטים תוכנה מסחרית או בתוך הבית. במעבדה שלנו זיהוי התאים, פעילות הרשת נמדדת וניתח באופן חצי אוטומטי באמצעות in-house קוד Matlab (Mathworks).
איור 5. ניתוח נציג הארעיים סידן מסונכרן מרשת קליפת המוח המתפתח. ייצוג 3D של נוירון אחד ( ) משמש באופן אוטומטי ליצור מסכה נוירון (ב) מתוך ערימה-z עבור זיהוי אוטומטי נוירון. מדידות של הארעיים סידן כוללים אמפליטודה, תדירות # של תאים פעילים שניתן לקרוא מן הנתונים נוירון יחיד (C). בתיאום בין עקבות שונות ניתן דמיינו באמצעות העלילה raster (ד ').
שיטות אנחנו מדגימים כאן להראות פרוטוקולים מתאימים הדמיה סידן של רשת דינמיקה מתאי לזיהוי בתוך בפיתוח רשתות הקורטיקליים בהיפוקמפוס העכבר גם במוח חולדה. שיטות אלו מספקות רזולוציה מרחבית אופטימלית לדמיין רשת מקומית של somas תא בו זמנית למדידת פעילות suprathreshold. החלטה הזמני של פעילות הרשת יכולים להיות מגוונים, בהתאם למסגרת הרכישה הגדרות מצלמת CCD, כדי לייעל את האות: מדידות רעש לאורך זמן suprathreshold אירועים משך, נמצא בדרך כלל למערכת העצבים המתפתחת. פרוטוקולים אלה אינם מוגבלים לרשתות בהיפוקמפוס קליפת המוח, אלא גם תאים תווית ברחבי מערכת העצבים המתפתחת. המגבלה של שיטה זו הוא כי פעילות suprathreshold רק ניתן להקליט.
LaVision BIOTEC GmbH (בילפלד, גרמניה) בחסות דמי הגשת כתב היד של מאמר זה.
עבודה במעבדה נתמך על ידי Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO) (917.10.372) כדי rmm. JD המזוהה עם האיחוד האירופי FP7 BrainTrain התוכנית ( www.brain-train.nl ). אנו מודים פיטר לורנס ו-Baljon סבין שמיץ (שניהם CNCR, אוניברסיטת VU באמסטרדם) עבור תמונות של מערך FP multielectrode גל ותרבויות עצבי המשמשים רצף וידאו.
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved