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神経回路網の開発の自発的な活動は、カルシウム感受性インジケータ染料のAM -エステルフォームを使用して測定することができます。神経細胞活性化を示す細胞内カルシウムの変化は、、1つまたは2つの光子イメージングとインジケーターの蛍光の過渡変化として検出されます。このプロトコルは分化依存的神経回路網の範囲に適合させることができる in vitroで。
神経系の開発における活動の特徴パターンが自発的、同期ネットワークアクティビティが発生しています。同期活動はそのまま脊髄、脳幹、網膜、大脳皮質および解離神経培養の準備で観察されている。自発活動の期間中、ニューロンは、多くのイオンチャネルを活性化し、単一または活動電位のバースト発火への脱分極。脱分極は、カルシウム流入を仲介する樹状突起と棘上電位依存性カルシウムチャネルを活性化する。高度に同期電気的活動は、フィールド電極を使用してローカル神経回路網から測定されています。この技法は、一方の電極に起因する読出し複数のニューロンの統合に高い時間サンプリングレートが低い空間分解能を可能にします。神経活動の単一細胞の解像度では、アクティビティを発射測定するために、単一のニューロンにパッチクランプ電気生理学を使用することが可能です。しかし、ネットワークから測定する能力は、ニューロンパッチを適用したsの数に制限されていますimultaneously、通常は唯一の1つまたは2つのニューロンです。カルシウム依存性蛍光指示薬染料の使用は、細胞のネットワークを介して同期して活性の測定を可能にしました。この手法は、高い空間分解能と開発ネットワークの自発的活動を記録するのに十分な時間的サンプリングの両方を与える。
前と出生後早期開発中に新たに形成皮質と海馬ネットワークの重要な特徴は、自発的、同期神経活動(; Khaziphov&ルーマン、2006カッツ&シャッツ、1996)である。この相関ネットワークの活動は、発展途上の神経系における機能的な回路の世代(スピッツァー、2006)のために不可欠であると考えられている。霊長類と齧歯類の脳の両方で、初期の電気とカルシウムネットワークの波が前と出産後、in vivoおよびin vitroで観察される(Adelsbergerら、2005;。Garaschukら、2000;。。Lamblinら、1999)。いくつかを制御することが知られているこれらの初期の活動パターン、神経分化、シナプス形成と可塑性(。ラキッチ&小室、1995;スピッツァーら、2004)を含む発達過程は皮質回路の正しい発展と成熟のための非常に重要です。
このJoveのビデオでは、皮質ネットワークの開発における画像自発活動するために使用されるメソッドを示しています。細胞内のエステラーゼ活性は、切断、細胞膜を通過するようなフラなどのカルシウム感受性の指標、2 - AMエステルのびまん性指示薬の細胞非透過性フォームのままにエステル思います。インジケータの透過性の形態は、細胞内カルシウムイオンを検出して結合することができるカルボン酸基を持っています..カルシウム感受性色素の蛍光が一過性にカルシウムと結合する際に変更されます。シングルまたはマルチフォトンイメージング技術は、色素から放射される光子の変化を測定するため、細胞内カルシウムの変化を示すために使用されます。さらに、これらのカルシウム- Dependent指標は、アクティブなネットワーク内での細胞型を調査するために他の蛍光マーカーと組み合わせることができます。
1。水平嗅内-海馬脳切片を作成
嗅内-海馬脳切片はカント、Wouterlood&ウィッター(2008)神経可塑性のID 381243 9によると、解剖学的なガイドを使用して行う地域の3D概要に記載されています。
スライスの溶液(mMで) - 10 | |
110 | 塩化コリン |
25 | 飽和NaHCO 3 |
11.6 | 11.6 |
10 | D -グルコース |
7 | MgCl 2の |
3.1 | sodiumpyruvate |
2.5 | 塩化カリウム |
1.25 | のNaH 2 PO 4 |
0.5 | CaCl 2で |
表1。スライスのソリューションのためのレシピ。
ACSF(mMで) | |
125 | NaClを |
26 | 飽和NaHCO 3 |
10 | D -グルコース |
3 | 塩化カリウム |
2.5/1.5 | MgCl 2の (回復/実験) |
1.6 | CaCl 2で |
1.25 | のNaH 2 PO 4 |
表2。両方のリカバリ(R - ACSF)と実験(電子ACSF)ソリューションのためのレシピ。
2。染色chの準備アンバー
カルシウム依存性インジケータまたは細胞特異的マーカーを有する細胞をロードするには、スライスには、染色手順のためのチャンバーに転送する必要があります。商業室が利用できるかもしれないが、いずれかが簡単に非常に少ないコストで標準的な実験装置から組み立てることができます。このようなチャンバーの主な機能は、スライスが30と35との間に暖めていることです° C、継続的に酸素化された媒体にしてチャンバーを光から遮蔽されているインキュベート。
方法論の図1。スライスのインキュベーション(上記)とカルシウム感受性インジケータ( 下の緑色の色素を、ピペッティング)のアプリケーションを示す染色槽の断面図。
3。スライスの染色
蛍光色素を含むすべての処理を通して、少しの光で動作することにより、退色を避けるためと染料を維持し、t彼は、処理の間に暗闇の中で組織を染色した。
年齢(生後日数) | インキュベーション時間(分) |
20 | |
P8 - P9 | 25 |
P10 - P11 | 30 |
P12 - 13 | 35 |
> P13 | 40 |
表は、3。異なる年齢のためのインキュベーション時間は、ラボで経験的に決定された。
4。他の染料と古い組織
おそらく、脳組織の増加髄鞘形成のために、古いげっ歯類からのスライスは、簡単にフラ2 - AMエステルを占有しません。クレモフォールEL(Sigma)を用いたプレインキュベーションステップはP13、11より古いでマウスの脳のために使用されているこの色素の取り込みを促進する。クレモフォールは、多くの薬学の賦形剤として使用される非イオン性界面活性剤です。らのアプリケーション。このステップがなければ、我々は、細胞特異的ラベリングは皮質切片全体に非常に悪いと矛盾していることがわかります。
カルシウムの染料は、スライス標本で神経細胞と非神経細胞の両方をロードする。識別し、ネットワーク内でこれらの細胞型を区別するために、スルホローダミン101(SR101)がスライス内アストロサイトを標識するために使用することができます。
スルホローダミン101のスライスの染色
(セクション3)以前のように手順1〜3に従ってください。
-20℃での貯蔵からスルホローダミン(シグマ)の10mMのストック溶液の1μlを取り、10μM溶液を得た、999μlのR - ACSFに溶解する。紫色の染料OVをピペットでER前と同じようにスライス(5-7ステップ)、15分間インキュベートスライスを残して。
ミクログリアと内皮細胞は、FITCトマトレクチンの色素を使用したラベルが付いています
前と同じ手順1〜3に従ってください。
2mg/mlトマトesculentum(トマト)レクチンFITCコンジュゲート(L0401、シグマ)20μg/ mlの濃度になるように2.5ミリリットルR - ACSFにストック溶液の25μlを取る。 45分の期間インキュベートスライスを残して、(5-7ステップ)以前と同じようにスライス上に染料をピペット。
(注)、それは両方の色素から光子が放出されるので、スペクトルの緑の範囲で蛍光を発するフラ2 - AMまたはオレゴングリーンBAPTA - 1(OGB - 1)のようなカルシウム感受性インジケータでは、この色素を結合することはできません。重複する波長で。しかし、ウィットを結合するために適切なフィルタまたはテキサス - レッドレクチンコンジュゲートと組み合わせて使用することができるようなカルシウムオレンジ、フラレッドのような他のカルシウムインジケータの色素が存在する緑のスペクトルにおけるhはカルシウムインジケータの色素。
5。録音室にスライスの取り付け
イメージングのスライス中に顕微鏡下で安定であることが必要。通常、金属製のハープは、組織を押したままに配置されますが、それは不規則に焦点のイメージングのためのビューのフィールドの一部だけを与えて、スライスの表面を歪めることができる。これを避けるために、スライスは、ポリエチレンイミン(PEI)を使って録音室に立ち往生している。
PEIソリューション | |
1ミリリットル | ポリ(エチレンイミン)ソリューション |
250ミリリットルホウバッファに | |
40mmの | ホウ酸 |
10mMの | 四ホウ酸ナトリウム十水和物 |
表4。レシピPEIのソリューション。
6。 IM高齢化
カルシウム依存性インジケータの色素は、1段階または2光子顕微鏡を用いて画像化することができます。二光子イメージングを使用すると、唯一のため、組織における光散乱の量を減らし、関心領域の焦点体積中にインジケータの色素を活性化する。さらに、それは、スライスへの光の良い深さの浸透を可能にします。
機能的カルシウムイメージングのために我々は、20倍対物レンズ(NA 0.95)とLaVision Biotec社でTrimscopeシステムでオリンパスの顕微鏡にコヒーレント結合によって供給されるチタンサファイアレーザーを使用してください。 Trimscopeシステムは、同時に64レットでフレーム走査を可能にし、高速フレームスキャンレートのための浜松C9100 EM - CCDカメラで結合されている。
7。代表的な結果
カルシウムインディケーターのロードが成功、フラ2 - AMは、多光子イメージングを用いた新皮質と嗅内皮質のネットワークを開発する際に、図1に示されています。いくつかの染料はまだ組織のバックグラウンド染色が細胞体として、いくつかのケースに存在する、近位樹状突起がはっきりと神経網を周囲から分離されています。ロードが成功していない場合は、ほとんど細胞特異的染色が観察され、色素斑の小さなクラスターは死んだ細胞膜の破片でスライスの表面にしばしば表示されている。
これらのスクリーンショットでは、細胞のネットワークは、同時に細胞イメージングのための焦点の一つの面ではっきりと見える。録音室に金属のハープやスライスの不完全な付着の使用は、撮像すべき不均一なスライスの表面に発生する可能性があります。
550fig1.jpg"altが="図1"/>
図1。フラ2 - AMエステル-ロードされて新皮質の開発(左)と嗅内(B、右)のネットワーク。スケールバーは100μm。
アストロサイトからニューロンを分離するために、フラとローダミン101の共同アプリケーション2 - AMエステルは、ネットワーク内の細胞型の分離が可能になります。
図2。スルホローダミン101の星状膠細胞ラベリング。フラ2 - AMエステルおよびスルホローダミン101の共同ラベル。励起波長:820nm。ニューロン(上記)とアストロサイト(下記)から波長分離用560/70nmでダイクロイックミラーによる光電子増倍管上の画像コレクション。B代表蛍光のトレース。スケールバーは60秒、ΔF10(AU蛍光)。
図3。 FITC標識トマトesculentum(トマト)レクチン染色 。マウスの海馬(A)と表面的な嗅内皮質(B)の開発におけるミクログリアと内皮細胞のラベリング。
カルシウム指示薬の色素が皮質と海馬のネットワークを開発する際に、同時に複数の細胞からの活動を読み出すために使用されます。
図4。海馬と皮質ネットワークにおける動的なカルシウムトランジェント。
動画1:第二出生後の週の間にマウス嗅内皮質のフラ2 - AMエステルのロード。
動画1を表示するにはここをクリック。
動画2:出生後第1週の間にマウスの海馬のフラ2 - AMエステルのロード。
映画2を表示するにはここをクリック。
動画3:出生後第1週中にマウス皮質のであるFluo - 4負荷、。
50movie3.aviは">映画を見たい方はここをクリックしてください。
フラ2 - AMエステルの場合には、カルシウムの脱分極誘発流入が関与する細胞の活性化は、色素の蛍光を減少させます。このようにみたFluo - 4などの染料の場合、反対はtrueですと、細胞の脱分極は、光子の排出量の増加として観察される。体細胞のカルシウムトランジェントは主に測定が大きい近位樹状突起における活動しているムービー2に示すように、また、いくつかの準備で見ることができます。
読み出し、ネットワークアクティビティのは、商業目的または社内ソフトウェアのスクリプトを使用して定量することができる。私たちの研究室、細胞の同定およびネットワークアクティビティで測定され、MATLAB(Mathworks社)の社内コードを使って半自動化された方法で分析した。
図5。開発皮質ネットワークから同期したカルシウムトランジェントの代表的な分析。一つのニューロンの三次元表現( A)が自動的に自動化されたニューロンの検出のための(B)Z -スタックからニューロンのマスクを作成するために使用される。カルシウムトランジェントの測定は、単一のニューロンのデータ(C)から読み出すことができるアクティブなセルの振幅、周波数および#などがあります。別のトレース間の同調性は、ラスタープロット(D)を用いて可視化することができます。
我々はマウスでもラットの脳で皮質と海馬のネットワークの開発の中に識別の細胞からネットワークダイナミクスのカルシウムイメージングに適したプロトコルを表示するここに示す方法。これらのメソッドは、閾値上の活性を測定するため、同時に細胞についてSOMAのローカルネットワークを可視化するために最適な空間分解能を提供しています。通常、発展途上の神経系に見られる長い期間の閾値上のイベントのための騒音測定:ネットワークアクティビティの時間分解能は、信号を最適化するために、フレーム取り込みCCDカメラの設定に応じて、変化させることができる。これらのプロトコルは、発展途上の神経系全体に海馬と皮質のネットワークだけでなく、ラベルの細胞に限定されていません。このメソッドの制限は、その唯一の閾値上のアクティビティが記録できることです。
LaVisionバイオテク社(ビーレフェルト、ドイツ)は、この原稿の記事の投稿料を後援した。
ラボでの作業はRMMにNederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek(NWO)(917.10.372)によってサポートされています。 JDは、EUのFP7 BrainTrainプログラム(に提携していますwww.brain - train.nl )。我々は、FP多電極アレイの波形とビデオシーケンスで使用されているニューロン培養のイメージのためにピーターローレンス- Baljonとザビーネシュミッツ(CNCR、VU大学アムステルダムの両方を)感謝。
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