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Method Article
传统的细胞过程,如细胞迁移研究二维的,僵硬的塑料表面上。本报告介绍了一个直接可视化蛋白定位和分析一个有关生理,立体矩阵的细胞迁移的蛋白质动力学的技术。
传统上,细胞迁移进行了研究二维的,僵硬的塑料表面上。然而,在伤口愈合,组织再生和癌症转移,如重要的生物过程,细胞必须通过复杂的,立体化的细胞外组织的导航。为了更好地理解这些生物过程背后的机制,重要的是要研究负责驱动细胞迁移的蛋白质的作用。在这里,我们勾勒出一个协议研究使用的上皮细胞株(MDCK)细胞迁移的机制,和一个立体的,纤维,作为一个模型系统的自我聚合矩阵。这透明的细胞外基质是活细胞成像研究容易服从和更好地模拟生理,软组织环境。这份报告展示了一个直接可视化蛋白定位和动态的技术,和周围的三维矩阵变形。
考试蛋白定位在细胞过程的动态ination到蛋白质的功能提供了关键的洞察力。基因编码的荧光标记提供了一个独特的方法观察蛋白定位和动态。使用这种技术,我们可以分析细胞内积累的关键,强行通过基质细胞演习实时生成细胞骨架的组成部分。此外,使用多个不同波长的荧光标记,我们可以研究多种蛋白质同时进行本地化,从而让我们来测试,例如,不同的蛋白质是否具有类似或不同的角色。此外,荧光标记的蛋白质的动态,可量化的使用荧光漂白后(FRAP)分析恢复。这种测量方法检测蛋白的流动性和稳定约束的蛋白质是细胞骨架网络。
通过与蛋白质功能抑制剂治疗相结合的活细胞成像,我们可以检查实时的蛋白质和细胞迁移形态的分布变化。此外,我们还结合使用荧光示踪粒子矩阵内的嵌入式可视化在细胞迁移的矩阵变形的活细胞成像。因此,我们可以想像如何迁移细胞分布力产生的蛋白质,以及牵引力施加到周围基质。通过这些技术,我们可以得到宝贵的见解,成特定的蛋白质和他们的贡献细胞迁移机制的角色。
1。稳定细胞株的产生(如MDCK细胞)
2。表面改性玻璃底菜,以获得最佳的胶原蛋白结合(可选)
3。三维胶原凝胶的制备与示踪粒子
4。时间推移图像采集程序
5。 FRAP程序和分析
6。代表性的成果
矩阵内的健康上皮细胞的活细胞成像的一个例子是如图3所示。健康的细胞表现平稳,连续的膜,和不同的原子核,而不健康的细胞往往有一个扰乱膜,数量过多的空泡。在一个三维矩阵,单一的上皮细胞迁移1,在数天的过程中,上皮细胞内形成矩阵2的立体,呈球形,多细胞囊肿。细胞也高度动态的,囊肿内(图3)迁移。通过嵌入周围基质(图4)中的示踪粒子的位移分析矩阵变形的细胞迁移施加的牵引力的结果。示踪粒子运动作为一个最大的不同投影图像显示耳鼻喉科时间点,每个时间点是伪彩色显示的时间(图4B)。另外,个人示踪粒子的图像显示为蒙太奇显示随着时间的推移示踪粒子的运动(图4C)。使用ImageJ完成所有图像分析。这些定性评估矩阵变形,因此细胞迁移施加的力量,是有用的牵引力分布近似。在三维细胞迁移施加牵引力的定量估计是超出了本协议的范围,并描述在别处3,4。
图5显示了一个典型的实验漂白后的荧光恢复。感兴趣的区域,必须使用激光优化设置,使荧光强度明显减弱相比,背景水平(以最大限度地提高信号的信噪比),同时保持健康和完好的细胞光漂白。最佳设置必须b发送凭经验确定每个FRAP设置是不同的(例如,FRAP使用激光扫描共聚焦系统)。
曝光后FRAP图像采集的时间间隔必须仔细控制,以避免背景光漂白。使用较低的激光功率,曝光时间短,和感光摄像头的使用和高效率的光学是必不可少的高品质FRAP成像。如果在图像采集的荧光漂白是显著的,这种背景下衰落必须加以量化,并从所观察到的荧光强度恢复正常化。由于3D的环境性质,Z -元件的荧光强度恢复可能成为显著。因此,重要的是定义一个光漂白卷,由前,后3D堆叠光漂白区域的图像。荧光恢复的进一步分析和建模是其他地方讨论 5,6 。
活细胞成像吨的独特组合echniques:绿色荧光蛋白细胞骨架蛋白,红色荧光示踪粒子动力学监测矩阵变形,抑制剂,可同时使用为蛋白质的动态,牵引力和分子途径分析。
图1。胶原蛋白凝胶的制备。一)聚合在玻璃底菜胶原基质。粉红色的凝胶是由于嵌入的荧光颗粒。二)程序处理的玻璃底菜交联的胶原蛋白凝胶玻璃表面。首先,玻璃底菜是用3 Aminopropyltrimethoxysilane解决方案,然后戊二醛溶液交联的胶原基质玻璃。
图2。焦/ FRAP显微镜设置示意图。共焦显微镜的基础上与一个CoolSnap HQ II CCD相机的蔡司AxioObserver Slidebook软件(智能成像创新)和完全自动化。共焦单位定制设计和横河电机旋转盘单位CSU10和两个固态激光器,声光可调谐滤波器(AOTF)(50兆瓦和40兆瓦与561纳米与488纳米)的基础上,让两束激光之间切换的毫秒。排放过滤器五十分之五百二十五纳米和六十分之六百二十零纳米(#118661和#118085,色度技术)和分色镜是488-568 BrightLine双频(Semrock)。的目标是:长工作距离的40X的C -复消色差透镜的目标与Na 1.1和0.62毫米的工作距离,和一个63X的计划,复消色差透镜的目标,与Na 1.4和0.19毫米的工作距离。该显微镜还包括一个FRAP photoablation系统,光纤光学,计算机控制光束位置和强度,泵浦染料激光器和衍射极限的光斑大小。此外,在显微镜配备XY机动阶段,其中包括0.1微米的每个轴的线性编码器。在时间推移成像,环境温度保持定制设计的显微镜室和反馈温度控制加热器。为了隔离噪音和振动,整个显微镜系统是无振动的表。
图3。上皮细胞表达GFP -肌动蛋白的活细胞成像。这些细胞经过4天的文化,在三维胶原基质形成囊肿。有些细胞沿着表面的囊肿(黄色箭头),而其他室内囊肿(红色箭头)内迁移。比例尺10微米,在小时的时间。
图4。Rho激酶的作用,抑制牵引力。一个迁移MDCK细胞表达G细胞)DIC的形象计划生育标签的核标记。立即采取的Rho激酶抑制剂Y - 27632治疗前的影像。比例尺10微米。 B)粒子的位移,此外Y - 27632。在不同时间点(0 - 52分钟)的粒子位置是根据强度等级的伪彩色,然后投射到一个单一的形象。白色区域是绿色荧光蛋白在细胞迁移正电的原子核。比例尺10微米。在几分钟的时间。 c)在粒子运动的细胞后缘(见箭头在B)。星号表示前Y - 27632除了捕获的最后一帧。走向和移植细胞后缘离前后此外Y - 27632,分别提出示踪粒子。比例尺1微米。
图5。FRAP GFP -肌动蛋白的分析,在一个三维矩阵表达的细胞迁移。一)Timelapse图像的GFP漂白前后的肌动蛋白表达细胞。绿色荧光蛋白,肌动蛋白的积累在细胞后部的一个小区域是光漂白(红色箭头),在时间点0。在几秒钟的时间,规模杆5微米。二)绘制的光漂白地区(实线),以及适合的荧光恢复指数(圆圈)的平均荧光强度随着时间的推移。荧光强度归漂白前的初始值。
在这里,我们描述了一个用活细胞成像研究细胞迁移的机制,在一个三维矩阵的方法。这项技术的成功取决于获得“良好”的克隆稳定表达GFP标记的蛋白质。绿色荧光蛋白的水平低会损害细胞的健康,而过高GFP水平将有不良的副作用,对细胞需要一个多余的激励曝光。因此,转染到细胞中的基因的载体选择是很重要的(例如,子,荧光标记等)。有很多绿色荧光蛋白,包括红色荧光蛋白(RFP?...
没有利益冲突的声明。
我们感谢手稿的关键读博士格兰特隅田川。这项工作是由一个贝克曼青年研究员奖“(SY),赫尔曼家庭新教师奖”(SY),美国国立卫生研究院尤里卡,加州大学癌症研究中心协调委员会的支持。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
试剂名称 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
胶原蛋白,牛,I型 | BD公司 | 354231 | 股票约3毫克/毫升 |
3,aminopropyltrimethoxysilane | 西格玛爱秩序 | 281778 | 稀释水 |
戊二醛 | 西格玛爱秩序 | 340855 | 在PBS稀释 |
1M HEPES | Invitrogen公司 | 15630-080 | |
Fluospheres聚苯乙烯微球1微米,红色荧光(六百〇五分之五百八十零) | Invitrogen公司 | F13083 | |
Geneticin(G418) | Invitrogen公司 | 11811-031 | |
文化传媒组件: | |||
DMEM培养液 | Invitrogen公司 | 31600-034 | |
胎牛血清 | 亚特兰大生物 | S115500 | |
青霉素/链霉素 | Invitrogen公司 | 15140-122 | |
卡那霉素 | Invitrogen公司 | 15160-054 |
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