研究DNA损伤检验点<em&gt;爪蟾</em&gt;卵提取物

摘要

非洲爪蟾卵提取物是一个有用的模型系统，研究DNA损伤检验点。该协议是非洲爪蟾卵提取物和DNA损伤检验点的诱导试剂的准备。这些技术是适应各种DNA损伤的方法，在研究的DNA损伤检查点的信号。

摘要

在每天的基础上，将细胞进行的各种内源性和环境的侮辱。为了解决这些侮辱，细胞进化作为一个监督机制，检测DNA损伤和直接的细胞反应对DNA损伤的DNA损伤检验点的信号。有几组的蛋白质称为DNA损伤检查点的信号（ 图1）中所涉及的传感器，传感器和效应器。在这种复杂的信号转导通路，ATR（ATM和RAD3相关）是主要的激酶，可以响应DNA损伤和复制压力之一。激活ATR磷酸化其下游底物，如检查点激酶1（Chk1的）。因此，磷酸化和激活Chk1的导致许多下游的影响，在DNA损伤检验点包括细胞周期阻滞，转录激活，DNA损伤修复，细胞凋亡或衰老（ 图1）。当DNA被破坏，无法激活DNA损伤检验点在UNREP结果播出损伤，且随后，基因组不稳定。细胞DNA损伤检验点的研究阐明了如何保持基因组的完整性，并提供了一​​个更好地了解人类疾病，如癌症，如何发展。

非洲爪蟾卵提取物正在成为一个强大的无细胞提取DNA损伤检验点的研究模型系统，。低速提取物（LSE）最初是由升井组^1。去膜精子染色质核形成DNA的半保留复制的方式一次细胞周期LSE结果。

ATR/Chk1-mediated检查点的信号转导通路所引发的DNA损伤或复制压力^2。目前使用的两种方法诱导的DNA损伤检查点：DNA损伤的方法和DNA损伤模仿结构体^3。 DNA损伤可诱导的紫外线（UV）照射，γ-照射，甲基甲烷esulfonate（MMS），丝裂霉素C（MMC），4 -硝基喹啉-1 -氧化物（4-NQO），或aphidicolin的^3，4。 MMS是一种烷化剂，抑制DNA的复制和激活ATR/Chk1-mediated DNA损伤检验点^4-7。紫外线照射触发的ATR/Chk1-dependent的的DNA损伤检验点^8。的DNA损伤模仿结构AT70退火是一个复杂的两个寡核苷酸的聚（dA的）70和聚-（dT）的70。 AT70比尔·邓菲的实验室系统的开发和广泛使用^9-12，诱导ATR/Chk1检查点的信号。

在这里，我们描述协议（1）准备细胞的卵提取物（LSE），（2）治疗爪蟾精子染色质与两种不同的DNA损伤的方法（MMS和UV），（3）准备的DNA损伤模仿的结构AT70，和（4）来触发的ATR/Chk1-mediated DNA损伤检查点LSE相损坏的精子染色质或DNA损伤模仿结构。

研究方案

1。 LSE准备

1. 集蛋，雌蛙（ 非洲爪蟾 ）注射两次。第一次注射（启动）为100 U PMSG（孕马血清促性腺激素）每青蛙。青蛙必须催芽前至少两天诱导产卵和引物的青蛙可用于长达两个星期。黄金青蛙，用3毫升注射器和27 G针在背淋巴囊皮下注射PMSG。
2. 诱导产卵，注入500 U HCG（人绒毛膜促性腺激素）每底漆青蛙在使用27 G针背淋巴囊皮下。孵育注入青蛙在不同的桶含2升1个马克的改性林格氏液（MMR）。允许青蛙产卵14-20小时之前收集。
3. 从桶中取出青蛙，倒出MMR解决方案，直到剩下大约100毫升。鸡蛋从水桶，将鸡蛋，250毫升的烧杯中。
4. 通过添加100毫升的2％半胱氨酸（调整dejelly蛋pH值至7.8，用10M KOH）。轻轻旋转一个倒置的玻璃巴斯德移液管（直径0.7厘米），大约每30秒的鸡蛋。弃去，更换新鲜半胱氨酸两次孵化过程中。 dejellying过程是在约5-15分钟完成鸡蛋时，在烧杯的底部形成了一个更简明的层。
5. 丢弃的半胱氨酸溶液和，洗鸡蛋3倍与0.25倍MMR。涡流的鸡蛋放在一个玻璃吸管的解决方案。 “坏”蛋是由简单的目视检查，并在外观上的“浮肿”白。 “坏”的鸡蛋会堆积在烧杯中后，旋转的中心。删除“坏”蛋的巴斯德吸管。
6. 洗蛋与蛋裂解缓冲液（ELB）的三倍。删除任何额外的“坏”蛋的巴斯德吸管。倒入鸡蛋液成14毫升的Falcon管。
7. 旋转Falcon管中，为55秒，在188×g离心（1100转）使用CL2 IEC临床台式离心机转子的摆动压缩鸡蛋。删除多余的缓冲区中蛋层的顶部。加入0.5μL抑肽酶/亮肽素股票和0.5微升的细胞松弛素B股每毫升夯实鸡蛋。
8. 离心机的鸡蛋在16500 XG（10,000 RPM）为15分钟，在4°C，使用在Sorvall RC6加超高速离心机HB6摆动转子。离心分离后，鸡蛋是在管内分离成三层：脂质，提取物，和蛋黄/颜料从顶部到底部，分别。穿刺的Falcon管中的中间提取物层具有21 G针的下部侧。小心地取出针的穿刺针可能会阻碍塑料。插入一个新的21 G针1毫升注射器穿刺部位收集提取物。慢慢地提取到注射器吸出，以避免气泡和污染的脂肪和蛋黄/颜料层。
9. 将提取到的冷冻1.5ml离心管。每毫升卵提取物，添加以下解决方案中的化学股票dicated终浓度（在括号中所示）：（1）10微升的放线菌酮（100微克/毫升），（2）1微升抑肽酶/亮抑酶肽（10μg/ ml的每个），（3）1微升的细胞松弛素B（5微克/毫升），（4）1微升二硫苏糖醇（1mM）的，以及（5）0.33微升诺考达唑（3微克/毫升）。反转的鸡蛋轻轻地提取至少10倍。这是的LSE，必须作出新鲜和4小时内使用。 4小时后或冻融破坏的质量LSE。

2。精子染色质DNA损伤的方法治疗

1. 准备正常精子染色质，根据先前描述的方法^13。
2. 准备MMS处理过的精子染色质
   1. 正常的精子染色质重悬在0.5毫升缓冲十
   2. 加入500μL的悬浮染色质终浓度为100毫米〜5.5μl的MMS（9.1米股票）。
   3. 与旋转的30分钟，在微量离心管中，在室温下孵育精子染色质。
   4. 旋转米在686的XG（2,100转每分钟）10分钟，在室温下使用的IEC CL2临床离心机摆动转子和管接头的icrocentrifuge管。
   5. 弃上清，将沉淀重悬于0.5毫升缓冲X加BSA（3％），DTT（0.1毫米）和抑肽酶/亮肽素（10微克/毫升）。
   6. 重复步骤（4）和（5）两次洗精子染色质。
   7. 确定用血球计数仪，精子染色质的浓度，并稀释至100,000精子个/μl。将5微升等份，在-80℃冰箱为进一步利用。
3. 准备UV处理过的精子染色质
   1. 加入所需量（ 例如，10微升）正常精子染色质石蜡膜一块的表面上。
   2. 将封口膜UV交联成。设置所需的能量参数，根据你的实验，并开始损害精子染色质通过UV光。例如，它需要约21秒内达到1000焦耳/米^2。
   3. UV辐照后应该被添加到卵提取物立即diation，UV处理的精子染色质。

3。制备的DNA损伤模仿结构（AT70）

1. 溶解两个合成的寡核苷酸的聚（dA的）70（指定为A70）和聚-（dT）的70（指定为T70），在水中的浓度为2微克/微升，分别。
2. 加入100μl的A70和T70的100微升至1.5 ml离心管中。煮沸混合的合成寡核苷酸的5分钟，在95℃在一个heatblock溶液。
3. 以干浴块（AT混合管），并让它冷却至室温实验室的长椅上。温度调整大约需要45-60分钟。
4. 将冷却的混合物是AT70与最终浓度为2微克/微升。存储10微升的AT70等分在-20°C冷冻室为进一步利用。

4。在LSE损坏的精子染色质的DNA损伤引发的DNA损伤检验点模仿结构

1. 在LSE受损的精子染色质诱导DNA损伤检验点
   1. 加入50微升至1.5 mL离心管中，LSE和1μl的能量合剂，受损的精子染色质（终浓度〜4,000精子/μl反应体系）和2μl补充。
   2. 反应管中，在室温下孵育90分钟，轻弹管每10分钟。
   3. 分送到显微镜载玻片辅以核染料溶液中30分钟温育后用1微升1微升的反应混合物。在反应混合物放置一个盖玻片和晶核形成通过荧光显微镜检查。通常情况下，核圆形，形成孵化30分钟后，启动DNA复制。
   4. 入90μl的样品缓冲液中，以10微升的反应混合物。样品通过使用抗Chk1的P-S344中或反Chk1的抗体的免疫印迹分析。
2. 在LSE与诱导DNA损伤检验点AT70
   1. 加入50微升至1.5 mL离心管中补充能量合剂和1微升1.6μl的变构股票LSE。
   2. 将1.25微升预先制作AT70（2微克/微升）或水（作为阴性对照）添加到每个反应。反应在室温下孵育90分钟。滑动的反应管，每隔10分钟。
   3. 入90μl的样品缓冲液中的反应混合物中加入10μl。通过免疫印迹使用抗Chk1的P-S344中或反Chk1的抗体的样品进行检查。

5。代表性的成果

损坏的精子染色质或DNA损伤模仿结构可以触发ATR/Chk1-mediated的DNA损伤检查点，在非洲爪蟾卵提取物系统。 图2A表明，彩信诱导Chk1磷酸化在Ser344（Chk1的P-S344），这是一个指标ATR激酶的活化。 图2B示出，AT70，作为DNA损伤模仿STRU王国芳，也触发Chk1磷酸化。在这两个例子中加载控件作为总Chk1的样品。

图1。阿图的DNA损伤检查点的信号。

图2。 Chk1磷酸化引起的MMS或AT70在非洲爪蟾卵提取物治疗。（A）彩信（MMS）受损的精子染色质或正常的精子染色质（CON）卵提取物孵育90分钟。 Chk1的磷酸化Ser344（Chk1的P-S344），总Chk1在卵提取物，通过免疫检查。 （B）AT70或水（CON），加入鸡蛋提取物，分别。样品也进行了分析，通过免疫印迹法（A）中。

讨论

在研究非洲爪蟾卵提取物的DNA损伤检验点有以下几个优点。卵提取物的使用提供了一个大的数量的无细胞提取物在相间的细胞周期同步。卵提取物，可以容易且廉价地作出。这是比较容易损坏的DNA或染色质，并揭示后从卵提取物immunodepleting目标蛋白在DNA损伤检验点缺陷。随后，一个潜在的功能缺损可以“救出”addback的野生型或突变型重组蛋白质。因此， 非洲爪蟾卵提取物是一种功?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
			试剂
反Chk1的P-S344抗体	细胞信号转导	2348L
抗-Chk1的抗体	圣克鲁斯	SC7898
抑肽酶	MP Biomedicals	0219115880
放线菌酮	西格玛	C7698-5G
细胞松弛素B	EMD	250233
二硫苏糖醇（DTT）的	VWR	JTF780-2
人绒毛膜促性腺激素	西格玛	CG10-10VL
L-半胱氨酸	西格玛	C7352-1KG
亮肽素	VWR	97063-922
甲基磺酸甲酯（MMS）	西格玛	129925-5G
诺考达唑	西格玛	M1404-2MG
PMSG	Calbiochem公司	367222
上样缓冲液	西格玛	S3401
互变	光化工（美国）	209-12041
			设备
产蛋桶	Rubbermaid的商业产品	6308
CL2 IEC离心机转子的摆动	Thermo Scientific的	004260F
HB6摆动转子	Thermo Scientific的	11860
SORVALL RC6加超高速离心机	Thermo Scientific的	46910
UV交联	UVP	95-0174-01
			解决方案
1个MMR			100mM的NaCl，2mM的氯化钾，0.5mM的MgSO 4干燥 ，2.5mM的CaCl 2的 ，5mM的HEPES，pH值调节至7.8，用10 M NaOH
抑肽酶/亮肽素股票			10毫克/毫升在水中。将20μL分装-80°C
x的缓冲区			15mM的NaCl的80 mM KCl中，0.2M蔗糖，5毫摩尔MgCl 2，1mM的EDTA，10mM的HEPES，pH值调节至7.5，用HCl
放线菌酮股票			10毫克/毫升在水中。存储1毫升的等分试样在-20℃。
细胞松弛素B股			5毫克/毫升在DMSO中。 20μL分装-20℃保存
二硫苏糖醇（DTT）的股票			1 M中水。存储1毫升的等分试样在-20℃。
ELB			0.25M蔗糖，1mM的DTT，50微克/毫升放线菌酮，2.5毫摩尔MgCl 2，50 mM KCl中，10mM的HEPES，pH7.7
诺考达唑股票			在DMSO中的10毫克/毫升。将5微升等分在-80°C
能量合剂			375 mM的磷酸肌酸，50mM的ATP，和25mM的MgCl 2。等分试样在-80℃下保存
核染料溶液			0.4μg/ ml的Hoechst 33258染色，25％甘油（体积/体积），在1x PBS
变构股票			在DMSO中的100μM的。在-80℃下存储10微升等份