在体测量小鼠肺血管内皮表面层

摘要

内皮细胞糖萼/内皮细胞表面层是理想的使用活体显微镜研究。活体显微镜技术上具有挑战性的运动器官如肺。我们展示了如何同时明场和荧光显微镜可用于估计内皮表面层的厚度，在可自由移动小鼠肺。

摘要

内皮糖萼层衬在血管腔的蛋白多糖和相关的葡糖胺聚糖。 在体内 ，糖复合物是高度水合，形成大量的内皮细胞表面层（ESL），有助于血管内皮功能的维护。由于内皮细胞糖复合物往往是异常失去了在标准组织内固定技术在体外和活体显微镜，研究中需要使用的ESL。为了更好地逼近复杂的生理学的肺泡微血管，是理想的可自由移动的肺进行肺活体成像。这些准备工作，但是，一般会有大量的运动伪影。我们证明如何闭胸，可以使用一个可自由移动的小鼠肺活体显微镜测量糖萼通过ESL排除从内皮细胞表面的荧光标记的高分子量葡聚糖的完整性。此非恢复的手术技术，这需要同步明场和荧光成像的小鼠肺，允许纵向观察胸膜下微血管不引起混淆肺损伤的证据。

引言

内皮糖萼层衬在血管内膜蛋白多糖和相关的葡糖胺聚糖是一种细胞外， 在体内，糖萼高度水合，形成大量的内皮细胞表面层（ESL），调节多种内皮细胞功能，包括透液性^1，嗜中性粒细胞-内皮粘附^2，和机械力的流体剪切应力^3。

从历史上看，糖萼一直怀才不遇由于其在培养的细胞制剂^4，5和其降解过程中的标准的组织固定和处理^6的畸变。越来越多地使用活体显微镜（IVM） 在体内的显微镜，也伴随着高度的科学兴趣在健康和疾病中的血管功能的重要性，ESL。 ESL是不可见的光镜，并不能容易地标记体内的荧光腊梅糖结合凝集素的倾向，导致红细胞凝集和致死性肺动脉栓塞（未发表意见）。因此，一些间接的方法推断出ESL在非移动，如提睾和肠系膜微循环血管床的厚度（和推而广之，蛋白质复合物的完整性）。这些技术包括在循环微粒速度从内皮膜（微粒图像测速^9）以及笨重，荧光标记的血管标记物（ 如葡聚糖）的排除测量从内皮表面的距离的函数的测量的差异（的葡聚糖排除技术^{10，11）。}这些技术中，只有葡聚糖排斥是能够推定的ESL从在一个单一的时间点测量的厚度。通过同时测定血管宽度使用明视野显微镜（宽度ESL厚度CLUSIVE"看不见"的ESL）和排除从ESL血管示踪剂的荧光显微镜，可以计算为一个血管的宽度²之间的差的一半。

的瞬时测量的ESL厚度的使用是非常适合于研究的肺糖萼。活体显微镜的肺是具有挑战性的，显着的肺和心脏运动伪影。虽然最近的进步使固定的小鼠肺在体内 ^{12 13，}关注方面存在肺瘀血的生理影响。肺动与减少内皮型一氧化氮信号¹⁴信号转导通路，同时影响中性粒细胞黏附¹⁵和肺损伤^16。此外，固定肺公开周围移动肺泡损害剪切力（即所谓的"atelectrauma"）的区域，按照与经典的生理概念肺泡相互依存^17。

2008年，矶田渊沃尔夫冈·库伯勒和他的同事开发出一种手术技术，使活体显微镜可自由移动的小鼠肺^18。呼吸的神器所产生的这种技术可以通过使用高速成像，包括明场和荧光显微镜的同时测量被否定。在这份报告中，我们详细介绍了如何瞬间右旋糖酐排除成像可以用来测量ESL厚度可自由移动， 在小鼠体内的肺胸膜下的微循环。这种技术可以很容易地修改，以确定糖萼函数具体地，一个完整的ESL排除循环从内皮细胞表面的元素的能力。最近，我们利用这些技术来决定的重要性，肺ESL完整的全身性炎症性疾病如败血症²急性肺损伤的发展。

研究方案

1。制备手术管，血管导管，胸壁窗口

1. 活体显微镜阶段，我们定制一个的有机玻璃阶段麻醉鼠标是在显微镜。这个阶段可同时接待15厘米10厘米灵活的塑料菜板（鼠标是在麻醉诱导，气管切开的位置，静脉导管），以及一个同样大小的加热元件（菜板下方）。
2. 鼠标胸廓造口术管准备 （ 图1）。一个10厘米长的PE 50的管（Intramedic，内径0.58毫米，外径0.965毫米）的削减。一端被连接到弯曲的23号针的钝端，这个针将被用于通过胸壁（→外内）通过管封闭胸窗口之前。
   油管（1.5厘米的长度，连接的23号相反的前端反复的30号针头刺破针），"侧端口"，以便有效地吸入胸腔内的空气。
   然后此窗孔部从管的其余部分分离，由几个周4:0丝线缝合循环，这些循环的"塞子"，将作为最终锚固1.5厘米的孔的部分的胸腔内。
3. 颈静脉导管。两个15厘米长的PE管（Intramedic，内径0.28毫米，外直径0.61毫米）被切断。甲手术刀用于锥的管的端部，从而增加易用性静脉穿刺。油管冲洗1ml注射器经由含有6％150 kDa的葡聚糖溶液（在PBS中），连接到非斜削端的油管。
4. 胸壁窗口准备（图2）。切成一个椭圆形的形状（主轴线（6）厘米，短轴4厘米），透明聚偏膜（新吴裹，Kuresha，东京）。一个圆形的5毫米＃1盖玻片（BellcO）是贴的膜，使用α-氰基丙烯酸酯胶（Pattexflüssig，汉高，杜塞尔多夫）。
5. 气胸感应（"吹管"），10厘米长的管道（内径3毫米，外径为5毫米）的金属管被连接到一个5毫升的注射器的另一端将被用于将空气引入动物胸廓前胸壁窗口的植入。
6. 注射器的客观的水浸泡。甲23号针头连接到一个30毫升注射器含有蒸馏水。针尖钝化（使用金属文件），以防止损坏的目标。

2。鼠标麻醉

1. 鼠标是与氯胺酮（10毫克/毫升）和甲苯噻嗪（2毫克/毫升），腹膜内给药在每克小鼠体重的剂量为8微升的混合物麻醉。镇静发生在3 - 6分钟，，不应妨碍自主呼吸。
2. 使用一个电动剃须刀，刮脸的喉咙，胸部，腹部和右侧的鼠标。
3. 使用磁带，保证鼠标移动到一个薄薄的塑料菜板。头的鼠标指向的操作（ 图3）。温和的紧张所提供的上排牙齿缝线穿过下面的循环，以维持头部后仰。切割电路板放置在一个加热垫后，保持鼠标euthermia的气管切开术和静脉置管过程中。
4. 用100％乙醇的湿剃区域。
5. 确认适当的麻醉与尾/爪子掐。如果最小的响应，提供了一个额外的静脉推注氯胺酮/甲苯​​噻嗪，如果没有足够的麻醉。

3。气管切开术

1. 1厘米的切口，滑过喉咙。相关结缔组织解剖，唾液腺分离和侧面反映。前胸骨舌骨肌立即气管被切除。
2. 先进的下个4:0缝合的循环Ë气管（ 图4）。循环再切割，创建两个独立的缝合链相关的气管。将用于保护气管切开管的尾部缝合，颅缝将用于气管切开放置在气管上的紧张。
3. 用两个手指上的缝合线是掌握和温和的张力被施加到气管。一水平切口是在气管之间的上部和下部的缝线。这个切口交叉的气管周长大约三分之二。法兰气管切开术管（哈佛仪器，外径1.22毫米）的插入远端气管和到位的尾部气管缝合固定。
4. 气管切开术是连接到一个音量控制的小动物呼吸（吸气，哈佛仪器），和鼠标通风与吸入氧浓度40％和9毫升/公斤潮气量（设置优化，在我们的实验室，以维持足够的氧/通风）。位置在这一点上，郑颖人呼气末正压（PEEP）开始。值得注意的是，呼吸机设置应个别实验室内优化，以得天独厚的条件。冗余管（呼吸机管Y形连接件和气管）之间的不同的长度可以被用于调节死空间，从而确保稳定的肺泡通气量的任何选择的潮气量。

4。静脉插管

1. 的交界处的内部和外部的颈静脉，可以识别通过跟踪近侧远侧静脉分支。颈外下方发现所反映的唾液腺，这可以追溯到近端外部内部的颈交界处。
2. 使用温和的钝性分离，分离出颈交界处周围的结缔组织。
3. 使用4:0缝合，结扎颈外静脉和颈内静脉，颈交界处远端（颅）。
4. 做一个小切口进入隆突颈交界处出血，应是最小的。
5. 两根导管可以增量前进通过切口和进入颈中继线。温柔的愿望，以确保血液回流后，导管静脉内使用4:0缝合固定。
6. 磁带静脉导管的菜板，以防止意外坠下。

5。活体小鼠肺显微外科（改编自田渊等人^。18）

1. 菜板（含内敛，麻醉小鼠以及录音静脉的导管）转换到活体显微镜阶段，将进行剩余的外科手术。直肠温度探头放在这个接口的自适应加热系统（菜板下），允许鼠标euthermia维护。
2. 一个颈静脉导管连接到注射泵，提供了一个氯胺酮（10毫克/毫升） - 二甲苯胺噻嗪（2毫克/毫升）混合物在200微升每小时。再次证实了足够的麻醉尾/爪子掐。
3. 正中切口从颈部延伸至剑突的过程，进而向右侧的侧面（ 图5）。
4. 使用电，胸部的肌肉，露出胸廓。护理是采取措施，确保彻底止血。
5. 交叉鼠标的右后腿在左侧和磁带的。导致腹部的扭转旋转的胸部稍微，改进易用性的手术。
6. 将舞台上一个45度角（ 图6），这种定位使肺离心离德的胸壁一次引起气胸。
7. 的^第一肋（最低劣肋骨）的钳子与掌握，并提出一个弯钳直言不讳地推下的肋骨。这将壁层胸膜胸壁分离。胸膜保持unpunctured。
8. 使用喷吹管和注射器，空气被强行引入对壁层胸膜。这导致破裂的胸膜表面和气胸不损坏底层的肺的情况下。底层的肺将落在离胸壁，使引进的电烙镊子不破坏肺。在呼吸机的潮气量的减少通常不需要在这一步中。
9. 使用电烙镊子，解剖胸壁肌肉和跨越的^第 5和^第 6肋骨/壁层胸膜，1〜8毫米的圆孔到胸壁。至关重要的是，保持完全止血，出血的存在下将掩盖显微镜（ 图7）。
10. 使用针驱动程序，插入胸腔管进入胸腔壁孔。针应穿刺胸壁和退出胸腔胸窗口（ 图7）的下方及侧面。请小心不要刺破隔膜。 "管然后轻轻地拉出的胸壁，直到它的阻力发生从位于该管的窗孔部的边缘处的缝合线"挡块"。
11. 放置在舞台平坦。
12. 3厘米H _{2 O}呼气末正压呼吸机协助肺复张。
13. 胶（Pattex胶，汉高）放在圆周周围的胸部窗口。该膜附着，与玻璃盖玻片面临外部的胸腔。小心地（和圆周）近似的膜使用的棉签胶水。
14. 当执行一个肺招聘机动（3期间，潮气量呼气末正压呼吸机端口被挡住），-3毫米汞柱吸入被施加到胸腔引流管。应该坚持近似肺膜，而可自由移动在潮气通气（ 图8）期间。
15. 右前足的鼠标越过左侧，导致在左侧卧位的鼠标。海绵楔形件可以被用于正确地定位在鼠标使胸部窗口对准显微镜水浸物镜。
16. 盖玻片显微镜之前被放置在蒸馏水中，允许使用水浸物镜肺进行可视化。水将需要整个成像要间歇地补充。

6。肺血管内皮面层厚度的测量

1. 紧随胸壁封闭后，加入500μl的FITC-标记的150 kDa的葡聚糖（在PBS中的6％溶液），通过所述第二（非麻醉）的颈静脉导管给药。此丸剂作为容量复苏，以及为ESL测量血管示踪剂。右旋糖酐静脉推注不影响中性粒细胞或肺水肿的形成。
2. 水浸泡目标集中在盖玻片。客观的选择是至关重要的可视化ESL厚度，高数值的微小差异需要校准孔（> 0.8），同时仍保持2 - 3毫米的工作距离（允许穿透肺窗口和胸膜表面）。我们使用尼康CFI 75 LWD 16X（NA 0.8）和CFI 75 LWD 25倍（NA 1.1）的目标达到此目的。
3. 为了准确测量ESL厚度的移动器官，至关重要的是，明场和荧光血管宽度是同时进行的。这可通过使用图像分离器（双视图，配光），它允许同时捕获的反射光的微分干涉相差（DIC，明场）和FITC标记的图像（ 图9）。
4. 在5秒吸气暂停期间，连续执行成像和记录。后来，这些影像可能会审查，以确定对焦框。
5. 使用聚焦框，胸膜下微血管（直径<20微米）确定;，至少3微血管通常发现单个帧上。完成后的实验，DICFITC-葡聚糖血管宽度的测量（由不知情的观察者）的平均长度每微血管的三个相互垂直的拦截。假设等于ESL在容器的两个边缘的厚度，可以定义由一个DIC和FITC-葡聚糖，代表结果"一节中描述的血管宽度之差的一半的ESL大小。
6. 通常情况下，活体显微镜，可以进行90分钟，没有任何证据的肺损伤或低血压^2。在一段时间的观察，应进行初步试验，以确认鼠标的稳定性（血压，氧合，通气，肺损伤）。试验的药物可以通过在操作过程中的任何点处的第二（非麻醉）颈导管引入。

7。另一种测量肺血管内皮表面层的完整性

完整的内皮细胞表面层的功能（部分）排除circulat的元件从内皮表面^2。 ESL的完整性，因此，可以测量由循环元件的能力（ 例如，荧光微球）来访问和与细胞表面的粘附分子（如ICAM-1）进行交互。

1. 抗ICAM-1标记的荧光微球前准备手术。抗生蛋白链菌素被覆0.97微米荧光微球孵育与生物素化的抗ICAM-1（YN1/1.7.4克隆，1:50，eBioscience公司）在室温下的30分钟的抗体或同种型对照。微球洗涤三次，悬浮于PBS中在1×10 ⁹微球每毫升。
2. 在活体显微镜，微球的悬浮液（100微升）被注入到颈静脉导管。循环15分钟后，在5分钟内被捕获荧光图像。微动5分钟，被认为是贴壁和量化使用图像处理软件。

8。 "安乐死"

麻醉小鼠的程序完成后，直接通过心脏穿刺放血安乐死。安乐死的确认通过后，双侧气胸，肺部的收获和快速冷冻，以供日后分析。

结果

步骤1-6中所述的实验方法将允许同时DIC（明场）和荧光图像的多帧捕获。要确定ESL厚度，拍摄的影像进行审查的实验方案完成后，由不知情的观察者。使用聚焦框，胸膜下微血管（直径<20微米）确定至少3微血管通常是一个单一的帧（ 图10）上找到。用图像分析软件（NIS元素，尼康等），血管宽度的测量（由不知情的观察者）的平均长度每微血管的三个相互垂直的拦截。作为ESL是无?...

讨论

与体内显微镜扩大使用一致，有规模庞大的ESL以及其众多的血管功能的不断升值。然而，这些新兴的数据，主要来自全身血管的研究。事实上，在肺在体内显微镜技术挑战，由于显着的肺和心脏运动伪影。

一些最近的技术进步允许稳定的肺鼠标移动，给予活体技术更好地应用到肺微循环^12，13。然而，这些方法有可能混淆了肺动的生理后果。由于肺是目?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
			试剂名称
FITC-葡聚糖（150 kDa的）	西格玛	FD150S
TRITC-葡聚糖（150 kDa的）	西格玛	T1287
链霉亲和素包被荧光微球	刘海实验室	CP01F/10428	龙绿色荧光（类似FITC）
氯胺酮	摩尔医疗
二甲苯胺噻嗪	摩尔医疗
抗ICAM-1生物素化的抗体	eBioscience公司	克隆YN1/1.7。4	1:50稀释
同种生物素化抗体	eBioscience公司	IgG2b的eB149/10H5	1:50稀释
			设备
机械通气	哈佛设备	INSPIRA
气管切开导管	哈佛设备	730028
电灼设备	DRE医疗	Valleylab公司的SSE-2L
双极电凝钳	奥尔森医疗	10-1200I	9.9厘米麦弗逊
温度控器l系统	世界精密仪器	ATC1000
注射泵	哈佛设备	泵11精英
显微镜（怀德菲尔德）	尼康	LV-150
显微镜（聚焦）	尼康	A1R
图片分离器	光度	DV2
CCD相机	光度	CoolSNAP HQ2
图像处理软件	尼康	NIS元素
聚偏膜	吴WR美联社
圆形盖玻片	Bellco	5CIR-1-BEL	5毫米，厚度＃1
胶（盖玻片膜）	Pattex	flussig（液体）	盖上盖玻片膜
胶（盖玻片鼠标）	Pattex	凝胶	附加膜，鼠标
手术管件	Intramedic	PE50，PE10
缝合	费舍尔		4:0丝
电动剃须刀	奥斯特	78997
弯曲的手术钳	Roboz
直手术钳	Roboz
手术剪	Roboz
手术microscissors	Roboz
手术针驱动	Roboz
外科胶带	费舍尔
厨房海绵（切块）	各个