La mesure in vivo de la surface de la couche de souris pulmonaire endothéliale

Résumé

La couche de surface endothéliale glycocalyx / endothéliale est idéalement étudiées par microscopie intravitale. Microscopie intravitale est techniquement difficile dans un organe en mouvement, comme le poumon. Nous montrons comment fond clair simultanée et la microscopie à fluorescence peut être utilisée pour estimer endothéliale épaisseur de la couche de surface dans un mouvement libre- In vivo.

Résumé

Le glycocalyx endothéliale est une couche de protéoglycanes et des glycosaminoglycanes associés qui tapissent la lumière vasculaire. In vivo, le glycocalyx est hautement hydraté, formant une couche de surface importante endothéliale (ESL) qui contribue au maintien de la fonction endothéliale. Comme le glycocalyx endothéliale est souvent aberrante in vitro et est perdue lors de standards techniques de fixation des tissus, l'étude de l'anglais langue seconde nécessite l'utilisation de la microscopie intravitale. Approcher au mieux la physiologie complexe de la microvascularisation alvéolaire, pulmonaire imagerie intravitale est idéalement réalisée sur un poumon librement en mouvement. Ces préparations, cependant, souffrent généralement d'un artefact de mouvement importante. Nous montrent comment à thorax fermé microscopie intravitale d'un poumon de souris librement mobile peut être utilisé pour mesurer l'intégrité glycocalyx par exclusion ESL de marquage fluorescent de haute masse moléculaire à partir de dextranes la surface endothéliale. Cette technique non reprise chirurgicale, qui nécessitefond clair simultanée et l'imagerie de fluorescence du poumon de souris, permet l'observation longitudinale de la microvascularisation subpleural sans preuve d'induire des lésions pulmonaires confusion.

Introduction

Le glycocalyx est une couche endothéliale extracellulaire de protéoglycanes et des glycosaminoglycanes associés qui tapissent le système vasculaire intima. In vivo, le glycocalyx est hautement hydraté, formant une couche de surface importante endothéliale (ESL) qui régule de nombreuses fonctions endothéliales, y compris la perméabilité aux fluides ^1, neutrophiles-endothélial ² adhérence, et la mécanotransduction de ³ contrainte de cisaillement du fluide.

Historiquement, le glycocalyx a été sous-estimée en raison de son aberrance dans des préparations cellulaires cultivées ^{4, 5} et sa dégradation pendant la fixation des tissus standard et de traitement ^6. L'utilisation croissante ⁷ de microscopie intravitale (microscopie in vivo, l'IVM) a coïncidé avec un intérêt scientifique accrue de l'importance de l'ESL à la fonction vasculaire lors de santé et de maladie. L'ESL est invisible à la microscopie optique et ne peuvent pas être facilement étiquetéin vivo, compte tenu de la propension des fluorescents glycocalyx de liaison des lectines pour provoquer l'agglutination RBC ⁸ et embolie pulmonaire fatale (observations non publiées). Plusieurs approches indirectes ont donc été développées pour en déduire l'épaisseur ESL (et, par extension, de l'intégrité glycocalyx) en non-mobiles lits vasculaires tels que les microcirculations crémastérien et mésentériques. Ces techniques comprennent la mesure des différences dans la vitesse de circulation de microparticules en tant que fonction de la distance de la membrane endothéliale (vélocimétrie par images de microparticules ⁹⁾ ainsi que la mesure de l'exclusion des encombrants à marquage fluorescent, des marqueurs vasculaires (par exemple les dextrans) à partir de la surface endothéliale (technique d'exclusion de dextrane ^{10, 11).} Parmi ces techniques, seule l'exclusion dextrane est capable d'estimer l'épaisseur ESL partir de mesures faites à un moment précis dans le temps. En mesurant simultanément largeurs vasculaires en utilisant la microscopie en fond clair (d'une largeur deexclusive de la "invisible" ESL) et microscopie à fluorescence d'un traceur vasculaire exclus de l'ESL, ESL épaisseur peut être calculée comme la moitié de la différence entre les largeurs vasculaires ^2.

L'utilisation d'une mesure instantanée de l'épaisseur de l'ESL est bien adapté pour l'étude du glycocalyx pulmonaire. Microscopie intravitale du poumon est difficile, étant donné la présence de mouvement significatif pulmonaire et cardiaque. Bien que les progrès récents permettent d'immobilisation des poumons de souris in vivo ^{12, 13,} des préoccupations existent quant à l'impact physiologique du poumon stase. L'immobilité du poumon est associé avec l'oxyde nitrique endothélial diminué de signalisation ^14, une voie de signalisation qui affecte à la fois l'adhésion des neutrophiles ¹⁵ et blessures pulmonaires ^16. De plus, l'immobilisation d'une zone de poumon expose entourant alvéoles mobiles à des forces de cisaillement nuisibles (dite "atelectrauma"), conformément aux concepts classiques physiologiques del'interdépendance alvéolaire ^17.

En 2008, Arata Tabuchi, Wolfgang Kuebler et ses collègues ont mis au point une technique chirurgicale qui permet pour la microscopie intravitale d'un poumon de souris librement mobile ^18. Artefact respiratoire résultant de cette technique peuvent être annulés par l'utilisation de l'imagerie à haute vitesse, y compris la mesure simultanée de clair et microscopie à fluorescence. Dans ce rapport, nous détaillons la façon instantanée imagerie exclusion dextrane peut être utilisé pour mesurer l'épaisseur ESL dans la microcirculation sous-pleurale d'un poumon de souris librement se déplacer, in vivo. Cette technique peut être facilement modifié pour déterminer glycocalyx fonction-spécifiquement, la capacité d'une intact ESL pour exclure des éléments circulant à la surface endothéliale. Nous avons récemment utilisé ces techniques pour déterminer l'importance de l'intégrité ESL pulmonaire à l'élaboration d'une lésion pulmonaire aiguë au cours de maladies systémiques inflammatoires telles que la septicémie ^2.

Protocole

1. Préparation des tubes chirurgicaux, cathéters vasculaires, Fenêtre paroi thoracique

1. Stade de microscopie intravitale. Nous fabriqués sur mesure un stade plexiglas sur laquelle la souris anesthésiée se trouve en microscopie. Cette étape peut accueillir deux de 15 cm par 10 cm en plastique Planche à découper flexible (sur lequel se trouve la souris lors de l'induction de l'anesthésie, le placement trachéotomie, et cathétérisme veineux) ainsi qu'un élément chauffant de taille similaire (situé sous la planche à découper).
2. Préparation de la souris thoracostomie (Figure 1). Une longueur de 10 cm PE 50 tubes (Intramedic, diamètre interne 0,58 mm, 0,965 mm de diamètre extérieur) est coupée. Une extrémité est fixée à l'extrémité émoussée d'une aiguille de calibre 23 incurvée; cette aiguille sera utilisé pour passer le tube à travers la paroi thoracique (intérieur → extérieur) avant la fermeture de la fenêtre thoracique.
   L'extrémité distale du tube (1,5 cm de longueur, en face de la jauge 23 en annexel'aiguille) est répétée percé par une aiguille de calibre 30, de créer des «ports secondaires" pour faciliter l'aspiration d'air efficace intrathoracique.
   Cette partie fenêtrée est ensuite séparée du reste du tube par plusieurs boucles circonférentielles de suture en soie 04:00; ces boucles se servir de "bouchon", en fin de compte d'ancrage les 1,5 cm fenêtrée partie à l'intérieur de la cavité thoracique.
3. Cathéters veineux jugulaires. Deux 15 longueurs de cm de tube PE 10 (Intramedic, diamètre intérieur 0,28 mm, diamètre extérieur 0,61 mm) sont coupés. Un scalpel est utilisé pour biseauter les extrémités du tube, augmentant ainsi la facilité de ponction veineuse. Le tube est vidé par l'intermédiaire d'une seringue de 1 ml contenant 6% de dextrane 150 kDa solution (dans du PBS) fixé à l'extrémité non biseautée de la tubulure.
4. Préparation fenêtre de la paroi thoracique (figure 2). Transparent membrane de polyvinylidène (New Kure Wrap, Kuresha, Tokyo) est découpée en une forme ovale (grands axes 6 cm, petit axe 4 cm). Une circulaire n ° 5 n ° 1 lamelle (Bellco) est fixé sur la membrane en utilisant α-cyanoacrylate colle (Pattex flüssig, Henkel, Düsseldorf).
5. . Tube d'induction pneumothorax ("tube de soufflage") A 10 cm de longueur de tube (diamètre intérieur 3 mm, 5 mm de diamètre extérieur) est fixée à une seringue de 5 ml; l'extrémité opposée est utilisée pour introduire de l'air dans la cage thoracique pour animaux avant la prise de greffe fenêtre de la paroi thoracique.
6. Seringue pour immersion dans l'eau de l'objectif. Une aiguille de calibre 23 est fixée à une seringue contenant 30 ml d'eau distillée. La pointe de l'aiguille est émoussée (en utilisant un fichier de métal) en vue d'éviter tout dommage à l'objectif.

2. Anesthésie souris

1. Une souris est anesthésiés avec un mélange de kétamine (10 mg / ml) et de xylazine (2 mg / ml), administrée par voie intrapéritonéale à la dose de 8 pi par rapport au poids du corps de la souris gramme. La sédation survient dans les 3 - 6 min et ne doit pas gêner la respiration spontanée.
2. Utiliser un rasoir électrique, de se raserla gorge, la poitrine, l'abdomen, et le côté droit de la souris.
3. Avec du ruban, fixez la souris sur une planche à découper en plastique mince. Le chef de la souris doit être dirigé vers l'opérateur (figure 3). Tension douce fourni par une boucle de fil de suture passant sous les dents du haut sert à maintenir la tête d'extension. La planche à découper est placé sur un coussin chauffant, le maintien euthermia souris pendant la trachéotomie et la pose du cathéter veineux.
4. Zones mouillées rasé avec de l'éthanol à 100%.
5. Confirmer une anesthésie adéquate avec un pincement de la queue / patte. Procéder si la réponse minimale; fournir un bolus supplémentaire de kétamine / xylazine s'il n'est pas convenablement anesthésié.

3. Trachéotomie

1. Une incision de 1 cm est faite sur la gorge. Tissu conjonctif sous-jacent est disséqué, et les glandes salivaires sont séparés et réfléchis latéralement. Le muscle sterno immédiatement antérieure à la trachée est réséqué.
2. Une boucle de suture 04h00 est avancé sous ee trachée (figure 4). La boucle est alors coupée, ce qui crée deux brins séparés de fil de suture sous-tendent la trachée. Le fil de suture caudale est utilisé pour fixer la canule de trachéotomie, le fil de suture crânienne sera utilisé pour fournir une tension sur la trachée lors de la pose de trachéotomie.
3. À l'aide de deux doigts, le fil de suture est saisie et supérieure tension douce est appliqué sur la trachée. Une incision horizontale est pratiquée dans la trachée entre majuscules et minuscules points de suture. Cette incision doit traverser environ les deux tiers de la circonférence trachéale. Un tube de trachéotomie à bride (Harvard Apparatus, 1,22 mm de diamètre extérieur) est inséré dans la trachée distale et fixé en place à l'aide du fil de suture caudale trachéale.
4. La trachéotomie est relié à un respirateur à volume contrôlé de petits animaux (Inspira, Harvard Apparatus), et la souris est ventilé avec de l'oxygène inspiré à 40% et de 9 ml / kg volumes courants (paramètres optimisés pour maintenir une oxygénation adéquate / ventilation dans notre laboratoire). Positive pression expiratoire (PEEP) n'est pas commencé à ce moment. Fait à noter, les réglages du ventilateur devrait être optimisé pour les conditions uniques au sein de différents laboratoires. Différentes longueurs de tubes redondant (interposé entre la tubulure du ventilateur connecteur en Y et trachéotomie) peut être utilisé pour ajuster l'espace mort, assurer une ventilation alvéolaire stable pour un volume choisi de marée.

4. Cathétérisme veineux

1. La jonction de la veine jugulaire interne et externe peuvent être identifiés par le suivi des branches veineuses distales proximale. La veine jugulaire externe se trouve en dessous des glandes salivaires reflétées, ce qui peut être tracée proximale de trouver la jonction externe jugulaire interne.
2. Utilisez douce dissection de séparer la jonction jugulaire du tissu environnant conjonctif.
3. Utilisant des sutures 4:0, attacher les jugulaires externes et internes veines jugulaires distales (crânienne) à la jonction jugulaire.
4. Faire une petite incision dans la carènede la jonction jugulaire, des saignements devraient être minimes.
5. Deux sondes peuvent être progressivement avancé à travers l'incision dans le tronc et jugulaire. Après une légère aspiration pour assurer le retour du sang, cathéters sont fixés dans la veine utilisant des sutures 04h00.
6. Cathéters veineux bande à la planche à découper pour empêcher contre tout déplacement accidentel.

5. Intravitale chirurgie Microscopie souris pulmonaire (adapté de Tabuchi et al. ¹⁸⁾

1. La planche à découper (contenant la retenue, souris anesthésiée ainsi que des cathéters veineux soudées) est passée à l'étape de la microscopie intravitale, où les interventions chirurgicales restantes seront effectuées. Une sonde de température rectale est placé; ces interfaces d'un système de chauffage d'adaptation (situé sous la planche à découper), ce qui permet l'entretien de euthermia souris.
2. Un cathéter jugulaire est fixée à une pompe à seringue qui fournit un kétamine (10 mg / ml)-xylazine (2 mg / ml)mélange à 200 ul par heure. Une anesthésie adéquate est de nouveau confirmée par la queue / patte de pincement.
3. L'incision médiane est prolongée du cou à l'appendice xiphoïde, puis de procéder latéralement vers la droite (figure 5).
4. À l'aide d'électrocautérisation, la musculature thoracique est enlevé, l'exposition de la cage thoracique. Des précautions sont prises pour assurer une hémostase complète.
5. Traversez patte arrière droite de la souris sur le côté gauche et du ruban adhésif. La torsion résultant abdominale tourne légèrement le thorax, l'amélioration de la facilité de la chirurgie.
6. Placez la scène à un angle de 45 degrés (figure 6), ce qui permet le positionnement du poumon à se détacher de la paroi thoracique lorsque le pneumothorax est induite.
7. La nervure 1 ^er (côte la plus inférieure) est saisi avec une pince et a grandi; une pince courbe est carrément poussé au-dessous de la nervure. Cela sépare plèvre pariétale de la paroi thoracique. La plèvre doit rester non perforé.
8. Utilisation du tube de soufflage etune seringue, l'air est introduit de force contre la plèvre pariétale. Ce qui conduit à la rupture de la surface de la plèvre et sans endommager le pneumothorax pulmonaire sous-jacente. Le pulmonaire sous-jacente tombera loin de la paroi thoracique, permettant l'introduction d'une pince électrocautérisation sans endommager les poumons. Une diminution du volume de marée ventilateur n'est généralement pas nécessaire au cours de cette étape.
9. En utilisant des pinces électrocoagulation, disséquer la musculature de la paroi thoracique et recoupent les 5 ^ème et 6 ^ème côtes / plèvre pariétale, faire un trou de 8 mm ~ circulaire dans la paroi thoracique. Il est essentiel que l'hémostase complète sera maintenue, que la présence d'une hémorragie va masquer la microscopie (figure 7).
10. L'utilisation d'un pilote de l'aiguille, insérez le tube dans le trou thoracostomie paroi thoracique. L'aiguille doit percer la paroi thoracique et sortir de la cavité thoracique inférieure et latérale de la fenêtre thoracique (figure 7). Prenez soin de ne pas percer la membrane. LaElle est ensuite lentement tiré de la paroi thoracique jusqu'à ce qu'il se produit une résistance de la suture "bouchon" situé à l'extrémité de la portion du tube troué.
11. Placez le stade plat.
12. Ajouter 3 cm H ₂ O PEP au ventilateur pour aider à aider poumon réexpansion.
13. Colle (Pattex gel, Henkel) est placé de manière circonférentielle autour de la fenêtre poitrine. La membrane est fixée, avec la lamelle de verre tournée vers l'extérieur de la cavité thoracique. Soigneusement (et circonférentiellement) approximative de la membrane à l'aide d'un applicateur de colle coton.
14. Tout en effectuant une manoeuvre de recrutement alvéolaire (3 volumes courants au cours de laquelle l'orifice de ventilation est obstruée PEEP), -3 mm Hg aspiration est appliquée au tube poitrine. Le poumon devrait persistante approximative de la membrane tout en se déplaçant librement lors de la ventilation de marée (Figure 8).
15. La patte antérieure droite de la souris est traversée sur le côté gauche, ce qui entraîne une position de décubitus latéral gauche de la souris.Cales éponge peut être utilisé pour positionner correctement la souris pour la fenêtre de la poitrine est aligné avec l'objectif à immersion microscopie eau.
16. De l'eau distillée est placé sur la lamelle avant microscopie, ce qui permet la visualisation du poumon en utilisant un objectif à immersion d'eau. L'eau devra être rempli par intermittence tout au long de l'imagerie.

6. Mesure de l'épaisseur de la couche endothéliale pulmonaire Surface

1. Immédiatement après la fermeture de la paroi thoracique, 500 ul marqué au FITC 150 kDa (solution à 6% dans du PBS) dextran est administrée via le cathéter veineux secondes (non anesthésie) jugulaire. Ce bolus sert de réanimation volume ainsi que le traceur vasculaire pour ESL mesure. Le bolus dextrane n'influence pas l'adhésion des neutrophiles ou la formation d'oedème pulmonaire ^2.
2. L'objectif à immersion d'eau est centrée sur la lamelle. Le choix de l'objectif est essentielle à visualiser de petites différences d'épaisseur ESL, une grande Numerical ouverture est nécessaire (> 0,8) tout en conservant un 2 à 3 mm de distance de travail (permettant la pénétration à travers la fenêtre du poumon et de la plèvre surface). Nous utilisons le Nikon CFI 75 LWD 16x (NA 0,8) et CFI 75 LWD 25x (NA 1,1) objectifs à cet effet.
3. Pour mesurer avec précision l'épaisseur ESL dans un organe en mouvement, il est essentiel que clair et fluorescentes largeurs vasculaires sont réalisées simultanément. Cela peut être accompli en utilisant une image (Dual View, Photometrics) de séparation qui permet la capture simultanée de contraste interférentiel différentiel reflète la lumière (DIC, fond clair) et des images FITC (figure 9).
4. Au cours d'une pause de 5 secondes inspiratoire, l'imagerie continue est jouée et enregistrée. Plus tard, ces images peuvent être examinés pour déterminer zones mises au point.
5. L'utilisation d'un cadre de mise au point, sous-pleurale microvaisseaux (diamètre
6. En règle générale, la microscopie intravitale peut être effectuée pour> 90 min sans aucune preuve de lésions pulmonaires ou d'hypotension ^2. Des expériences préliminaires doivent être effectuées pour confirmer la stabilité de la souris (pression sanguine, oxygénation, ventilation, les lésions pulmonaires) au cours de la période d'observation. Médicaments expérimentaux peuvent être introduits par le second cathéter (non-anesthésique) jugulaire à tout moment de la procédure.

7. Mesure alternative de l'intégrité pulmonaire surface endothéliale couche

Les fonctions endothéliales intactes couche de surface (en partie) d'exclure circulanttion des éléments de la ² surface endothéliale. ESL intégrité peut donc être mesurée par la capacité d'un élément de circulation (par exemple une microsphère fluorescente) pour ouvrir et interagir avec des molécules d'adhérence de surface des cellules (telles que ICAM-1).

1. Anti-ICAM-1 marqué fluorescent microsphères sont préparées avant la chirurgie. Tapissées de streptavidine 0,97 um microsphères fluorescentes sont incubées avec des anticorps biotinylé de contrôle ou isotype anti-ICAM-1 (YN1/1.7.4 clone, 1:50, eBioscience) pendant 30 min à température ambiante. Les microsphères sont lavées trois fois dans du PBS et mises en suspension à 1 x 10 ⁹ par ml microsphères.
2. Au cours de la microscopie intravitale, la suspension de microsphères (100 pi) est injecté dans le cathéter veineux jugulaire. Après 15 min de la circulation, des images fluorescentes sont capturés pendant 5 min. Immobile pendant> 5 min microsphères sont considérés comme adhérent et quantifiée en utilisant un logiciel de traitement d'image.

8. Euthanasie

Après l'achèvement de la procédure, des souris anesthésiées sont euthanasiés par exsanguination par ponction cardiaque directe. L'euthanasie est confirmée par pneumothorax bilatéraux avant que les poumons sont prélevés et congelés composant logiciel enfichable pour une analyse ultérieure.

Résultats

L'approche expérimentale décrite dans les étapes 1-6 permettra la capture de trames multiples du DIC simultanée (fond clair) et des images fluorescentes. Pour déterminer l'épaisseur ESL, les images enregistrées sont examinés par un observateur en aveugle après la fin du protocole expérimental. L'utilisation d'un cadre de mise au point, sous-pleurale microvaisseaux (diamètre (Figu...

Discussion

Coïncidant avec l'utilisation croissante de microscopie in vivo, on apprécie plus en plus à la fois pour la taille importante de l'ESL ainsi que ses nombreuses contributions à la fonction vasculaire. Ces nouvelles données, cependant, sont essentiellement issus des études de la vascularisation systémique. En effet, l'utilisation de la microscopie in vivo dans les poumons est techniquement difficile, étant donné artefact important mouvement pulmonaire et cardiaque. ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Nom du réactif
FITC-dextran (150 kDa)	Sigma	FD150S
TRITC-dextran (150 kDa)	Sigma	T1287
Tapissées de streptavidine microsphères fluorescentes	Bangs Laboratories	CP01F/10428	Green Dragon fluorescence (semblable au FITC)
La kétamine	Moore Medical
Xylazine	Moore Medical
Anti-ICAM-1 anticorps biotinylé	eBioscience	Cloner YN1/1.7.4	Dilution 1:50
Isotype d'anticorps biotinylé	eBioscience	IgG2b eB149/10H5	Dilution 1:50
			ÉQUIPEMENT
Ventilateur mécanique	Harvard Apparatus	Inspira
Cathéter trachéotomie	Harvard Apparatus	730028
Appareil électrocautérisation	DRE médicale	Valleylab SSE-2L
Cautérisation bipolaire pince	Olsen médicale	10-1200i	9.9cm McPherson
Température control Système	World Precision Instruments	ATC1000
Pompe à seringue	Harvard Apparatus	Pompe 11 Elite
Microscope (grand champ)	Nikon	LV-150
Microscope (confocale)	Nikon	A1R
Image Splitter	Photométrie	DV2
Caméra CCD	Photométrie	CooISNAP HQ2
Logiciel de traitement d'image	Nikon	Éléments NIS
Membrane de polyvinylidène	Kure Wrap
Lamelle circulaire	Bellco	5CIR-1-BEL	5 mm, épaisseur 1 #
Colle (lamelle à membrane)	Pattex	Flüssig (liquide)	Pour fixer lamelle de membrane
Colle (lamelle de la souris)	Pattex	Gel	Pour la fixation de la membrane de la souris
Tubes chirurgicaux	Intramedic	PE50, PE10
Suturer	Pêcheur		Soie 04:00
Rasoir électrique	Oster	78997
Courbes pinces chirurgicales	Roboz
Droites pinces chirurgicales	Roboz
Ciseaux chirurgicaux	Roboz
Microciseaux chirurgicales	Roboz
D'entraînement d'aiguille chirurgicale	Roboz
Ruban chirurgical	Pêcheur
Éponges de cuisine (coupé en quartiers)	divers