マウス肺内皮表面層の in vivo測定における

要約

内皮グリコカリックス/内皮表面層は、理想的には生体顕微鏡を用いて研究されています。生体顕微鏡検査は、肺などの臓器に移動技術的に困難である。私たちは、同時明視野と蛍光顕微鏡を自由に移動させる際に内皮表面層の厚さを推定するために使用することができる方法を示していマウス肺。

要約

内皮グリコカリックスは、血管の内腔を裏打ちするプロテオグリカンおよび関連するグリコサミノグリカンの層である。 生体内では 、グリコカリックスは、内皮機能の維持に寄与する実質的な内皮表面層（ESL）を形成し、高度に水和される。内皮グリコカリックスはしばしばin vitroでの異常であり、標準的な組織固定技術の間に失われているように、ESLの研究では、生体顕微鏡を使用する必要があります。肺胞毛細血管の最良近似複雑な生理機能に、肺の生体内イメージングは​​、理想的には自由に動いて肺に実行されます。これらの製剤は、しかし、一般的に大規模なモーションアーチファクト苦しむ。我々は自由に動いてマウス肺の開胸生体顕微鏡が内皮表面から蛍光標識された高分子量デキストランのESLの除外を介して糖衣の整合性を測定するために用いることができる方法を示しています。必要な場合に、この非回復手術手技、同時明視野とマウス肺の蛍光イメージングは​​、交絡肺損傷を誘発する証拠がなく胸膜下の微小血管系の長期的観察が可能になります。

概要

内皮グリコカリックスは、血管内膜を裏打ちするプロテオグリカンおよび関連するグリコサミノグリカンの細胞外の層です。 生体内では、グリコカリックスは、高度に水和され、流体透過性^1を含む内皮様々な機能を調節する実質的な内皮表面層（ESL）を形成し、好中球の内皮接着^2、および流体せん断応力³のメカノ。

歴史的に、グリコカリックスは、標準的な組織固定し、処理⁶時に培養された細胞調製^4,5、およびその分解に起因し、そのaberranceに過小評価されています。増加は生体顕微鏡の^7（ 生体顕微鏡検査で 、IVM）を使用し、健康と病気の間に血管機能にESLの重要性の高まり科学的関心と一致した。 ESLは、光学顕微鏡には見えませんし、簡単にラベルを付けることができません赤血球凝集⁸と致命的な肺塞栓（未発表の観察）を引き起こす蛍光グリコカリックス結合レクチンの性癖与えられたin vivoで、。いくつかの間接的なアプローチは、したがって、そのような精巣挙筋および腸間膜microcirculationsとして非移動血管床にESLの厚さ（と、拡張による、グリコカリックスの整合性）を推定するために開発されている。これらの技術は、内皮細胞膜（微粒子画像流速^9）と同様に内皮表面からかさばる、蛍光標識された血管マーカー（ 例えばデキストラン）の排除の測定からの距離の関数として微粒子速度を循環さの違いの測定を含む（デキストラン除外手法^{10、11）。}これらの技術のうち、デキストラン除外とは、ある一時点で測定した値からESLの厚さを推定することができる。同時に明視野顕微鏡（の幅を使用して血管の幅を測定することにより、"見えない" ESL）とESLから除外血管トレーサーの蛍光顕微鏡のclusive、ESLの厚さは、血管幅²間の半分の差として計算することができます。

ESLの厚さの瞬間的な尺度の使用は肺糖衣の研究に適しています。肺の生体顕微鏡検査は重要な肺と心臓の動きのアーチファクト与えられ、やりがいがあります。最近の進歩は 、in vivo ^12、13 にマウス肺の固定化を可能にしているが、懸念は、肺うっ血の生理学的影響について存在する。肺の不動は^14のシグナリング減少内皮一酸化窒素、好中球の接着¹⁵と肺損傷^16の両方に影響を与えるシグナル伝達経路に関連付けられています。さらに、肺の面積の固定化は、古典的な生理学的な概念による有害なせん断力（ "atelectraumaいわゆる"）にモバイル胞を取り巻く公開肺胞の相互依存^17。

2008年、磯崎田淵、ヴォルフガング·キューブラーらが自由に動いてマウス肺¹⁸の生体内顕微鏡を可能にする手術法を開発しました。この手法から生じる呼吸アーティファクトは明と蛍光顕微鏡の同時測定など、高速イメージングの使用によって否定することができます。瞬時デキストラン除外イメージングは、生体内で 、自由に行動しているマウス肺の胸膜下微小循環のESLの厚さを測定するために用いることができる方法このレポートでは、我々は詳細。この手法は、簡単に、糖衣機能特異内皮表面から循環要素を除外するために無傷ESLの能力を決定するように変更できます。我々は最近、敗血症²などの全身性炎症性疾患時の急性肺損傷の発展に肺ESLの保全の重要性を決定するためにこれらの技術を使用している。

プロトコル

1。手術チューブ、血管カテーテル、胸壁窓の調製

1. 生体顕微鏡ステージ。我々は麻酔マウスが顕微鏡の間にあるその上にプレキシガラスステージをカスタムメイド。このステージは、10cmフレキシブルなプラスチックまな板（マウスが麻酔導入、気管切開の配置、および静脈カテーテル中にあるその上に）だけでなく、同​​様のサイズの発熱体（まな板の下に位置する）で15 CMの両方に対応しています。
2. マウス胸腔チューブの調製 （ 図1）。 PE50チュービング（Intramedic、内径0.58ミリメートル、外径0.965ミリメートル）の10 cmの長さをカットしています。一端が湾曲した23ゲージの針の鈍端部に取り付けられ、この針は、胸部窓の閉鎖の前胸壁（→外側内側）からチューブを渡すために使用されます。
   チューブの先端（長さ1.5cm、付属の23ゲージに反対針）が繰り返し胸腔内の空気の効果的な吸引を容易にする "サイドポート"を作成し、30ゲージ針によって穿刺されています。
   この有窓部分は、その後4時絹縫合糸のいくつかの円周ループによってチューブの残りの部分から分離され、これらのループは、最終的には胸腔内に穿破部分を1.5 cmのアンカー、 "ストッパー"として機能します。
3. 頸静脈カテーテルは、PEチューブ10（Intramedic、内径0.28ミリメートル、外径0.61ミリメートル）の2つの15cmの長さがカットされています。メスはそれによって静脈穿刺の容易さを増加させる、ベベルに管の端部に使用されます。チューブはチューブの非面取り端部に取り付けられた6パーセント150 kDaのデキストラン溶液（PBS中）を含む1mlシリンジを介してフラッシュされます。
4. 胸壁ウィンドウ準備します（図2）。透明ビニリデン膜（新呉ラップ、Kuresha、東京）が楕円形（長径6cmの短径4cm）ににカットされる。円形の5ミリメートル第1カバースリップ（Bellco）は、α-シアノアクリレート系接着剤を用いた膜（Pattexflüssig、ヘンケル、デュッセルドルフ）に貼付されています。
5. 気胸の誘導のためのチューブ（ "ブロー管"）チューブの長さ10cm（内径3mm、外径5 mm）を5mlの注射器に接続されている;反対側の端部は、動物の胸郭内に空気を導入するために使用されます胸壁ウィンドウ移植に先立って。
6. 目的の水浸用注射器23ゲージの針を蒸留水を含む30mlの注射器に取り付けられています。針の先端が目的の損傷を防止するために、（金属·ファイルを使用して）平滑末端化されています。

2。マウスの麻酔

1. マウスは、グラムマウス体重当たり8μlの用量で腹腔内投与しケタミン（10 mg / ml）とキシラジン（2 mg / ml）を混合物で麻酔です。鎮静は3内で発生 - 6分と自発呼吸を妨げてはならない。
2. 電気かみそりを使用して、ひげをそる喉、胸部、腹部、マウスの右側。
3. テープを使用して、薄いプラスチックのまな板にマウスを固定します。マウスの頭部は、オペレータ（ 図3）に向かって指している必要があります。上の歯の下を通過縫合糸のループが提供する穏やかな緊張が頭拡張を維持するように働く。まな板は、気管切開、静脈カテーテル留置中にマウスの覚醒を維持し、加熱パッドの上に置かれている。
4. 100％エタノールでウェット剃りエリア。
5. テール/足ピンチで十分な麻酔を確認します。最小応答場合の処理​​;ケタミン/キシラジンの余分なボーラス十分に麻酔していない場合を示します。

3。気管開口術

1. 1cmの切開が喉を介して行われます。下層の結合組織を切開され、唾液腺を分離し、横方向に反映されます。気管のすぐ前方胸骨舌骨筋を切除されています。
2. 四時縫合糸のループが目の下に進められる電子気管（ 図4）。ループは、気管の根底に縫合糸の2つの別々の鎖を作成し、切断されている。尾縫合糸は、気管切開チューブを固定するために使用されます;頭蓋縫合は気管切開の配置中に気管の張力を提供するために使用されます。
3. 2本の指を使用して、上部の縫合が把握されており、穏やかな張力が気管に適用されます。水平切開は、上下糸の間の気管内に作られています。この切開は気管の円周の約3分の2を越える必要があります。フランジ付き気管切開チューブ（ハーバード装置、1.22ミリメートル外径）は、遠位気管に挿入し、尾気管縫合糸を用いて、所定の位置に固定されています。
4. 気管切開は、ボリューム制御の小動物ベンチレーター（インスピラ、ハーバード装置）に接続されており、マウスは40％吸入酸素と9 ml / kgを一回換気量（設定は我々の研究室では十分な酸素/換気を維持するために最適化された）で換気される。ポジtive呼気終末陽圧（PEEP）がこの時点で始まっていません。注目すべきは、人工呼吸器の設定は、個々の研究室の中でユニークな条件に最適化する必要があります。冗長チューブ（人工呼吸器のチューブをYコネクタと気管切開の間に介在さ）の異なる長さは任意の選択された一回換気量の安定した肺胞換気量を確保し、デッドスペースを調整するために使用することができます。

4。静脈カテーテル法

1. 内部および外頸静脈の接合部は、近位、遠位静脈枝を追跡することによって同定することができる。外頸静が反映唾液腺の下に発見されたが、これは外部頸静接合を見つけるために近位にさかのぼることができます。
2. 周囲結合組織から頸静接合を分離するために穏やかな鈍的切開を使用しています。
3. 四時の縫合糸を使用し、頸静脈に合流（頭蓋）遠外頸静脈と頸静脈を結紮する。
4. 気管分岐部に小切開を加える頸静接合の、出血は最小限であるべきです。
5. 2つのカテーテルは、増分切開を通して、頸静脈幹に前進させることができる。返血を確実にするために穏やかな吸引後、カテーテルは午前4時の縫合糸を用いて静脈内に固定される。
6. テープ静脈偶発脱落を防止するには、まな板にカテーテル。

5。生体マウス肺顕微鏡手術（田渕らから適応^18）

1. まな板は（拘束、麻酔マウスと同様にテープ静脈カテーテルを含む）残りの外科的介入が実行される生体顕微鏡のステージに移行します。直腸温度プローブが配置され、このインタフェースを適応加熱システム（まな板の下にあります）で、マウスの覚醒の維持を可能にします。
2. 一頚静脈カテーテルはケタミン（10 mg / ml）を、キシラジン（2 mg / ml）を実現し、シリンジポンプに接続されている時間当たり200μlで混合。十分な麻酔が再びテール/足ピンチを使用して確認された。
3. 正中切開します（ 図5）の右側に横方向に進む、xyphoidプロセスに首から拡張されています。
4. 電気メスを使用して、胸の筋肉は胸郭を露出して、削除されます。ケアは、完全な止血を確実にするために取られる。
5. ダウン左側とテープの上にマウスの右hindlegを渡ります。その結果腹部ねじり、手術のしやすさを向上させ、わずかに胸部を回転させます。
6. 45度の角度（ 図6）でステージを配置し、この位置では、気胸が誘導されると、肺は胸壁から落下することができます。
7. ¹回目^のリブ（最も劣っリブ）が鉗子で把持して上昇させ、湾曲した鉗子はぶっきらぼうに肋骨の下に押し込まれる。これは胸壁から壁側胸膜を分離します。胸膜はunpuncturedままにしてください。
8. ブローチューブとを用いて注射器、空気が強制的に壁側胸膜に対して導入される。これは、基礎となる肺を損傷することなく、胸膜表面と気胸の破裂につながります。基盤となる肺は、肺を損傷することなく、電気メス、鉗子の導入を可能にする、胸の壁から落下します。人工呼吸換気量の減少は、通常、このステップの間に必要とされない。
9. 電気メス、鉗子を使用して、胸壁の筋肉組織を解剖し、胸壁に〜8ミリメートル円形の穴を開け、5 ^番目と6 ^番目のリブ/壁側胸膜を横切る。出血の存在は顕微鏡（ 図7）が不明瞭になりますようにそれは、完全な止血を維持することが不可欠です。
10. 針ドライバを使用して、胸壁の穴に胸腔ドレーンを挿入します。針は、穿刺胸壁と胸郭ウィンドウ（ 図7）に劣ると横胸腔を終了する必要があります。ダイアフラムを刺さないように注意してください。ザその抵抗は、管の有窓部の縁に位置して縫合糸 "ストッパ"から発生するまでチューブをゆっくり胸壁から引き出される。
11. ステージは平坦な場所。
12. 肺reexpansionを役立てるための人工呼吸器から3cm H ₂ OのPEEPを追加します。
13. 接着剤（Pattexゲル、ヘンケル）は胸ウィンドウの周りに円周に配置されます。膜が胸腔に外部に面するガラスカバースリップと、装着されている。慎重に（と円周方向に）おおよその綿棒を使用して接着剤への膜。
14. 肺リクルートメント手技（PEEPの換気装置のポートが閉塞​​されている間の3回換気量）を実行している間、-3ミリメートルHgの吸引は胸管に適用されます。肺は自由に潮換気（ 図8）の間に移動させながら、持続的に近似膜べき。
15. マウスの右前足は、マウスの左側臥位で、その結果、左側に渡っています。スポンジウェッジは胸ウィンドウが顕微鏡水浸対物レンズと位置合わせされるように適切にマウスを配置するために使用することができます。
16. 蒸留水は、水浸対物レンズを用いた肺の可視化を可能にする、顕微鏡の前にカバースリップ上に配置されます。水が断続的にイメージングを通して補充する必要があります。

6。肺内皮表面層の厚さの測定

1. 直ちに胸壁閉鎖後、500μlのFITC標識150 kDaのデキストラン（PBS中6％溶液）を第二（非麻酔）頚静脈カテーテルを介して投与される。このボーラスは、ボリューム蘇生だけでなく、ESLの測定のための血管トレーサーとして機能します。デキストランボーラスは、好中球の接着や肺浮腫形成^2には影響^しません。
2. 水浸対物レンズは、カバーガラスの上中央に配置されます。目標の選択が不可欠である-ESLの厚さのわずかな違いは、高numeriを視覚化まだ2を維持したままCAL絞りが（> 0.8）が必​​要です - 3 mmの作動距離（肺ウィンドウおよび胸膜表面の貫通が可能）。我々は、この目的のためにニコン、CFI 75 LWD 16倍（NA 0.8）とCFI 75 LWD 25倍（NA 1.1）の目標を使用しています。
3. 正確に動く臓器のESLの厚さを測定するためには、明視野、蛍光血管の幅が同時に行われることが不可欠である。これは、反射光微分干渉コントラスト（DIC、明視野）およびFITC画像（ 図9）の同時キャプチャが可能イメージスプリッタ（デュアルビュー、Photometrics）を使用して達成することができる。
4. 5秒吸気ポーズ中、連続撮影が行われ、記録されます。後で、これらの画像は合焦フレームを識別するために見直される可能性があります。
5. 合焦枠、胸膜下の微小血管を（<20μmの直径）を使用すると、識別され、少なくとも3つの微小血管は、通常、単一のフレーム上に発見されています。実験終了後、DICとFITC-デキストラン血管の幅が微小血管ごとに3つの垂直切片の長さを平均化することにより、（盲検観察者による）を測定する。代表的な結果セクションで説明したように、容器の両端に等しいESLの厚さを仮定して、ESLのサイズは、DICおよびFITC-デキストラン血管幅の間の半分の差によって定義することができます。
6. 通常、生体顕微鏡、肺傷害や低血圧²のいずれかの証拠もなしに> 90分間行うことができます。予備実験では、観測期間中にマウスの安定（血圧、酸素化、換気、肺傷害）を確認するために実行する必要があります。実験的な薬は、手順中のどの時点でも第二（非麻酔）頸静脈カテーテルを介して導入することができる。

7。肺内皮表面層の整合性の代替測定

無傷の内皮表面層の機能は、（部分的に）circulatを除外する内皮表面²から要素をING。 ESLの整合性は、したがって、細胞表面接着分子（ICAM-1など）にアクセスし、対話するための循環要素の能力（蛍光ミクロスフェアなど ）によって測定することができる。

1. 抗ICAM-1標識した蛍光マイクロスフェアは、手術前に用意されている。ストレプトアビジンでコーティングした0.97μmの蛍光マイクロスフェアは、室温で30分間、ビオチン化抗ICAM-1（YN1/1.7.4クローン、1:50、eBioscience社）抗体またはアイソタイプコントロールと共にインキュベートする。ミクロスフェアは、3回洗浄し、ml当たり1×10 ⁹ミクロスでPBSに懸濁する。
2. 生体顕微鏡検査の間に、マイクロスフェア懸濁液（100μl）を頚静脈カテーテルに注入される。循環の15分後、蛍光画像を5分かけて捕獲される。 > 5分間動かないマイクロスフェアは、付着し、画像処理ソフトを用いて定量化とみなされます。

8。安楽死

手続きが完了した後、麻酔したマウスは、直接心臓穿刺を介して放血により安楽死させています。安楽死は肺を後の分析のために採取して瞬間凍結されてからの二国間気胸を介して確認された。

結果

手順1-6で説明した実験的なアプローチは、同時DIC（明）と蛍光像の複数のフレームのキャプチャが可能になります。 ESLの厚さを決定するために、記録された画像は、実験プロトコルの完了後に盲検観察者によって審査されます。合焦フレームを使用して、胸膜下微小血管（<20μmの直径）が同定され、少なくとも3つの微小血管は、通常、単一のフレーム（ 図10）に発見されてい...

ディスカッション

生体顕微鏡検査での利用拡大と一致し、ESLの実質的な大きさだけでなく、血管機能への多くの貢献の両方の増加感謝があります。これらの新たなデータは、しかし、主に全身の血管系の研究から派生しています。確かに、肺で生体顕微鏡での使用は重大な肺と心臓の動きのアーチファクトを考えると、技術的に困難である。

最近のいくつかの?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
			試薬の名称
FITC-デキストラン（150 kDa）の	シグマ	FD150S
TRITC-デキストラン（150 kDa）の	シグマ	T1287
ストレプトアビジンでコーティングされた蛍光ミクロスフェア	前髪研究所	CP01F/10428	ドラゴングリーン蛍光（FITCに似ています）
ケタミン	ムーアメディカル
キシラジン	ムーアメディカル
抗ICAM-1抗体のビオチン化	eBioscience社	クローンYN1/1.7。4	1:50希釈
アイソタイプビオチン化抗体	eBioscience社	IgG2bでeB149/10H5	1:50希釈
			機器
人工呼吸器	ハーバード装置	インスピラ
気管切開カテーテル	ハーバード装置	730028
電気焼灼装置	DREの医療	のValleylab SSE-2L
バイポーラ焼灼鉗子	オルセンメディカル	10-1200I	9.9センチメートルマクファーソン
温度controlシステム	ワールド·精密機器	ATC1000
注射器ポンプ	ハーバード装置	ポンプ11エリート
顕微鏡（広視野）	ニコン	LV-150
顕微鏡（共焦点）	ニコン	A1R
イメージスプリッタ	Photometrics	DV2
CCDカメラ	Photometrics	CoolSNAP HQ2
画像処理ソフトウェア	ニコン	NISの要素
ビニリデン膜	呉WrをAP
円形のカバースリップ	ベルコ	5CIR-1-BEL	5ミリメートル、厚さ1位
接着剤（膜にスリップをカバー）	Pattex	Flussig（液体）	膜にカバースリップを固定するため
接着剤（マウスにスリップをカバー）	Pattex	ゲル	マウスに膜を取り付けるための
外科チューブ	Intramedic	PE50、PE10
縫合	フィッシャー		4時00絹
電気かみそり	オスター	78997
湾曲した外科手術用鉗子	Roboz
ストレート外科手術用鉗子	Roboz
手術用のハサミ	Roboz
外科microscissors	Roboz
外科用針ドライバ	Roboz
サージカルテープ	フィッシャー
キッチンスポンジ（ウェッジにカット）	さまざまな