Na medição in vivo da camada superficial do rato pulmonar endotelial

Resumo

A camada de superfície endotelial glicocálice / endotelial está idealmente estudada por microscopia intravital. Microscopia intravital é tecnicamente desafiante em um órgão em movimento, tais como o pulmão. Demonstramos como brightfield simultânea e microscopia de fluorescência pode ser utilizado para estimar a espessura da camada endotelial da superfície em um movimento livremente In vivo Pulmão do rato.

Resumo

O glycocalyx é uma camada endotelial de proteoglicanos e glicosaminoglicanos associados que revestem o lúmen vascular. In vivo, o glycocalyx é altamente hidratada, formando uma camada superficial substancial endotelial (ESL), que contribui para a manutenção da função endotelial. À medida que o glicocálice endotelial é muitas vezes aberrante in vitro e é perdida durante as técnicas de fixação de tecidos normais, o estudo do ESL requer o uso de microscopia intravital. Para melhor a fisiologia do complexo aproximado da microvasculatura alveolar, imagens intravital pulmonar está idealmente realizada em um pulmão livremente movimento. Estas preparações, no entanto, geralmente sofrem de artefacto de movimento extensivo. Demonstramos como de tórax fechado de microscopia intravital de um pulmão de rato livremente móvel pode ser usado para medir a integridade glicocálice via ESL exclusão de fluorescentemente marcadas com dextranos de elevado peso molecular a partir da superfície endotelial. Esta técnica não-recuperação cirúrgica, que requerbrightfield simultânea e de imagem de fluorescência do pulmão do rato, permite a observação longitudinal da microvasculatura subpleural sem evidência de induzir lesão pulmonar confusão.

Introdução

O glycocalyx é uma camada endotelial extracelular de proteoglicanos e glicosaminoglicanos associados que revestem a íntima vascular. In vivo, o glycocalyx é altamente hidratada, formando uma camada superficial substancial endotelial (ESL) que regula várias funções endoteliais incluindo a permeabilidade do fluido ^1, neutrófilos endotelial adesão ^2, e a tensão de ³ mecanotransdução fluido de cisalhamento.

Historicamente, tem sido o glicocálice underappreciated devido à sua aberrance em preparações de células de cultura ^{4, 5} e a sua degradação durante a fixação do tecido normal e de processamento ^6. O uso crescente de ⁷ microscopia intravital (em microscopia vivo, IVM) coincidiu com elevado interesse científico na importância do ESL para a função vascular durante a saúde e na doença. O ESL é invisível para microscopia de luz e não pode ser facilmente rotulado devivo, dada a propensão do glicocálice fluorescentes de ligação de lectinas para provocar a aglutinação de glóbulos vermelhos ⁸ e embolia pulmonar fatal (observações não publicadas). Várias abordagens indiretas, por isso, foi desenvolvido para deduzir ESL espessura (e, por extensão, a integridade glicocálice), não-móveis leitos vasculares, como os microcirculations cremastérico e mesentérica. Estas técnicas incluem a medição de diferenças de velocidade de circulação de micropartículas como uma função da distância a partir da membrana endotelial (velocimetria de micropartículas imagem ^9), bem como a medição da exclusão de volumosos, fluorescentemente marcadas com marcadores vasculares (por exemplo, dextranos), a partir da superfície endotelial (técnica de exclusão de dextrano ^{10, 11).} Destas técnicas, apenas a exclusão de dextrano é capaz de estimar a espessura ESL partir de medições feitas em um único ponto no tempo. Ao medir simultaneamente larguras vasculares utilizando microscopia de campo claro (a largura emclusive do "invisível" ESL) e microscopia de fluorescência de um marcador vascular excluídos do ESL, ESL espessura pode ser calculada como a metade da diferença entre as larguras vasculares ^2.

O uso de uma medida instantânea de espessura ESL é bem adequado para o estudo do glicocálice pulmonar. Microscopia intravital do pulmão é um desafio, dado artefato movimento significativo pulmonar e cardíaca. Embora os avanços recentes permitem a imobilização dos pulmões do rato, in vivo ^{12, 13,} existam preocupações quanto ao impacto fisiológico do pulmão estase. Imobilidade pulmonar está associado com o óxido nítrico endotelial diminuiu de sinalização ^14, uma via de sinalização que afeta tanto a adesão de neutrófilos e lesão pulmonar ^{15 16.} Além disso, a imobilização de uma área de pulmão expõe circundante alvéolos móveis prejudiciais forças de cisalhamento (o chamado "atelectrauma"), de acordo com os conceitos clássicos fisiológicosinterdependência alveolar ^17.

Em 2008, Arata Tabuchi, Wolfgang Kuebler e seus colegas desenvolveram uma técnica cirúrgica que permite microscopia intravital de um pulmão de rato livremente em movimento ^18. Artefato respiratória decorrente desta técnica pode ser negada pela utilização de imagens em alta velocidade, incluindo a medição simultânea de campo claro e microscopia de fluorescência. Neste relatório, como pormenor, a exclusão de imagem instantânea de dextrano pode ser utilizado para medir a espessura ESL na microcirculação subpleural do pulmão do rato livremente movendo, in vivo. Esta técnica pode ser facilmente modificado para determinar a função glicocálice, especificamente, a capacidade de um intacto ESL para excluir circulante elementos a partir da superfície endotelial. Recentemente temos usado essas técnicas para determinar a importância da integridade ESL pulmonar para o desenvolvimento de lesão pulmonar aguda durante as doenças inflamatórias sistémicas tais como sépsis ^2.

Protocolo

1. Preparação de tubo cirúrgico, cateteres vasculares, Janela parede torácica

1. Fase microscopia intravital. Nós custom-made um estágio plexiglass em que o rato anestesiado reside durante microscopia. Esta fase acomoda ambos de 15 cm por 10 centímetros placa de corte de plástico flexível (sobre a qual o rato se encontra durante a indução da anestesia, a colocação de traqueostomia, e cateterização venosa), bem como um elemento de aquecimento de tamanho semelhante (localizado por baixo da placa de corte).
2. Rato preparação tubo de toracostomia (Figura 1). Um comprimento de 10 cm de tubagem de PE 50 (Intramedic, diâmetro interno 0,58 milímetros, o diâmetro exterior 0,965 milímetros) é cortado. Uma das extremidades é ligada à extremidade romba de uma agulha de calibre 23 curvo; esta agulha vai ser usado para passar o tubo através da parede torácica (dentro → exterior) antes do fecho da janela torácica.
   A extremidade distal do tubo (1,5 cm de comprimento, em frente ao calibre 23 em anexoagulha) é repetidamente perfurado por uma agulha de calibre 30, a criação de "portas laterais" para facilitar a aspiração de ar eficaz intratorácica.
   Esta porção fenestrada é então separado do resto do tubo por várias voltas circunferenciais de sutura de seda 04:00; estes loops servirá como uma "rolha", em última análise, a ancoragem dos 1,5 centímetros fenestrado porção no interior da cavidade torácica.
3. Cateter venoso jugular. Dois 15 cm de comprimento de tubos PE 10 (Intramedic, diâmetro interno 0,28 milímetros, diâmetro externo 0,61 milímetros) são cortadas. Um bisturi é usado para chanfrar as extremidades do tubo, aumentando assim a facilidade de punção venosa. O tubo é descarregado através de uma seringa de 1 ml contendo 6% de solução de dextrano de 150 kDa (em PBS) ligado à extremidade não-chanfrada do tubo.
4. Chest preparação parede janela (Figura 2). Membrana transparente de polivinilideno (New Kure Wrap, Kuresha, Tokyo) é cortada em forma oval (eixo maior a 6 cm, de menor importância do eixo 4 cm). A 5 mm circular n º 1 lamela (Bellco) é fixada à membrana usando α-cianoacrilato cola (Pattex flüssig, Henkel, Dusseldorf).
5. . Tubo para a indução de pneumotórax ("tubo de sopro") Um comprimento de tubo de 10 cm (diâmetro interno de 3 mm, diâmetro externo de 5 mm) é ligada a uma seringa de 5 ml, a extremidade oposta vai ser utilizado para introduzir o ar para dentro da gaiola de animais torácica antes de peito enxerto janela parede.
6. Seringa para imersão em água do objectivo. Uma agulha de calibre 23 é ligada a uma seringa de 30 ml com água destilada. A ponta da agulha é embotada (usando um arquivo de metal), a fim de evitar danos para o objectivo.

2. Anestesia Rato

1. Um rato é anestesiado com uma mistura de cetamina (10 mg / ml) e xilazina (2 mg / ml), administrada por via intraperitoneal na dose de 8 ul por grama de peso corporal do rato. A sedação ocorre dentro de 3 - 6 min e não deve impedir a respiração espontânea.
2. Usando um barbeador elétrico, fazer a barbada garganta, tórax, abdômen, e do lado direito do rato.
3. Usando a fita, prenda o mouse para uma placa fina de plástico de corte. A cabeça do rato deve apontar para o operador (Figura 3). Tensão suave proporcionada por um laço de sutura que passa por baixo dos dentes superiores serve para manter a extensão da cabeça. A placa de corte é colocada sobre uma almofada de aquecimento, mantendo euthermia mouse durante traqueostomia e colocação de cateter venoso.
4. Áreas molhadas raspadas com 100% de etanol.
5. Confirme anestesia adequada com uma pitada de cauda / pata. Proceder se resposta mínima, fornecer um bolus extra de cetamina / xilazina se não forem adequadamente anestesiado.

3. Traqueostomia

1. Uma incisão de 1 cm é feita ao longo da garganta. Tecido conjuntivo subjacente é dissecado, e as glândulas salivares são separados e reflete lateralmente. O músculo esterno imediatamente anterior à traquéia é ressecado.
2. Um laço de sutura 04:00 é avançado em poe traqueia (Figura 4). O ciclo é então cortada, criando duas cadeias separadas de sutura subjacentes à traqueia. A sutura de caudal irá ser utilizado para fixar o tubo de traqueostomia; sutura craniana vai ser usado para fornecer a tensão na traqueia, durante a colocação de traqueostomia.
3. Usando dois dedos, a sutura superior é agarrada e a tensão é aplicada uma ligeira à traqueia. Uma incisão é feita na horizontal da traqueia superior entre as suturas e inferiores. Esta incisão deve atravessar aproximadamente dois terços da circunferência traqueal. Um tubo de traqueostomia de arrastamento (Harvard Apparatus, 1,22 mm de diâmetro exterior) é inserido na traqueia distal e fixada no lugar através do fio de sutura caudal traqueal.
4. A traqueostomia é ligado a um ventilador de animais controlada a volume pequeno (Inspira, Harvard Apparatus), e que o mouse é ventilado com 40% de oxigênio inspirado e 9 ml / kg de volume corrente (configurações otimizadas para manter a oxigenação adequada / ventilação em nosso laboratório). PosiA pressão expiratória final positiva (PEEP) não é iniciada neste ponto. De nota, o ventilador deve ser otimizada para condições únicas dentro dos laboratórios individuais. Diferentes comprimentos de tubagem redundante (interposta entre o tubo do ventilador conector Y e traqueostomia) pode ser usada para ajustar o espaço morto, garantindo ventilação alveolar estável para qualquer volume escolhido de maré.

4. Cateterismo Venoso

1. A junção da veia jugular interna e externa podem ser identificadas através de rastreamento ramos venosos distais proximalmente. A jugular externa é encontrado debaixo das glândulas salivares refletidas, o que pode ser rastreada proximalmente para encontrar a junção externo-interno jugular.
2. Use dissecção romba suave para separar a junção jugular do tecido circundante conjuntivo.
3. Com suturas 04:00, amarrar as jugular externa e interna das veias jugulares distais (cranial) para a junção jugular.
4. Faça uma incisão pequena no carinada junção jugular; sangramento deve ser mínima.
5. Dois cateteres podem ser incrementalmente avançado através da incisão e para dentro do tronco jugular. Após a aspiração suave para garantir o retorno do sangue, cateteres são assegurada na veia com suturas 04:00.
6. Fita cateteres venosos para a placa de corte para prevenir contra o deslocamento acidental.

5. Intravital Rato Cirurgia Microscopia Lung (adaptado de Tabuchi et al. ¹⁸⁾

1. A placa de corte (contendo o rato anestesiado contido bem como cateteres venosos gravadas) é transferida para o estágio de microscopia intravital, em que as intervenções cirúrgicas restantes será executada. Uma sonda de temperatura retal é colocado; esta interface com um sistema de aquecimento adaptativo (localizado sob a placa de corte), permitindo a manutenção de euthermia mouse.
2. Um cateter venoso jugular está ligado a uma bomba de seringa, que proporciona uma mistura de cetamina (10 mg / ml), xilazina (2 mg / ml)mistura à temperatura de 200 ul por hora. Anestesia adequada é novamente confirmado usando a cauda / pata pitada.
3. A incisão é estendida a partir do pescoço ao processo xifóide, em seguida, proceder-se lateralmente para o lado direito (Figura 5).
4. Usando a electrocauterização, a musculatura do peito é removida, expondo a caixa torácica. Toma-se cuidado para garantir a hemostase completa.
5. Atravesse garupa direito do rato sobre o lado esquerdo e fita para baixo. A torção, resultante do tórax abdominal gira ligeiramente, melhorando a facilidade da operação.
6. Coloque a fase em um ângulo de 45 graus (Figura 6), o que permite o posicionamento do pulmão para cair para fora da parede do peito quando o pneumotórax é induzida.
7. A 1 ^ª costela (costela mais inferior) é apreendido com pinça e levantou; uma pinça curva é bruscamente empurrado por baixo da costela. Isto separa pleura parietal da parede torácica. A pleura deve permanecer unpunctured.
8. Usando o tubo de sopro euma seringa, o ar é introduzido à força contra a pleura parietal. Isto leva a ruptura da superfície pleural e pneumotórax, sem danificar o pulmão subjacente. O pulmão subjacente cair fora da parede torácica, o que permite a introdução de uma pinça de eletrocautério sem danificar o pulmão. Uma diminuição no volume tidal ventilador não é normalmente necessário durante este passo.
9. Utilizando uma pinça eletrocautério, dissecar o peito musculatura da parede e corte pelas 5 ^ª e 6 ^ª costelas / pleura parietal, fazendo um buraco ~ 8 milímetros circular na parede torácica. É essencial que a hemostase completa seja mantida, tal como a presença de hemorragia irá obscurecer microscopia (Figura 7).
10. Utilizando um controlador de agulha, inserir o tubo de toracostomia no orifício da parede torácica. A agulha deve perfurar a parede do peito e sair da cavidade torácica inferior e lateral para a janela torácica (Figura 7). Tome cuidado para evitar a perfuração do diafragma. Otubo é então delicadamente puxado para fora da parede da caixa, até que a resistência ocorre a partir do fio de sutura "rolha", localizado na extremidade da porção do tubo fenestrado.
11. Coloque a fase plana.
12. Adicione 3 cm H ₂ O PEEP ao ventilador para ajudar a ajudar reexpansão pulmonar.
13. Cola (Pattex gel, Henkel) é colocada circunferencialmente em torno da janela de peito. A membrana é ligada, com a lamela de vidro voltado para o exterior da cavidade torácica. Cuidadosamente (e circunferencialmente) aproximada da membrana para a cola usando um aplicador de algodão.
14. Durante a realização de uma manobra de recrutamento do pulmão (3 volumes correntes durante a qual a porta é obstruída ventilador PEEP), -3 mm Hg sucção é aplicada ao tubo de peito. O pulmão deve persistentemente aproximada da membrana, enquanto movendo-se livremente, durante a ventilação de ar corrente (Figura 8).
15. A pata dianteira direita do rato é cruzado para o lado esquerdo, o que resulta numa posição de decúbito lateral esquerdo do rato.Cunhas de esponja pode ser utilizado para posicionar devidamente o rato para a janela do peito está alinhado com a objectiva de imersão em água a microscopia.
16. A água destilada é colocada sobre a lâmina de cobertura antes de microscopia, permitindo a visualização do pulmão utilizando uma objectiva de imersão em água. Água terá de ser reabastecido intermitentemente ao longo da imagem latente.

6. Medição da Espessura da camada endotelial da superfície pulmonar

1. Imediatamente após o fechamento da parede torácica, 500 ul de FITC-dextrano 150 kDa marcado (solução a 6% em PBS) é administrada através do cateter venoso segunda (não-anestesia) jugular. Isto serve como bolus ressuscitação de volume, bem como o marcador vascular para ESL medição. O bolus dextrano não influencia a adesão de neutrófilos ou a formação de edema pulmonar ^2.
2. O objetivo imersão em água está centrada sobre a lamínula. A escolha do objetivo é essencial para visualizar pequenas diferenças na espessura ESL, um elevado numerical abertura é necessário (> 0,8) e ainda manter um 2-3 mm de distância de trabalho (que permite a penetração através da janela de pulmão e superfície pleural). Usamos a Nikon CFI 75 LWD 16x (NA 0,8) e CFI 75 LWD 25x (NA 1.1) objetivos para esta finalidade.
3. Para medir com precisão o AEP espessura em um órgão móvel, é essencial que as larguras de campo claro e fluorescentes vasculares são realizadas simultaneamente. Isto pode ser conseguido utilizando um divisor de imagem (Dual View, Photometrics), que permite a captação simultânea de luz reflectida de contraste de interferência diferencial (DIC, campo claro) e imagens de FITC (Figura 9).
4. Durante a 5 seg pausa inspiratória, imagem contínua é realizada e gravada. Mais tarde, estas imagens podem ser revistos para identificar em foco quadros.
5. Usando um em foco-frame, microvasos subpleural (<20 um de diâmetro) são identificados, pelo menos três microvasos são normalmente encontrados em um único frame. Depois de terminada a experiência, DICe larguras de FITC-dextrano vasculares são medidos (por um observador cego) calculando a média dos comprimentos das três intercepta perpendiculares por microvascular. Assumindo espessura ESL igual em ambas as extremidades do navio, o tamanho ESL pode ser definida por um-metade da diferença entre as larguras de DIC e FITC-dextrano vasculares, tal como descrito na secção de resultados representativos.
6. Tipicamente, microscopia intravital pode ser realizada por> 90 min, sem qualquer evidência de lesão pulmonar ou hipotensão ^2. Experiências preliminares devem ser realizados para confirmar a estabilidade do rato (pressão arterial, a oxigenação, a ventilação, a lesão pulmonar), durante o período de observação. Drogas experimentais, pode ser introduzido através do segundo cateter (não-anestésico) jugular em qualquer momento durante o procedimento.

7. Medição alternativa da integridade da camada endotelial superfície pulmonar

As funções da camada endoteliais intactas de superfície (em parte) para excluir ciring elementos do ² superfície endotelial. Integridade ESL pode, portanto, ser medida pela capacidade de um elemento circular (por exemplo, uma microesfera fluorescente), para aceder e interagir com as moléculas de adesão da superfície celular (por exemplo, ICAM-1).

1. Anti-ICAM-1 marcado microesferas fluorescentes são preparados antes da cirurgia. Revestidas com estreptavidina 0,97 uM microesferas fluorescentes são incubados com anticorpo biotinilado de controlo de isotipo ou anti-ICAM-1 (clone YN1/1.7.4, 1:50, eBioscience) durante 30 min à temperatura ambiente. As microesferas são lavadas por três vezes e suspensas em PBS a 1 x 10 ⁹ microesferas por ml.
2. Durante a microscopia intravital, a suspensão de microsferas (100 uL) é injectado para dentro do cateter da veia jugular. Após 15 minutos de circulação, as imagens fluorescentes foram capturadas ao longo de 5 min. Microesferas imóvel por> 5 minutos são considerados aderentes e quantificadas usando o software de processamento de imagem.

8. Eutanásia

Após a conclusão do procedimento, os ratos anestesiados são sacrificados por exsanguinação por punção cardíaca directa. A eutanásia é confirmado através de pneumotórax bilateral, após o que os pulmões são colhidas e snap-congelado para posterior análise.

Resultados

A abordagem experimental descrito nos passos 1-6 permite a captura de quadros múltiplos de DIC simultânea (campo claro) e as imagens fluorescentes. Para determinar a espessura da ESL, imagens gravadas são analisadas por um observador cego, após conclusão do protocolo experimental. Usando uma moldura de focagem, microvasos subpleural (<20 um de diâmetro) são identificados; pelo menos 3 microvasos são normalmente encontrados numa estrutura única (Figura 10). Usando o software de análise de im...

Discussão

Coincidente com a crescente utilização de microscopia em vivo, não há reconhecimento crescente de tanto o tamanho substancial do ESL, bem como as suas numerosas contribuições para a função vascular. Estes dados emergentes, no entanto, são principalmente derivados de estudos do sistema vascular sistémica. Na verdade, o uso de em microscopia vivo no pulmão é tecnicamente desafiador, dado artefato movimento significativo pulmonar e cardíaca.

Vários últi...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Nome do reagente
FITC-dextrano (150 kDa)	Sigma	FD150S
TRITC-dextrano (150 kDa)	Sigma	T1287
Estreptavidina revestida microesferas fluorescentes	Bangs Laboratories	CP01F/10428	Dragão Verde fluorescência (semelhante a FITC)
Cetamina	Moore Médica
Xilazina	Moore Médica
Anti-ICAM-1 anticorpo biotinilado	eBioscience	Clonar YN1/1.7.4	Diluição 1:50
Isotipo de anticorpo biotinilado	eBioscience	IgG2b eB149/10H5	Diluição 1:50
			EQUIPAMENTOS
Ventilador mecânico	Harvard Apparatus	Inspira
Cateter traqueostomia	Harvard Apparatus	730028
Aparelho de eletrocautério	DRE Médica	Valleylab SSE-2L
Cautério bipolar fórceps	Olsen Medical	10-1200I	9,9 centímetros McPherson
Temperatura control sistema	Instrumentos de Precisão mundo	ATC1000
Bomba de seringa	Harvard Apparatus	Elite bomba 11
Microscópio (campo amplo)	Nikon	LV-150
Microscópio (confocal)	Nikon	A1R
Image Splitter	Fotometria	DV2
Câmera CCD	Fotometria	CoolSNAP HQ2
Software de processamento de imagem	Nikon	Elementos NIS
Membrana de polivinilideno	Kure Wrap
Lamela circular	Bélico	5CIR-1-BEL	5 mm, # 1 espessura
Cola (tampa de deslizamento de membrana)	Pattex	Flussig (líquido)	Para a aposição lamínula à membrana
Cola (tampa de deslizamento de mouse)	Pattex	Gel	Para a fixação da membrana de rato
Tubo cirúrgico	Intramedic	PE50, PE10
Suture	Pescador		04:00 seda
Barbeador elétrico	Oster	78997
Curvas pinça cirúrgica	Roboz
Retas pinça cirúrgica	Roboz
Tesouras cirúrgicas	Roboz
Microtesoura cirúrgicos	Roboz
Motorista agulha cirúrgica	Roboz
Fita cirúrgica	Pescador
Esponjas de cozinha (cortadas em fatias)	vário