Nella misura in vivo della superficie polmonare strato endoteliale mouse

Riepilogo

Il glicocalice endoteliale / endoteliale strato superficiale è perfettamente studiata usando la microscopia intravitale. Microscopia intravitale è tecnicamente difficile in un organo in movimento come il polmone. Si dimostra come brightfield simultanea e microscopia a fluorescenza possono essere utilizzate per stimare endoteliale spessore dello strato di superficie in un movimento liberamente In vivo Polmonare mouse.

Abstract

Il glicocalice endoteliale è uno strato di proteoglicani e glicosaminoglicani associati rivestono il lume vascolare. In vivo, il glicocalice è altamente idratata, formando uno strato consistente superficie endoteliale (ESL) che contribuisce al mantenimento della funzione endoteliale. Come il glicocalice endoteliale è spesso aberrante in vitro e si perde durante tecniche standard di fissazione dei tessuti, studio della ESL richiede l'uso di microscopia intravitale. Per meglio approssimare la fisiologia complesso del microcircolo alveolare polmonare immagini intravitale è idealmente eseguita su un polmone liberamente mobile. Tali preparazioni, tuttavia, tipicamente soffrono di artefatti da movimento ampio. Si dimostra come chiuso petto microscopia intravitale di un polmone topo liberamente mobile può essere utilizzato per misurare l'integrità glicocalice con esclusione ESL di fluorescenza destrani marcati ad alto peso molecolare dalla superficie endoteliale. Il mancato recupero tecnica chirurgica, che richiedebrightfield simultanea e imaging fluorescente del polmone mouse, consente l'osservazione longitudinale del microcircolo subpleurica senza evidenza di indurre lesioni confondimento polmonare.

Introduzione

Il glicocalice endoteliale è uno strato extracellulare di proteoglicani e glicosaminoglicani associati costeggiano il vascolare intimale. In vivo, il glicocalice è altamente idratata, formando uno strato consistente superficie endoteliale (ESL) che regola una varietà di funzioni endoteliali compreso permeabilità di un fluido ^1, neutrofili-endoteliale adesione ^2, e l'meccanotrasduzione di fluido ³ shear stress.

Storicamente, il glicocalice è stata sottovalutata a causa della sua aberrance in preparazioni di cellule in coltura ^{4, 5} e la sua degradazione durante il fissaggio del tessuto standard e di elaborazione ^6. L'uso sempre più ⁷ di microscopia intravitale (microscopia in vivo, IVM) ha coinciso con elevato interesse scientifico per l'importanza della ESL di funzione vascolare durante la salute e la malattia. L'ESL è invisibile per microscopia ottica e non può essere facilmente etichettato invivo, data la propensione di fluorescenti glicocalice leganti lectine di provocare agglutinazione RBC ⁸ e fatale embolia polmonare (osservazioni non pubblicate). Diversi approcci indiretti sono quindi stati sviluppati per dedurre spessore ESL (e, per estensione, l'integrità glicocalice) nei letti vascolari non-movimento, come l'microcirculations cremastere e mesenterici. Queste tecniche comprendono la misurazione delle differenze in circolazione microparticella velocità in funzione della distanza dalla membrana endoteliale (immagine microparticella velocimetria ⁹⁾ ​​così come la misurazione della esclusione di ingombranti, fluorescenza etichettati marcatori vascolari (ad esempio destrani) dalla superficie endoteliale (tecnica esclusione destrano ^{10, 11).} Di queste tecniche, solo esclusione destrano è in grado di stimare spessore ESL da misurazioni effettuate in un singolo punto nel tempo. Da misurare simultaneamente larghezze vascolari mediante microscopia brightfield (larghezza inclusive del "invisibile" ESL) e microscopia a fluorescenza di un tracciante vascolare escluso dal ESL, spessore ESL può essere calcolato come metà della differenza tra ^due larghezze vascolari.

L'uso di una misura istantanea di spessore ESL è adatto per lo studio del glicocalice polmonare. Microscopia intravitale del polmone è impegnativo, dato significativo artefatti da movimento polmonare e cardiaca. Mentre recenti progressi permettono di immobilizzazione polmoni topo in vivo ^{12, 13,} esistono preoccupazioni riguardo l'impatto fisiologico di stasi polmonare. Immobilità polmonare è associato con una diminuzione di ossido nitrico endoteliale segnalazione ^14, una via di segnalazione che ha un impatto sia l'adesione dei neutrofili ¹⁵ e danno polmonare ^16. Inoltre, immobilizzazione di una zona di polmone espone circostante alveoli mobili pregiudizievoli per forze di taglio (cosiddetti "atelectrauma"), secondo i concetti classici fisiologicheinterdipendenza alveolare ^17.

Nel 2008, Arata Tabuchi, Wolfgang Kuebler e colleghi hanno sviluppato una tecnica chirurgica che consente per la microscopia intravitale di un polmone del mouse liberamente in movimento ^18. Artefatto respiratorio derivanti da questa tecnica può essere negata con l'uso di imaging ad alta velocità, compresa la misurazione simultanea di chiaro e microscopia a fluorescenza. In questo rapporto, dettaglio come istantanea di imaging esclusione destrano può essere impiegato per misurare lo spessore ESL nel microcircolo subpleurica di muoversi liberamente, in vivo polmone mouse. Questa tecnica può essere facilmente modificato per determinare glicocalice funzione-specifico, la capacità di un intatto ESL escludere circolanti elementi dalla superficie endoteliale. Abbiamo recentemente usato queste tecniche per determinare l'importanza di integrità polmonare ESL allo sviluppo di danno polmonare acuto in malattie infiammatorie sistemiche come sepsi ^2.

Protocollo

1. Preparazione dei tubi chirurgici, cateteri vascolari, Muro Finestra Busto

1. Fase di microscopia intravitale. Abbiamo misura una fase in plexiglass su cui si trova il mouse anestetizzato durante la microscopia. Questo stadio ospita sia di 15 cm per 10 scheda di plastica flessibile di taglio cm (su cui il mouse si trova durante l'induzione dell'anestesia, il posizionamento tracheostomia, e cateterismo venoso), così come un elemento riscaldante di dimensioni analoghe (che si trova sotto il tagliere).
2. Mouse toracostomia preparazione tubo (Figura 1). A 10 cm di lunghezza del tubo PE 50 (Intramedic, diametro interno 0,58 millimetri, diametro esterno 0,965 millimetri), è tagliato. Un'estremità è fissata all'estremità di una curva smussata 23 gauge, questo ago verrà utilizzato per passare il tubo attraverso la parete toracica (interno → esterno) prima della chiusura della finestra toracica.
   L'estremità distale del tubo (1,5 cm di lunghezza, di fronte agli annessi 23 gaugeago) viene ripetutamente perforato con un ago calibro 30, la creazione di "porte laterali" per facilitare l'aspirazione efficace di aria intratoracica.
   Questa porzione fenestrata viene poi separato dal resto del tubo da diversi anelli circonferenziali di sutura di seta 04:00; queste anse servirà come un "tappo", infine ancorando i 1,5 centimetri fenestrated porzione all'interno della cavità toracica.
3. Cateteri venosi giugulare. Due lunghezze di 15 cm di tubi PE 10 (Intramedic, diametro interno 0.28 mm, diametro esterno 0,61 millimetri), sono tagliati. Un bisturi viene utilizzato per smussare le estremità del tubo, aumentando così la facilità di venipuntura. Il tubo viene lavata con una siringa da 1 ml contenente 6% soluzione di 150 kDa destrano (in PBS) attaccato al non smussato estremità della tubazione.
4. Busto preparazione finestra, parete, (Figura 2). Trasparente membrana di polivinilidene (New Kure Wrap, Kuresha, Tokyo) viene tagliato in una forma ovale (asse maggiore 6 cm, minori asse 4 cm). Una circolare 5 # 1 coprioggetto (Bellco) è fissato alla membrana con α-cianoacrilato colla (Pattex flüssig, Henkel, Düsseldorf).
5. . Tubo per induzione pneumotorace ("blow tube") A 10 cm di lunghezza di tubo (diametro interno 3 mm, diametro esterno 5 mm) è attaccato ad una siringa da 5 ml, all'estremità opposta sarà utilizzato per introdurre aria nella gabbia toracica animale prima di attecchimento finestra parete toracica.
6. Siringa per immersione in acqua di obiettivo. A 23 gauge è collegato a una siringa di 30 ml contenente acqua distillata. La punta dell'ago è smussata (utilizzando un file di metallo) per evitare di danneggiare l'obiettivo.

2. Anestesia mouse

1. Un topo è anestetizzato con una miscela di ketamina (10 mg / ml) e xilazina (2 mg / ml), intraperitoneale somministrato alla dose di 8 microlitri per grammo di peso corporeo del mouse. Sedazione avviene entro 3 - 6 minuti e non dovrebbe ostacolare la respirazione spontanea.
2. L'utilizzo di un rasoio elettrico, la barbala gola, torace, addome, e la parte destra del mouse.
3. Con del nastro, fissare il mouse per una scheda di taglio di plastica sottile. La testa del mouse deve essere rivolto verso l'operatore (Figura 3). Leggera tensione fornita da un anello di sutura passa sotto i denti superiori serve a mantenere l'estensione testa. Il tagliere è posto su di una piastra elettrica, mantenendo euthermia mouse durante tracheostomia e il posizionamento del catetere venoso.
4. Wet zone rasate con il 100% di etanolo.
5. Confermare l'anestesia adeguata con una coda / zampa pizzico. Procedere se risposta minima, fornire un bolo extra di ketamina / xilazina se non adeguatamente anestetizzato.

3. Tracheostomia

1. A 1 centimetro incisione è fatta sulla gola. Sottostante tessuto connettivo è sezionato, e le ghiandole salivari sono separati e riflessi lateralmente. Il muscolo sterno-ioideo immediatamente anteriore alla trachea viene asportato.
2. Un ciclo di sutura 04:00 è avanzata in the trachea (Figura 4). Il ciclo viene poi tagliato, creando due filoni separati di sutura sottostanti la trachea. La sutura caudale sarà utilizzato per fissare la cannula, la sutura cranica sarà utilizzato per fornire la tensione sulla trachea durante il posizionamento tracheostomia.
3. Usando due dita, la sutura superiore è afferrata e leggera tensione viene applicata alla trachea. Una incisione orizzontale è realizzata nella trachea tra superiore e inferiore suture. Questa incisione dovrebbe attraversare circa due terzi della circonferenza tracheale. Una cannula flangiato (Harvard Apparatus, 1,22 mm di diametro esterno) viene inserito nella trachea distale e fissato in posizione utilizzando la sutura caudale tracheale.
4. La tracheostomia è collegato ad un volume controllato ventilatore piccolo animale (Inspira, Harvard Apparatus), e il topo è ventilato con 40% di ossigeno inspirato e 9 ml / kg volumi correnti (impostazioni ottimizzate per mantenere un'adeguata ossigenazione / aerazione nel nostro laboratorio). Posizione pressione di fine espirazione (PEEP) non è iniziata a questo punto. Da notare che le impostazioni del ventilatore dovrebbe essere ottimizzato per condizioni uniche in singoli laboratori. Diverse lunghezze dei tubi ridondanti (interposto tra il tubo del ventilatore connettore a Y e tracheostomia) possono essere utilizzati per regolare lo spazio morto, assicurando stabile ventilazione alveolare per qualsiasi volume scelto marea.

4. Cateterismo venoso

1. La giunzione della vena giugulare interna ed esterna può essere identificato da inseguimento rami venosi distali prossimalmente. La giugulare esterna si trova sotto le ghiandole salivari riflettono, che può essere fatta prossimalmente per trovare l'esterna-interna di giunzione giugulare.
2. Utilizzare dolce smussa per separare il bivio giugulare dal circostante tessuto connettivo.
3. Utilizzando suture 04:00, legare le vene giugulari esterne e interne giugulari distali (craniale) fino al bivio giugulare.
4. Fai una piccola incisione nella carenadella giunzione giugulare, sanguinamento dovrebbe essere minimo.
5. Due cateteri possono essere gradualmente avanzare attraverso l'incisione e nel tronco giugulare. Dopo l'aspirazione delicata per assicurare il ritorno del sangue, cateteri sono fissati all'interno della vena con suture 04:00.
6. Tape cateteri venosi al tagliere per evitare contro dislocazione accidentale.

5. Intravitale mouse Microscopia chirurgia polmonare (adattato da Tabuchi et al. ¹⁸⁾

1. La scheda di taglio (che contiene il contenuto, il mouse anestetizzato e cateteri venosi registrate) è transizione alla fase di microscopia intravitale, dove gli interventi chirurgici rimanenti verrà eseguita. Una sonda di temperatura rettale è posto; questa interfaccia con un sistema di riscaldamento adattativo (che si trova sotto il tagliere), che permette la manutenzione di euthermia mouse.
2. Un catetere venoso giugulare è collegato a una pompa a siringa che fornisce un ketamina (10 mg / ml)-xilazina (2 mg / ml)miscela a 200 pl per ora. Anestesia adeguata è ancora una volta confermata con coda / zampa pizzico.
3. L'incisione mediana si estende dal collo al processo xifoideo, procedendo poi lateralmente a destra (Figura 5).
4. Utilizzando elettrocauterizzazione, la muscolatura del torace viene rimosso, esponendo la gabbia toracica. La cura è presa per garantire l'emostasi completa.
5. Attraversare gamba posteriore destro del mouse sul lato sinistro e il nastro verso il basso. La torsione risultante addominale ruota il torace leggermente, migliorando la facilità della chirurgia.
6. Luogo la fase ad un angolo di 45 gradi (figura 6); questo posizionamento permette il polmone ad allontanarsi dalla parete toracica volta il pneumotorace è indotta.
7. Il 1 ^° costola (costola più inferiore) si afferra con una pinza e cresciuto, una pinza curva è senza mezzi termini spinto sotto la costola. Questo separa pleura parietale dalla parete toracica. La pleura deve restare unpunctured.
8. Utilizzando il tubo di colpo euna siringa, l'aria viene forzatamente introdotta contro la pleura parietale. Questo porta alla rottura della superficie pleurica pneumotorace e senza danneggiare il polmone sottostante. Il polmone sottostante cadere dalla parete toracica, che consentiva l'introduzione di una pinza elettrocauterizzazione senza danneggiare il polmone. Una diminuzione del volume corrente ventilatore non è tipicamente richiesto durante questa fase.
9. Utilizzando pinze elettrocauterizzazione, sezionare la muscolatura della parete toracica e tagliare attraverso il 5 ^° e 6 ^° / nervature pleura parietale, facendo da 8 mm ~ foro circolare nella parete toracica. È essenziale che completa emostasi essere mantenuta, come la presenza di sanguinamento oscurerà microscopia (Figura 7).
10. Utilizzando un driver ago, inserire il tubo nel foro toracostomia parete toracica. L'ago deve forare la parete toracica e uscire dalla cavità toracica inferiore e laterale della finestra toracica (Figura 7). Fare attenzione a non pungere la membrana. Iltubo viene quindi delicatamente tirato fuori dalla parete toracica finché non si verifica una resistenza da "tappo" sutura situato sul bordo della porzione fenestrata del tubo.
11. Posizionare la fase piatta.
12. Aggiungere 3 cm H ₂ O PEEP al ventilatore per aiutare assistere riespansione del polmone.
13. Colla (Pattex gel, Henkel) è posto attorno alla circonferenza della finestra torace. La membrana è collegato, con il vetrino coprioggetti vetro rivolta verso l'esterno alla cavità toracica. Attenzione (e circonferenzialmente) circa la membrana alla colla usando un applicatore di cotone.
14. Durante l'esecuzione di una manovra di reclutamento polmonare (3 volumi correnti durante il quale la porta è ostruita ventilatore PEEP), -3 mmHg aspirazione viene applicato al tubo toracico. Il polmone deve costantemente approssimativa della membrana, mentre liberi di muoversi durante la ventilazione di marea (Figura 8).
15. La zampa anteriore destra del mouse è passati al lato sinistro, con un conseguente decubito laterale sinistro del mouse.Cunei spugna può essere utilizzata per posizionare correttamente il mouse così la finestra torace è allineato con l'obiettivo ad immersione microscopia acqua.
16. Acqua distillata è posto sul vetrino prima microscopia, permettendo la visualizzazione del polmone utilizzando un obiettivo ad immersione in acqua. Acqua dovrà essere rifornito intermittente durante l'imaging.

6. Misura dello spessore polmonare endoteliale strato superficiale

1. Immediatamente dopo la chiusura della parete toracica, 500 pl FITC-destrano marcato 150 kDa (6% in soluzione di PBS) è somministrato attraverso il secondo (non anestesia) catetere venoso giugulare. Questo serve come bolo rianimazione volume e il tracciante vascolare per ESL misurazione. Il bolo destrano non influenza l'adesione dei neutrofili o edema polmonare formazione ^2.
2. L'obiettivo immersione in acqua è centrato sul vetrino. La scelta di un obiettivo essenziale-per visualizzare piccole differenze di spessore ESL, un alto Numerical diaframma è necessaria (> 0,8) pur mantenendo un 2-3 mm di distanza di lavoro (che consente la penetrazione attraverso la finestra polmone e superficie pleurica). Usiamo il Tribunale di primo grado 75 Nikon LWD 16x (NA 0,8) e Tribunale di primo grado 75 LWD 25x (NA 1.1) gli obiettivi per questo scopo.
3. Per misurare con precisione lo spessore ESL in un organo in movimento, è essenziale che chiaro e fluorescenti larghezze vascolari sono eseguite simultaneamente. Ciò può essere realizzato utilizzando una immagine splitter (Dual View, fotometrici) che consente la cattura simultanea di luce riflessa contrasto di interferenza differenziale (DIC, campo chiaro) e le immagini FITC (Figura 9).
4. Durante una pausa 5 sec inspiratoria, imaging continuo viene eseguito e registrato. Più tardi, queste immagini possono essere riviste per individuare in-frame di messa a fuoco.
5. L'utilizzo di un telaio di messa a fuoco, subpleurica microvasi (<20 micron di diametro) sono identificati; almeno 3 microvasi si trovano tipicamente in un unico telaio. Dopo il completamento dell'esperimento, DICe FITC-destrano larghezze vascolari sono misurate (da un osservatore cieco) facendo la media delle lunghezze di tre intercettazioni perpendicolari al microvascolare. Supponendo uguale spessore ESL su entrambi i bordi della nave, la dimensione ESL può essere definita da una metà della differenza tra DIC e FITC-destrano larghezze vascolari, come descritto nella sezione rappresentativa Risultati.
6. In genere, la microscopia intravitale può essere eseguita per> 90 min senza alcuna prova di danno polmonare o ipotensione ^2. Esperimenti preliminari vanno eseguite per confermare la stabilità del mouse (pressione sanguigna, ossigenazione, ventilazione, danno polmonare) durante il periodo di osservazione. Farmaci sperimentali può essere introdotto attraverso il secondo (non-anestetico) giugulare catetere in qualsiasi momento durante la procedura.

7. Misura alternativa della integrità endoteliale polmonare strato superficiale

Le intatte endoteliali funzioni di strato di superficie (in parte) per escludere cirelementi zione del ^{2 di} superficie endoteliale. Integrità ESL può quindi essere misurata la capacità di un elemento circolare (ad esempio una microsfera fluorescente) per accedere e interagire con molecole di adesione sulla superficie cellulare (come ICAM-1).

1. Anti-ICAM-1 etichetta microsfere fluorescenti sono preparato prima dell'intervento chirurgico. Streptavidina rivestite 0,97 micron microsfere fluorescenti sono incubati con controllo biotinilato anti-ICAM-1 (YN1/1.7.4 clone, 01:50, eBioscience) isotipo dell'anticorpo o per 30 min a temperatura ambiente. Le microsfere vengono lavate tre volte in PBS e sospese a 1 x 10 ⁹ microsfere per ml.
2. Durante microscopia intravitale, la sospensione di microsfere (100 microlitri) viene iniettato nel catetere venoso giugulare. Dopo 15 min di circolazione, immagini fluorescenti vengono catturate oltre 5 min. Immobile per> 5 min Microsfere sono considerati aderenti e quantificate utilizzando un software di elaborazione delle immagini.

8. Eutanasia

"jove_content" Dopo completamento della procedura, topi anestetizzati sono eutanasia da dissanguamento via diretta puntura cardiaca. L'eutanasia è confermato tramite pneumotorace bilaterale, dopo di che vengono raccolti i polmoni e lo snap-congelati per una successiva analisi.

Risultati

L'approccio sperimentale descritto in fasi 1-6 consentirà cattura di fotogrammi di DIC simultanea (campo chiaro) e immagini fluorescenti. Per determinare lo spessore ESL, le immagini registrate vengono esaminati da un osservatore cieco dopo il completamento del protocollo sperimentale. Utilizzando un telaio a fuoco, subpleurica microvasi (<20 micron di diametro) sono identificati; almeno 3 microvasi trovano tipicamente in un unico telaio (Figura 10). Utilizzando software di analisi di immagine (...

Discussione

Coincidente con il diffondersi di microscopia in vivo, vi è crescente apprezzamento sia per la notevole entità delle ESL così come i suoi numerosi contributi alla funzione vascolare. Questi dati emergenti, tuttavia, derivano principalmente da studi del sistema vascolare sistemica. In effetti, l'uso di microscopia in vivo nel polmone è tecnicamente impegnativo, dato artefatto significativo movimento polmonare e cardiaca.

Diversi recenti progressi tecnici hanno consen...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Nome del reagente
FITC-destrano (150 kDa)	Sigma	FD150S
TRITC-destrano (150 kDa)	Sigma	T1287
Streptavidina rivestite microsfere fluorescenti	Bangs Laboratories	CP01F/10428	Drago Verde fluorescenza (simile a FITC)
Ketamina	Moore Medical
Xylazina	Moore Medical
Anti-ICAM-1 biotinilato	eBioscience	Clone YN1/1.7.4	Diluizione 1:50
Isotipo anticorpo biotinilato	eBioscience	IgG2b eB149/10H5	Diluizione 1:50
			ATTREZZATURE
Ventilatore meccanico	Harvard Apparatus	Inspira
Tracheostomia catetere	Harvard Apparatus	730028
Apparecchi Elettrocauterizzazione	DRE Medical	Valleylab SSE-2L
Cauterizzazione bipolare pinza	Olsen Medical	10-1200i	9,9 centimetri McPherson
Temperatura Control Sistema	Mondo Strumenti di precisione	ATC1000
Pompa a siringa	Harvard Apparatus	Pompa 11 Elite
Microscopio (widefield)	Nikon	LV-150
Microscopio (confocale)	Nikon	A1R
Image Splitter	Fotometrici	DV2
Telecamera CCD	Fotometrici	CoolSNAP HQ2
Immagine software di elaborazione	Nikon	NIS Elements
Membrana di polivinilidene	Kure Wrap
Fodera circolare	Bellco	5CIR-1-BEL	5 mm, uno spessore #
Colla (fodera a membrana)	Pattex	Flüssig (liquido)	Per l'apposizione vetrino alla membrana
Colla (coperchio a scorrimento del mouse)	Pattex	Gel	Per il fissaggio della membrana per il mouse
Tubo chirurgico	Intramedic	PE50, PE10
Suturare	Pescatore		Seta 04:00
Rasoio elettrico	Oster	78997
Curve pinze chirurgiche	Roboz
Dritti pinza chirurgica	Roboz
Forbici chirurgiche	Roboz
Microforbici chirurgici	Roboz
Ago chirurgico conducente	Roboz
Nastro chirurgico	Pescatore
Spugne da cucina (tagliati a spicchi)	vario