В естественных условиях измерения мышь легочных эндотелиальных поверхностного слоя

Резюме

Эндотелиальных гликокаликса / эндотелиальных поверхностного слоя идеально изучены с помощью прижизненной микроскопии. Прижизненная микроскопия является технически сложной задачей в движущемся органа, такие как легкое. Мы показываем, как одновременный светлое и флуоресцентной микроскопии может быть использована для оценки эндотелиальной толщину поверхностного слоя в свободно движущихся В естественных условиях Мышь легких.

Аннотация

Эндотелиальных гликокаликса представляет собой слой протеогликанов и гликозаминогликанов, связанных выстилающих просвет сосудов. В естественных условиях, гликокаликса очень увлажненной, формирование существенных эндотелия поверхностного слоя (ESL), что способствует поддержанию функции эндотелия. Как эндотелиальных гликокаликса часто аберрантной в пробирке и теряется при стандартных методов фиксации тканей, изучение ESL требует использования прижизненной микроскопии. Чтобы максимально приближают комплекса физиологии альвеолярного микрососудов, легочной прижизненных изображений идеально выполнены на свободно движущихся легких. Эти препараты, однако, как правило, страдают от обширного артефактов движения. Мы показываем, как закрытые груди прижизненной микроскопии свободно движущихся мышей легких может быть использован для измерения гликокаликса целостности через ESL исключения флуоресцентно-меченных декстранов высоким молекулярным весом от эндотелиальной поверхности. Это без рекуперации хирургическая техника, которая требуетодновременное светлое и флуоресцентных изображений мыши легких, позволяет продольные наблюдения субплеврально микрососудов без признаков вызывая смешанные повреждения легких.

Введение

Эндотелиальных гликокаликса является внеклеточный слой протеогликанов и гликозаминогликанов, связанных выстилающих сосудистую интиму. В естественных условиях, гликокаликса сильно увлажненной, формирование существенных эндотелия поверхностного слоя (ESL), который регулирует различные эндотелиальной функции, включая жидкости проницаемости ^1, нейтрофилов-эндотелиальной адгезия ^2, а механотрансдукции жидкости сдвига ³ стрессом.

Исторически сложилось, что гликокаликса был недооцененным из-за его отклонение от нормы в культуре клеточные препараты ^{4, 5} и его деградации во время стандартной фиксации тканей и обработки ^6. Увеличение использования ⁷ прижизненной микроскопии (в естественных условиях микроскопии, IVM) совпал с повышенным научный интерес к важности ESL на сосудистую функцию при здоровьем и болезнью. ESL является невидимым для световой микроскопии и не могут быть легко помечать вестественных условиях, учитывая склонность люминесцентных гликокаликса-связывающие лектины вызывают РБК агглютинации ⁸ и фатальной легочной эмболии (неопубликованные данные). Некоторые косвенные подходы Поэтому были разработаны вывести ESL толщины (и, как следствие, гликокаликса целостности) в неподвижных сосудистого русла, такие как cremasteric и брыжеечных microcirculations. Эти методы включают в себя измерение различий в скорости циркулирующих микрочастиц как функция расстояния от эндотелиальной мембраны (микрочастицы Измерение скорости Изображения ^9), а также измерение исключения громоздких, флуоресцентно-меченных сосудистых маркеров (например, декстраны) от поверхности эндотелиальных (декстран исключения техники ^{10, 11).} Из этих методов, только декстрана исключения способны оценить ESL толщиной от измерений в одной точке во времени. По одновременного измерения ширины сосудистого использованием светлого микроскопии (ширина винклюзивного из "невидимых" ESL) и флуоресцентной микроскопии сосудистой трассирующими исключены из ESL, ESL Толщина может быть рассчитана как половина разницы между сосудистыми шириной ^2.

Использование мгновенного мера толщины ESL хорошо подходит для исследования легочной гликокаликса. Прижизненные микроскопии легких является сложной задачей, учитывая значительный легочной и сердечной движения артефакт. Хотя последние достижения позволяют для иммобилизации мыши легких в ^{12 естественных, 13,} существует обеспокоенность относительно физиологического воздействия легких застой. Легкое неподвижности связано со снижением эндотелиальной окиси азота сигнализации, ¹⁴ сигнального пути, что влияет как на адгезию нейтрофилов ¹⁵ и повреждения легких ^16. Кроме того, иммобилизация области легких подвергает окружающих альвеолы ​​для мобильных вредные поперечных сил (так называемый "atelectrauma"), в соответствии с классическими физиологическими понятиямиальвеолярной взаимозависимости ^17.

В 2008 году Арата Tabuchi, Вольфганг Kuebler и его коллеги разработали хирургическая техника позволяет прижизненной микроскопии свободно движущихся мышей легких ^18. Респираторные артефактов, связанных с этой техникой может быть сведено на нет использование высокоскоростной обработки изображений, в том числе одновременное измерение светлое и люминесцентной микроскопии. В этом отчете мы подробно описывается как мгновенное исключение декстрана визуализации может быть использован для измерения толщины ESL в субплеврально микроциркуляцию свободно двигаться, в естественных условиях мышь легких. Этот метод может быть легко изменена, чтобы определить гликокаликса функции-в частности, способностью нетронутой ESL, чтобы исключить элементы из циркулирующих эндотелиальных поверхности. Мы недавно эти методы использовались для определения важности легочной целостности ESL в развитии острого повреждения легких при системных воспалительных заболеваний, таких как сепсис ^2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Подготовка хирургической трубки, сосудистые катетеры, Window грудной стенки

1. Прижизненные этапе микроскопии. Мы специально сделали оргстекла этап, на котором лежит под наркозом мыши во время микроскопии. Этот этап совмещает в 15 см на 10 см гибкой пластиковой разделочной доске (на которой лежит мышь во время вводного наркоза, трахеостомия размещения, и венозная катетеризация), а также аналогичным размером нагревательного элемента (расположен под разделочной доске).
2. Мышь дренирование плевральной полости трубки подготовки (рис. 1). 10 см длины трубы PE 50 (Intramedic, внутренний диаметр 0,58 мм, наружным диаметром 0,965 мм) вырезать. Один конец прикреплен к тупым концом изогнутой иглой 23 калибра, эта игла будет использоваться, чтобы передать трубку, через грудной стенки (внутри → пределами) до закрытия грудной окна.
   Дистальный конец трубки (1,5 см в длину, напротив прилагаемой 23 калибраигла) несколько раз проткнуть иглой 30, создавая "сторону портов" в целях содействия эффективному стремление внутригрудных воздуха.
   Это окончатые часть отделяется от остальной части трубки на несколько окружных петли 4:00 шов шелк; эти петли будут служить в качестве "пробка", в конечном счете крепления 1,5 см окончатые часть в грудной полости.
3. Jugular венозных катетеров. Две 15 см длины трубы PE 10 (Intramedic, внутренний диаметр 0,28 мм, внешний диаметр 0,61 мм) вырезаются. Скальпель используется для конических концов трубки, тем самым повышая удобство вены. Трубы очищается с помощью 1 мл шприц, содержащий 6% декстрана 150 кДа решения (в PBS), подключенных к не-скошенный конец трубки.
4. Грудь стену окна препарата (рис. 2). Прозрачная мембрана поливинилиденфторида (Нью-Куре Wrap, Kuresha, Токио) разрезают на овальную форму (большая ось 6 см, малая ось 4 см). Круговые 5 мм № 1 покровное (Bellcо) прикрепляется к мембране использованием α-цианоакрилат клея (Pattex flüssig, Henkel, Дюссельдорф).
5. . Труба для пневмоторакса индукции ("удар трубки") 10 см, длина трубки (внутренний диаметр 3 мм, внешний диаметр 5 мм) крепится к 5 мл шприц, в противоположном конце будет использован для введения воздуха в грудной клетке животного до груди приживления окна стене.
6. Шприц для погружения в воду объективной. 23 игла прикреплена к 30 мл шприц с дистиллированной водой. Кончик иглы притупляются (с использованием металла файл) в целях предотвращения повреждения цели.

2. Мышь анестезии

1. Мышь находится под наркозом смесью кетамина (10 мг / мл) и ксилазина (2 мг / мл) вводили внутрибрюшинно в дозе 8 мкл на грамм массы тела мыши. Торможение происходит в течение 3 - 6 мин и не должны препятствовать спонтанного дыхания.
2. Использование электрической бритвы, бритьегорло, грудь, живот и правую сторону мыши.
3. Используя ленту, обеспечить мыши, чтобы тонкая доска пластика. Глава мышь должна указывать в сторону оператора (рис. 3). Нежные напряженности предоставляемых петли шва проходящий под верхними зубами служит для поддержания головы расширения. Разделочной доске делается на грелку, сохраняя мыши euthermia во время трахеостомии и размещение венозного катетера.
4. Мокрая бритая области со 100% этанола.
5. Подтвердите адекватного обезболивания с хвостом / лапы крайнем случае. Приступить в случае минимальный ответ, обеспечивают дополнительную болюса кетамина / ксилазина, если должным образом не под наркозом.

3. Трахеостомические

1. 1 см надрез на горле. Базовая соединительная ткань разрезали, и слюнных желез разделяют и отражается в сторону. Грудинно-подъязычный мышцы сразу кпереди от трахеи резекции.
2. Петля 4:00 шов продвинулись в гоэлектронной трахеи (рис. 4). Цикл затем разрезают, создавая два отдельных нитей шва, лежащие в основе трахеи. Хвостового шов будет использоваться для обеспечения трахеостомической трубки; черепной шов будет использоваться для обеспечения напряженности на трахею во время размещения трахеостомии.
3. С помощью двух пальцев, верхний шов схватил и нежно напряжение подается на трахее. Горизонтального надрез в трахее между верхней и нижней нити. Этот разрез должны пересекаться примерно две трети трахеи окружности. Фланцевое трахеостомической трубки (Harvard Apparatus, 1,22 мм наружный диаметр) вставляется в дистальных трахеи и закреплен на месте с помощью хвостового трахеи шва.
4. Трахеостомия связано с управлением по объему небольшой вентилятор животных (Inspira, Harvard Apparatus), и мышь вентилируемые с 40% вдыхаемого кислорода и 9 мл / кг дыхательный объем (настройки оптимизированы для поддержания адекватной оксигенации / вентиляции в нашей лаборатории). PosiTIVE давление в конце выдоха (PEEP) не начали в этой точке. Следует отметить, что вентилятор параметры должны быть оптимизированы для уникальных условий в рамках отдельных лабораторий. Различные длины избыточных трубки (вставляется между вентилятором трубки Y-разъем и трахеостомия) может быть использован для регулировки мертвого пространства, обеспечение стабильного альвеолярной вентиляции для любого выбранного дыхательного объема.

4. Венозной катетеризации

1. Стыке внутренней и наружной яремной вены могут быть идентифицированы путем отслеживания дистальные ветви венозных проксимально. Наружной яремной находится под отражение слюнных желез, что может быть прослежена проксимально, чтобы найти внешнего внутренней яремной перехода.
2. Используйте нежные тупой диссекции отделить яремной перехода от окружающей соединительной ткани.
3. Использование 4:00 швов, галстук с наружной яремной и внутренней яремной вены дистальных (краниально) в яремную перехода.
4. Сделайте небольшой надрез в килемиз яремной соединения; кровотечение должно быть минимальным.
5. Два катетера может быть постепенно продвинулся через разрез и в яремную ствола. После нежного стремление обеспечить возврат крови, катетеры закреплены в вены с использованием 4:00 швов.
6. Лента венозных катетеров на разделочную доску, чтобы предотвратить случайное смещение.

5. Прижизненные мышь легких микроскопии хирургии (адаптировано из Tabuchi и соавт. ¹⁸⁾

1. Разделочная доска (содержащие сдержанный, анестезию мыши, а также выявляются венозные катетеры) является переход к прижизненной микроскопии этап, где остальные хирургические вмешательства будут выполнены. Ректального датчика температуры находится, это интерфейсы с адаптивной системой отопления (расположен под разделочную доску), что позволяет поддержание мыши euthermia.
2. Один яремной венозного катетера прикреплен к шприцевой насос, который обеспечивает кетамина (10 мг / мл)-ксилазина (2 мг / мл)смеси на 200 мл в час. Адекватная анестезия раз подтвердил использованием хвост / лапы крайнем случае.
3. Срединный разрез распространяется от шеи до xyphoid процессом, то, исходя сбоку с правой стороны (рис. 5).
4. Использование электрокоагуляции, грудь мускулатуру удаляются, обнажая грудной клетки. Принимаются меры для обеспечения полного гемостаза.
5. Крест правой задней ноги мыши на левую сторону и лентой вниз. В результате брюшной кручения вращается грудной клетки немного, повышение удобства операции.
6. Поместите сцену в 45 градусов (рис. 6); это позиционирование позволяет легких отпадать от стенки грудной клетки один раз пневмоторакс индуцирован.
7. ^1-го ребра (самый низкий ребра) захватывают пинцетом и вырос; изогнутых щипцов откровенно толкнул под ребро. Это отделяет париетальной плевры от грудной стенки. Плевры должна оставаться unpunctured.
8. Использование трубы удар ишприц, воздух принудительно введены против париетальной плевры. Это приводит к разрыву плевральной поверхности и пневмоторакс, не повреждая основной легких. Основной легких отпадут от грудной стенки, что позволяет введение электрокоагуляции щипцы без повреждения легких. Снижение вентилятор дыхательный объем, как правило, не требуется на этом этапе.
9. Использование электрокоагуляции щипцы, рассекают стенку грудной клетки мускулатуры и пересекают ^5-го и ^6-го ребра / париетальной плевры, что делает ~ 8 мм круглое отверстие в стенке грудной клетки. Важно, чтобы полный гемостаз быть сохранен, так как наличие кровотечения скроет микроскопии (рис. 7).
10. С помощью иглы водитель, дренирование плевральной полости вставить трубку в отверстие в стене грудь. Игла должна прокол грудной стенки и выхода из грудной полости ниже и латеральнее к грудной окне (рис. 7). Будьте осторожны, чтобы избежать прокола мембраны.трубка затем аккуратно вытащил из стенки грудной клетки, пока она сопротивление происходит от шва "пробка", расположенный на краю окончатые часть трубы.
11. Поместите этапе квартире.
12. Добавить 3 см H ₂ O PEEP к вентилятору для помощи легкого переразложения.
13. Клей (Pattex гель, Henkel) находится по окружности груди окне. Мембрана крепится с скольжения стеклянной крышкой, стоящих перед внешней по отношению к грудной полости. Осторожно (и окружности) приближенные мембраны для клея с помощью ватного аппликатора.
14. При выполнении маневра легкого набора (3 дыхательного объема в течение которых порт PEEP вентилятор препятствия), -3 мм рт всасывающий применяется к груди трубку. Легких следует постоянно приближенных мембраны при свободном перемещении во время приливной вентиляции (рис. 8).
15. Правой передней лапой на мышь перешел на левую сторону, в результате чего левое боковое положение пролежни мыши.Губки клинья могут быть использованы правильно позиционировать мышь так, грудь окна совмещена с целью погружения воды микроскопии.
16. Дистиллированная вода помещается на обложку скольжения до микроскопии, позволяющий для визуализации легких с использованием объектива погружения в воду. Воды нужно будет периодически пополняться по всему изображений.

6. Измерение легочных эндотелиальных толщины поверхностного слоя

1. Сразу же после закрытия грудной стенки, 500 мкл FITC-меченого декстрана 150 кДа (6% раствор в PBS) вводят через второй (без наркоза) яремных венозных катетеров. Этот болюс служит объем реанимации, а также сосудистого трассирующими для ESL измерения. Декстрана болюсным не влияет на адгезию нейтрофилов или отек легких формирования ^2.
2. Целью погружения в воду по центру над покровным стеклом. Выбор цели необходимо, чтобы визуализировать небольшие различия в толщине ESL, высокие численныекал диафрагмы необходима (> 0,8) при сохранении 2 - 3 мм, рабочее расстояние (с учетом проникновения через окно легких и плевральной поверхности). Мы используем Nikon CFI 75 LWD 16x (NA 0,8) и CFI 75 LWD 25x (NA 1,1) цели для этой цели.
3. Для точного измерения толщины ESL в движущемся органе, очень важно, чтобы светлое и флуоресцентные сосудистой ширины выполняются одновременно. Это может быть осуществлено с использованием изображений сплиттер (Dual View, Фотометрия), что позволяет для одновременного захвата отраженного света интерференционного контраста дифференциал (DIC, светлое) и FITC изображения (рис. 9).
4. Во время паузы в 5 секунд вдоха, непрерывная визуализация выступал и записывался. Позже, эти изображения могут быть пересмотрены, чтобы определить в фокусе кадров.
5. Использование в фокусе кадра, субплеврально микрососудов (<20 мкм в диаметре) определены, по крайней мере, 3 микрососудов которые обычно находятся на одном кадре. После завершения эксперимента, DICи FITC-декстрана сосудистой ширина измеряется (по ослепил наблюдателя) путем усреднения длин трех перпендикулярных перехватывает за микрососудов. Предполагая, равной толщине ESL на обоих краев сосуда, размер ESL может быть определена на половину разницы между ДВС и FITC-декстрана сосудистой ширины, как описано в разделе представителя результаты.
6. Как правило, прижизненной микроскопии может быть выполнена в течение> 90 минут без каких-либо признаков повреждения легких или гипотонией ^2. Предварительные эксперименты должны быть выполнены, чтобы подтвердить стабильность мыши (артериальное давление, насыщение крови кислородом, вентиляции, повреждение легкого) в течение периода наблюдения. Экспериментальные препараты могут быть введены через вторую (не анестетик) яремной катетер в любой момент во время процедуры.

7. Альтернативное измерение легочных эндотелиальных целостности поверхностного слоя

Нетронутым эндотелиальной функции поверхностного слоя (частично), чтобы исключить циркулирующихния элементов из эндотелиальных ² поверхности. ESL целостность может быть измерено по способности циркулирующих элементов (например, флуоресцентные микросферы) для доступа и взаимодействия с клеточной поверхности молекул адгезии (таких как ICAM-1).

1. Anti-ICAM-1 помечены флуоресцентным микросферы готовы до операции. Стрептавидин покрытием 0,97 мкм флуоресцентные микросферы инкубировали с биотинилированным анти-ICAM-1 (YN1/1.7.4 клон, 1:50, eBioscience) антител или изотипа контроля в течение 30 мин при комнатной температуре. Микросферы трижды промывают и суспендируют в PBS на 1 х 10 ⁹ Микросферы на мл.
2. Во время прижизненной микроскопии, микросферы подвески (100 мкл) вводят в яремную венозный катетер. Через 15 мин обращения, флуоресцентные изображения будут захвачены в течение 5 минут. Микросферы неподвижно> 5 мин считается приверженцем и количественно, используя программное обеспечение для обработки изображений.

8. Эвтаназия

<р = класса "jove_content"> После завершения процедуры под наркозом мышей эвтаназии путем обескровливания через прямой пункции сердца. Эвтаназия подтверждается с помощью двустороннего пневмоторакса, после чего легкие собирают и оснастки замороженные для последующего анализа.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Экспериментальный подход, описанный в шагах 1-6 позволит захват нескольких кадров одновременно DIC (светлое) и флуоресцентные изображения. Для определения толщины ESL, записанного изображения рассматриваются ослепил наблюдателей после завершения экспериментального протокола. Использо?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Одновременно с расширением использования в естественных условиях микроскопии, растет понимание как для существенного размера ESL, а также его большой вклад в сосудистую функцию. Эти новые данные, однако, в основном получены в результате исследований системной сосудистой системы. ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Название реагента
FITC-декстрана (150 кДа)	Сигма	FD150S
TRITC-декстрана (150 кДа)	Сигма	T1287
Покрытых стрептавидином флуоресцентные микросферы	Челка лабораторий	CP01F/10428	Дракон зеленую флуоресценцию (по аналогии с FITC)
Кетамин	Мур Медицинский
Ксилазин	Мур Медицинский
Anti-ICAM-1 биотинилированные антитела	eBioscience	Клонирование YN1/1.7.4	Разведение 1:50
Изотип биотинилированных антител	eBioscience	IgG2b eB149/10H5	Разведение 1:50
			ОБОРУДОВАНИЕ
Механический вентилятор	Harvard Apparatus	Inspira
Трахеостомические катетер	Harvard Apparatus	730028
Electrocautery аппарата	DRE Медицинский	Valleylab Ю-2L
Биполярные щипцы прижигания	Olsen Медицинский	10-1200I	9.9cm McPherson
Температура противоречивыел системой	Инструменты Всемирной Precision	ATC1000
Шприц насос	Harvard Apparatus	Насос 11 Elite
Микроскоп (широкопольных)	Nikon	LV-150
Микроскоп (конфокальной)	Nikon	A1R
Изображение сплиттер	Фотометрия	DV2
ПЗС-камеры	Фотометрия	CoolSNAP HQ2
Программное обеспечение для обработки изображений	Nikon	NIS Elements
Polyvinylidene мембраны	Kure WrAP
Циркуляр покровным	Bellco	5CIR-1-BEL	5 мм, толщина № 1
Клей (покровного стекла, чтобы мембрана)	Pattex	Flussig (жидкость)	Для нанесения покровного стекла для мембраны
Клей (покрытие скольжения для мыши)	Pattex	Гель	Для крепления мембраны для мыши
Хирургическое труб	Intramedic	PE50, PE10
Шов	Рыбак		4:00 шелка
Электробритва	Остер	78997
Изогнутые хирургических щипцов	Roboz
Прямо хирургических щипцов	Roboz
Хирургические ножницы	Roboz
Хирургическое microscissors	Roboz
Хирургические иглы водитель	Roboz
Хирургическая лента	Рыбак
Губки кухонные (разрезать на дольки)	различный