Medición in vivo de la capa de ratón pulmonar superficie endotelial

Resumen

El endotelio glicocalix / endotelial capa superficial está muy bien estudiada mediante microscopía intravital. Microscopía intravital es técnicamente difícil en un órgano en movimiento, como el pulmón. Se demuestra cómo simultánea campo claro y microscopía de fluorescencia se puede usar para estimar el espesor de capa de la superficie endotelial en un libremente moviendo In vivo Pulmón de ratón.

Resumen

El glicocálix endotelial es una capa de proteoglicanos y glicosaminoglicanos asociados que recubren el lumen vascular. In vivo, el glicocáliz es altamente hidratada, formando una capa sustancial superficie endotelial (ESL) que contribuye al mantenimiento de la función endotelial. A medida que el glicocalix endotelial es a menudo aberrante in vitro y se pierde durante las técnicas estándar de fijación del tejido, el estudio de la ESL requiere el uso de microscopía intravital. Para mejor se aproximan a la compleja fisiología de la microvasculatura alveolar, formación de imágenes intravital pulmonar se realiza idealmente en un pulmón de libre movimiento. Estas preparaciones, sin embargo, sufren típicamente de un artefacto de movimiento extensa. Se demuestra cómo tórax cerrado microscopía intravital de un pulmón de ratón libremente de movimiento se puede utilizar para medir la integridad del glicocálix a través de la exclusión de ESL fluorescente marcada con dextranos de alto peso molecular a partir de la superficie endotelial. Esta técnica quirúrgica no recuperación, que requierecampo claro y simultánea de imagen fluorescente de la pulmón de ratón, permite la observación longitudinal de la microvasculatura subpleural sin evidencia de la inducción de lesión pulmonar confusión.

Introducción

El glicocálix endotelial es una capa extracelular de proteoglicanos y glicosaminoglicanos asociados que recubren la íntima vascular. In vivo, el glicocáliz es altamente hidratada, formando una capa sustancial superficie endotelial (ESL) que regula una variedad de funciones endoteliales incluyendo permeabilidad del fluido ^1, neutrófilos endotelial adhesión ^2, y ³ de la mecanotransducción fluido esfuerzo cortante.

Históricamente, el glicocálix ha sido subestimado debido a su aberración en preparaciones de células cultivadas de ^{4, 5} y su degradación durante la fijación del tejido estándar y de procesamiento ^6. El creciente uso de la microscopía intravital ⁷ (microscopía in vivo, IVM) ha coincidido con mayor interés científico en la importancia de la ESL para la función vascular en la salud y la enfermedad. El ESL es invisible para microscopía de luz y no pueden ser fácilmente etiquetados enin vivo, dada la propensión de fluorescentes glicocálix lectinas de unión a causar aglutinación de RBC ⁸ y embolia pulmonar no fatal (observaciones no publicadas). Varios enfoques indirectos, se han desarrollado para deducir espesor ESL (y, por extensión, la integridad glicocáliz) que no se mueven en los lechos vasculares tales como los microcirculations cremastéricos y mesentérica. Estas técnicas incluyen la medición de las diferencias en la velocidad de circulación de micropartículas como una función de la distancia de la membrana endotelial (velocimetría de imagen de micropartículas ^9), así como la medición de la exclusión de los voluminosos, marcadas con fluorescencia marcadores vasculares (por ejemplo dextranos) de la superficie endotelial (técnica de exclusión de dextrano ^{10, 11).} De estas técnicas, sólo la exclusión de dextrano es capaz de estimar ESL espesor de las mediciones realizadas en un solo punto en el tiempo. Midiendo simultáneamente anchuras vasculares usando microscopía de campo claro (una anchura enconcluyente de la "invisible" ESL) y microscopía de fluorescencia de un trazador vascular excluidos de la ESL, espesor ESL se puede calcular como la mitad de la diferencia entre las anchuras de ² vasculares.

El uso de una medida instantánea de espesor ESL es muy adecuado para el estudio de la glicocálix pulmonar. Microscopía intravital del pulmón es un reto, dado artefacto significativo movimiento pulmonar y cardiaca. Aunque los avances recientes permiten la inmovilización de los pulmones del ratón in vivo ^{12, 13,} existen dudas acerca del impacto fisiológico de pulmón estasis. Inmovilidad de pulmón se asocia con disminución de óxido nítrico endotelial señalización ^14, una vía de señalización que afecta tanto a la adhesión de neutrófilos ¹⁵ y lesión pulmonar ^16. Además, la inmovilización de un área de pulmón expone que rodea a los alvéolos móviles perjudiciales fuerzas de cizallamiento (la denominada "atelectrauma"), de acuerdo con los conceptos clásicos fisiológicos deinterdependencia alveolar ^17.

En 2008, Arata Tabuchi, Kuebler Wolfgang y sus colegas desarrollaron una técnica quirúrgica que permite la microscopía intravital de un pulmón de ratón con libertad de movimiento ^18. Artefacto respiratorio resultante de esta técnica puede ser negado por el uso de imágenes de alta velocidad, incluyendo la medición simultánea de campo claro y microscopía fluorescente. En este informe, se detalle cómo imagen instantánea exclusión dextrano se puede emplear para medir el espesor de ESL en la microcirculación subpleural de un pulmón de ratón de libre movimiento, in vivo. Esta técnica se puede modificar fácilmente para determinar glicocálix función, específicamente, la capacidad de un intacta ESL para excluir circulante elementos de la superficie endotelial. Recientemente hemos usado estas técnicas para determinar la importancia de la integridad pulmonar ESL para el desarrollo de lesión pulmonar aguda durante enfermedades inflamatorias sistémicas tales como sepsis ^2.

Protocolo

1. Preparación de tubos quirúrgicos, catéteres vasculares, Ventana pared torácica

1. Etapa microscopía intravital. Hemos hecho a medida de una etapa de plexiglás sobre la que se encuentra el ratón anestesiado durante la microscopía. Esta etapa se adapta tanto a un 15 cm por 10 cm flexible, tabla de cortar de plástico (en la que el ratón se encuentra durante la inducción de la anestesia, la colocación de traqueotomía, y el cateterismo venoso), así como un elemento de calentamiento de tamaño similar (situado debajo de la tabla de cortar).
2. Ratón toracostomía preparación del tubo (Figura 1). Una longitud de 10 cm de tubo PE 50 (Intramedic, diámetro interno 0,58 mm, diámetro exterior 0,965 mm) se corta. Un extremo está unido al extremo romo de una aguja de calibre curvo 23; esta aguja se utiliza para pasar el tubo a través de la pared torácica (interior → exterior) antes del cierre de la ventana torácica.
   El extremo distal del tubo (1,5 cm de longitud, opuestas a la adjunta calibre 23aguja) es repetidamente pinchado con una aguja de calibre 30, la creación de "puertos secundarios" para facilitar una eficaz aspiración de aire intratorácica.
   Esta porción fenestrado es entonces separada del resto del tubo por varios bucles circunferenciales de sutura de seda 4:00; estos bucles servirá como un "tapón", en última instancia, el anclaje de los 1,5 cm fenestrado porción dentro de la cavidad torácica.
3. Catéteres venosos yugulares. Dos 15 cm de longitud de tubo de PE 10 (Intramedic, diámetro interno 0,28 mm, diámetro exterior 0,61 mm) se cortan. Se utiliza un bisturí para biselar los extremos del tubo, lo que aumenta la facilidad de la venopunción. El tubo se vacía a través de una jeringa de 1 ml que contenía 6% 150 kDa solución de dextrano (en PBS) unido al extremo no biselado de la tubería.
4. Chest preparación ventana de la pared (Figura 2). Membrana transparente de polivinilideno (New Kure Wrap, Kuresha, Tokio) se corta en una forma ovalada (eje principal 6 cm, eje menor 4 cm). Una circular de 5 mm # 1 cubreobjetos (Bellco) se fija a la membrana utilizando α-cianoacrilato pegamento (Pattex flüssig, Henkel, Düsseldorf).
5. . Tubo para la inducción de neumotórax ("tubo de soplado") A 10 cm de longitud de tubo (diámetro interior 3 mm, diámetro exterior de 5 mm) se une a una jeringa de 5 ml, y el extremo opuesto se utiliza para introducir aire dentro de la jaula para animales torácica antes de injerto ventana de la pared torácica.
6. Jeringa para la inmersión en agua de objetivo. Una aguja de calibre 23 está unido a una jeringa de 30 ml que contiene agua destilada. La punta de la aguja está embotado (usando una lima de metal) con el fin de evitar daños en el objetivo.

2. Ratón Anestesia

1. Un ratón se anestesia con una mezcla de ketamina (10 mg / ml) y xilazina (2 mg / ml), administrado por vía intraperitoneal a una dosis de 8 l por gramo de peso corporal del ratón. La sedación se produce a menos de 3 - 6 min y no debe impedir la respiración espontánea.
2. Usando una máquina de afeitar eléctrica, afeitarsela garganta, el pecho, el abdomen, y el lado derecho del ratón.
3. Con cinta, asegure el ratón a un tablero plástico de corte fino. El jefe del ratón debe apuntar hacia el operador (Figura 3). Tensión suave proporcionada por un bucle de sutura que pasa por debajo de los dientes superiores sirve para mantener la extensión de la cabeza. El tablero de corte se coloca sobre una almohadilla térmica, manteniendo euthermia ratón durante la traqueotomía y la colocación del catéter venoso.
4. Moje las zonas rasuradas con un 100% de etanol.
5. Confirme anestesia adecuada con una pizca de cola / pata. Proceda si la respuesta mínima, proporcionar un bolo adicional de si no ketamina / xilazina adecuadamente anestesiado.

3. Traqueostomía

1. Se hace una incisión de 1 cm sobre la garganta. Tejido conectivo subyacente se disecciona, y las glándulas salivales se separan y se refleja lateralmente. El músculo esternohioideo inmediatamente anterior a la tráquea se reseca.
2. Un bucle de sutura 04:00 se hace avanzar bajo the tráquea (Figura 4). El bucle se corta entonces, la creación de dos filamentos separados de sutura que subyacen a la tráquea. La sutura de caudal se utilizan para asegurar el tubo de traqueotomía; la sutura craneal se utiliza para proporcionar la tensión en la tráquea durante la colocación de traqueotomía.
3. Usando dos dedos, la sutura superior es agarrado y ligera tensión se aplica a la tráquea. Una incisión horizontal en la tráquea superior e inferior entre las suturas. Esta incisión debe cruzar aproximadamente dos tercios de la circunferencia traqueal. Un tubo de traqueotomía con pestaña (Harvard Apparatus, 1,22 mm de diámetro exterior) se inserta en la tráquea distal y se fija en su lugar usando la sutura traqueal caudal.
4. La traqueostomía está conectado a un ventilador para animales volumen controlado pequeño (Inspira, Harvard Apparatus), y el ratón se ventila con 40% de oxígeno inspirado y 9 ml / kg volúmenes corrientes (ajustes optimizados para mantener una adecuada oxigenación / ventilación en nuestro laboratorio). Positiva presión espiratoria final (PEEP) no se comienza en este punto. Es de destacar que los parámetros del ventilador debe ser optimizado para las condiciones únicas dentro de cada laboratorio. Diferentes longitudes de tubo redundante (interpuesto entre el tubo del ventilador conector en Y y de traqueotomía) se puede utilizar para ajustar el espacio muerto, lo que garantiza la ventilación alveolar estable para cualquier volumen tidal elegido.

4. Cateterismo Venoso

1. La unión de la vena yugular interna y externa pueden ser identificadas mediante el seguimiento de las ramas distales venosa proximal. La yugular externa se encuentra debajo de las glándulas salivales se refleja, lo que puede atribuirse proximalmente para encontrar el cruce yugular externa-interna.
2. Use disección roma suave para separar la unión yugular de tejido conectivo circundante.
3. Con suturas 4:0, ligar las venas yugulares externas yugular interna y distales (craneal) hasta el cruce yugular.
4. Haga una pequeña incisión en la carinade la unión yugular, sangrado debe ser mínimo.
5. Dos catéteres puede ser incrementalmente avanzar a través de la incisión y en el tronco yugular. Después de la aspiración suave para garantizar el retorno de sangre, catéteres se sujeta dentro de la vena mediante suturas 04:00.
6. Catéteres venosos cinta a la tabla de cortar para prevenir contra desplazamiento accidental.

5. Pulmón de ratones Microscopía intravital Cirugía (adaptado de Tabuchi et al. ¹⁸⁾

1. El tablero de corte (que contiene el ratón contenida, anestesiados, así como grabadas catéteres venosos) es la transición a la etapa de microscopía intravital, donde las intervenciones quirúrgicas restantes se llevará a cabo. Una sonda de temperatura rectal se coloca; Esto se relaciona con un sistema de calefacción de adaptación (que se encuentra debajo de la tabla de corte), lo que permite el mantenimiento de euthermia ratón.
2. Un catéter venoso yugular está unido a una bomba de jeringa que proporciona una mezcla de cetamina (10 mg / ml)-xilazina (2 mg / ml)mezcla a 200 l por hora. Anestesia adecuada se confirma de nuevo usando la cola / pata pellizco.
3. La incisión de línea media se extiende desde el cuello hasta el apéndice xifoides, procediendo después lateralmente hacia el lado derecho (Figura 5).
4. Usando electrocauterización, la musculatura del pecho se retira, dejando al descubierto la caja torácica. Se tiene cuidado de asegurar la hemostasis completa.
5. Cruce pata trasera derecha del ratón sobre el lado izquierdo y cinta adhesiva. La torsión resultante abdominal gira ligeramente el tórax, la mejora de la facilidad de la cirugía.
6. Coloque el escenario en un ángulo de 45 grados (Figura 6), esta posición permite que el pulmón se apartarán de la pared del pecho una vez que el neumotórax es inducido.
7. La costilla ^st 1 (costilla más inferior) se sujeta con una pinza y se crió; unas pinzas curvas es empujado bruscamente por debajo de la costilla. Esto separa pleura parietal de la pared torácica. La pleura debe permanecer unpunctured.
8. Uso del tubo de soplado yuna jeringa, el aire es introducido a la fuerza en contra de la pleura parietal. Esto conduce a la ruptura de la superficie pleural y neumotórax sin dañar el pulmón subyacente. El pulmón subyacente caerá lejos de la pared del pecho, lo que permite la introducción de un fórceps de electrocauterización sin dañar el pulmón. Una disminución en el volumen tidal ventilador no se requiere típicamente durante este paso.
9. Usando una pinza electrocauterio, diseccionar la musculatura de la pared torácica y cortar a través de las 5 ^ª y 6 ^ª costillas / pleura parietal, lo que hace un ~ 8 mm agujero circular en la pared torácica. Es esencial que se mantenga una hemostasia completa, como la presencia de sangrado se oscurecen microscopía (Figura 7).
10. Utilizando el controlador de aguja, inserte el tubo de toracostomía en el agujero de la pared torácica. La aguja debe perforar la pared del pecho y salir de la cavidad torácica inferior y lateral a la ventana torácica (Figura 7). Tenga cuidado de no perforar el diafragma. Latubo entonces se tira suavemente de la pared del pecho hasta que ocurre la resistencia de la sutura "tapón" situado en el borde de la parte de orificios en el tubo.
11. Coloque la etapa plana.
12. Añadir 3 cm H ₂ O de PEEP al ventilador para ayudar a ayudar reexpansión pulmonar.
13. Pegamento (Pattex gel, Henkel) se coloca circunferencialmente alrededor de la ventana de pecho. La membrana se une, con la hoja de la cubierta exterior de vidrio que da a la cavidad torácica. Cuidadosamente (y circunferencialmente) aproximada de la membrana para el pegamento mediante un aplicador de algodón.
14. Durante la realización de una maniobra de reclutamiento pulmonar (3 volúmenes de marea durante el cual el puerto de ventilador PEEP está tapada), -3 mm Hg de succión se aplica al tubo de pecho. El pulmón debe persistentemente se aproximan a la membrana mientras se mueven libremente durante la ventilación tidal (Figura 8).
15. La pata delantera derecha del ratón se cruzaron para el lado izquierdo, lo que resulta en una posición de decúbito lateral izquierdo del ratón.Cuñas de esponja puede utilizarse para colocar correctamente el ratón por lo que la ventana de pecho está alineado con el objetivo microscopía de inmersión en agua.
16. El agua destilada se coloca en la hoja de la cubierta antes de la microscopía, lo que permite la visualización del pulmón utilizando un objetivo de inmersión en agua. El agua tendrá que ser intermitente repone durante todo imágenes.

6. Medición de la pulmonar Espesor Capa superficial endotelial

1. Inmediatamente después de cierre de la pared del pecho, 500 l marcado con FITC 150 kDa dextrano (6% solución en PBS) se administra a través del catéter venoso segundos (sin anestesia) yugular. Este bolo sirve como el volumen de reanimación, así como el marcador vascular para ESL medición. El bolo dextrano no influye en la adhesión de neutrófilos o la formación de edema pulmonar ^2.
2. El objetivo de inmersión en agua está centrado sobre el cubreobjetos. La elección de los objetivos es esencial para visualizar las pequeñas diferencias en el grosor de ESL, un alto Numerical abertura que se necesita (> 0,8), mientras que todavía mantiene un 2 a 3 mm de distancia de trabajo (que permite la penetración a través de la ventana de pulmón y la superficie pleural). Usamos la Nikon CFI 75 LWD 16x (NA 0,8) y TPI 75 LWD 25x (NA 1.1) objetivos para este propósito.
3. Para medir con precisión espesor ESL en un órgano móvil, es esencial que los anchos de campo claro y fluorescencia vasculares se realizan simultáneamente. Esto se puede conseguir utilizando un divisor de la imagen (Dual View, Photometrics) que permite la captura simultánea de la luz reflejada de contraste de interferencia diferencial (DIC, claro) y las imágenes de FITC (Figura 9).
4. Durante una pausa de 5 segundos inspiratorio, continua de imágenes se lleva a cabo y se registra. Posteriormente, estas imágenes pueden ser revisados ​​para identificar en los cuadros de enfoque.
5. El uso de un marco de enfoque, subpleural microvasos (<20 m de diámetro) se identifican, al menos 3 microvasos se encuentran típicamente en un solo marco. Después de la terminación del experimento, DICy FITC-dextrano anchuras vasculares se miden (por un observador ciego) promediando las longitudes de tres intercepta perpendiculares por los microvasos. Suponiendo igual espesor ESL en ambos bordes de la embarcación, el tamaño de ESL puede ser definida por la mitad de la diferencia entre la DIC y FITC-dextrano anchuras vasculares, como se describe en la sección de resultados representativos.
6. Típicamente, la microscopía intravital se puede realizar durante> 90 min sin ninguna evidencia de lesión pulmonar o hipotensión ^2. Los experimentos preliminares se realizaron para confirmar la estabilidad del ratón (presión arterial, la oxigenación, la ventilación, la lesión pulmonar) durante el período de observación. Los medicamentos experimentales pueden ser introducidos a través del segundo catéter (no anestesia) yugular en cualquier momento durante el procedimiento.

7. La medición alternativa de la integridad del endotelio pulmonar capa superficial

Las funciones endoteliales intactas capa superficial (en parte) para excluir circulanteción elementos de la superficie endotelial ^2. Integridad ESL por lo tanto se puede medir por la capacidad de un elemento de circulación (por ejemplo, una microesfera fluorescente) para acceder e interactuar con moléculas de adhesión (tales como ICAM-1).

1. Anti-ICAM-1 marcado con microesferas fluorescentes se preparan antes de la cirugía. Recubiertas de estreptavidina 0,97 micras microesferas fluorescentes son incubadas con biotina de control de anti-ICAM-1 (clon YN1/1.7.4, 1:50, eBioscience) o isotipo de anticuerpo durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las microesferas se lavaron tres veces y se suspendieron en PBS a 1 x 10 ⁹ microesferas por ml.
2. Durante microscopía intravital, la suspensión de microesferas (100 l) se inyecta en el catéter venoso yugular. Después de 15 min de circulación, imágenes fluorescentes se capturaron más de 5 min. Inmóvil durante> 5 min microesferas se considera adherente y se cuantificó usando software de procesamiento de imágenes.

8. Eutanasia

Después de la finalización del procedimiento, los ratones anestesiados son sacrificados por desangrado mediante punción cardiaca directa. La eutanasia se confirmó a través de neumotórax bilateral, después de lo cual los pulmones se cosechan y se congelaron rápidamente para su posterior análisis.

Resultados

El método experimental descrito en los pasos 1-6 se permitir la captura de fotogramas múltiples de DIC simultánea (claro) y las imágenes fluorescentes. Para determinar el espesor ESL, las imágenes grabadas se revisan por un observador ciego después de la finalización del protocolo experimental. El uso de un marco de enfoque, subpleural microvasos (<20 m de diámetro) se identifican, por lo menos 3 microvasos se encuentran típicamente en un solo cuadro (Figura 10). El uso de software de análi...

Discusión

Coincidiendo con la expansión del uso de microscopía in vivo, hay una creciente apreciación tanto para el gran tamaño de la ESL, así como sus numerosas contribuciones a la función vascular. Estos datos emergentes, sin embargo, se derivan principalmente de estudios de la vasculatura sistémica. En efecto, el uso de microscopía in vivo en el pulmón es técnicamente difícil, dado artefacto significativo movimiento pulmonar y cardíaco.

Varios avances...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Nombre de Reactivo
FITC-dextrano (150 kDa)	Sigma	FD150S
TRITC-dextrano (150 kDa)	Sigma	T1287
Recubiertas de estreptavidina microesferas fluorescentes	Bangs Laboratories	CP01F/10428	Dragón verde fluorescente (similar a FITC)
La ketamina	Moore Medical
Xilazina	Moore Medical
Anti-ICAM-1 anticuerpo biotinilado	eBioscience	Clonar YN1/1.7.4	Dilución 1:50
Isotipo de anticuerpo biotinilado	eBioscience	IgG2b eB149/10H5	Dilución 1:50
			EQUIPO
Ventilador mecánico	Harvard Apparatus	Inspira
Traqueostomía catéter	Harvard Apparatus	730028
Aparato de electrocauterización	DRE Medical	Valleylab SSE-2L
Cauterio bipolar fórceps	Olsen Medical	10-1200i	9.9cm McPherson
Temperatura control sistema	World Precision Instruments	ATC1000
Bomba de jeringa	Harvard Apparatus	Bomba Elite 11
Microscopio (campo amplio)	Nikon	LV-150
Microscopio (confocal)	Nikon	A1R
Imagen divisor	Fotometría	DV2
CCD cámara	Fotometría	CoolSNAP HQ2
Software de procesamiento de imagen	Nikon	Elementos NIS
Membrana de polivinilideno	Kure Wrap
Cubreobjetos circular	Bellco	5CIR-1-BEL	5 mm, # 1 espesor
Pegamento (cover slip a la membrana)	Pattex	Flüssig (líquido)	Para fijar cubreobjetos a la membrana
Pegamento (cubierta deslizante para el ratón)	Pattex	Gel	Para la fijación de la membrana de ratón
Tubo quirúrgico	Intramedic	PE50, PE10
Suture	Pescador		Seda 04:00
Rasuradora eléctrica	Oster	78997
Curvados fórceps quirúrgico	Roboz
Straight pinzas quirúrgicas	Roboz
Tijeras quirúrgicas	Roboz
Micro tijeras quirúrgicas	Roboz
Conductor aguja quirúrgica	Roboz
Cinta quirúrgica	Pescador
Esponjas de cocina (cortado en trozos)	vario