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摘要

植物提供了一种新的系统，以商业规模生产药物蛋白，更具可扩展性，成本效益和安全比目前的表达范式。在这项研究中，我们报告一个简单方便，且可扩展的方法，引入目标基因农杆菌

摘要

哺乳动物细胞培养物是主要的商业化生产人用疫苗和治疗性蛋白质的平台。但是，它不能满足日益增长的全球需求由于其有限的可扩展性和成本高的药品。植物已证明是最有前途的替代，健壮，可伸缩的，低的成本和安全的药品生产平台之一。最近开发的基于病毒的载体，使快速和高层次的重组蛋白在植物中的瞬时表达。为了进一步优化瞬时表达系统的效用，我们展示了一个简单，高效，可扩展的方法引入到植物组织在这项研究中含有目标基因的农杆菌 。我们的研究结果表明，农杆菌与注射器和真空方法所导致的农杆菌介导的高效引入到两个荧光蛋白的叶子和严谨的生产; GFP和DsRed的。此外，我们展示了这两种方法所提供的独特的优势。注射器浸润简单，不需要昂贵的设备。它也允许灵活地渗透到整个假与靶基因，或在一个叶片上的多个目标基因引入。因此，它可以用于实验室规模的重组蛋白的表达，以及用于比较不同的蛋白质或载体的产率或表达动力学。简单的注射器渗透也表明其效用为主题的生物技术在高中和大学教育。与此相反，真空渗入是更强大的，并可以按比例增加的商业生产药用蛋白。它还提供了能够agroinfiltrate植物物种不适合如生菜和拟南芥浸润注射器的优势。总体而言，结合注射器和真空农杆菌的研究人员和教育工作者提供了一个简单，高效和强大的方法瞬态蛋白表达。这将大大促进药物蛋白和发展，促进科学教育。

引言

自20世纪70年代以来，植物已被探讨，作为替代品的哺乳动物，昆虫，细菌的细胞培养物的商业生产重组蛋白和蛋白质疗法1。以植物为基础的系统，生物制药的表达，表明承诺在最近几年一些新的治疗方法的疾病，如高雪氏病，H5N1禽流感3，在临床试验中显示了成功。主管机制的开发重组蛋白在植物中表达的几十年中，因为这些最初的实验中已经创建了用于植物为基础的系统中，有三个主要理由改变目前的蛋白质生产范式的潜力。首先，有一个显着的成本下降所致哺乳动物，昆虫，细菌的生物反应器需要相当大的启动成本，昂贵的生长介质，下游纯化的复杂工序4。创造稳定的转基因植物线也可以让他们超越其他表达系统的可扩展性蛋白表达植物可以种植和收获的农业规模5。其次，以植物为基础的表达系统中显着地减少从对人类的蛋白质表达的主机发送的人或动物的病原体的危险性，展示在公众安全6的优越性。最后，植物利用类似于哺乳动物细胞的真核细胞内膜系统，可以进行适当的翻译后修饰的蛋白质，包括糖基化和组件的多个亚单位蛋白质7。这种能力使植物为基础的系统，提前基于原核系统中，如细 ​​菌，因为一个更广泛的重组蛋白类药物，包括单克隆抗体（mAbs），有一个更复杂的结构，并需要大量的翻译后修饰或组件8。

有两个主要的适当疼痛在植物中表达的重组蛋白。第一个是一个稳定的转基因品系，克隆到编码目标蛋白的DNA的表达盒引入到无论是核或叶绿体基因组的发展​​。这样做，外源DNA变成通过遗传后代，可以极大地提高了可扩展性，远远超出其他表达系统1。核基因组的外源DNA的通常是由根癌土壤杆菌感染植物组织实现，或较少，通过微粒轰击的组织9。然后，使用植物激素诱导分化和生长的转基因植物组织如根和叶。无法实现的叶绿体基因组中的变换可以与甲农杆菌 ，但完全依赖于黄金或钨颗粒涂发射弹道与DNA导入植物细胞。表达recombina的第二种方法nt的蛋白质在植物中的瞬时表达通过10。在这种情况下，感兴趣的基因的病毒衍生的载体传递通过A。经历一个过程的充分开发植物叫农杆菌农杆菌。相反交付的基因构建体整合到植物基因组，然后将开始，直接瞬态生产所需的蛋白质，它可以被收获和一个短的潜伏期后，分离。瞬时基因表达提供了更大的整体蛋白的积累，以及一个改进的时间生产蛋白质的优势，如植物准备收获后约1-2周农杆菌11。这是明显快于稳定的转基因植物线，这可能需要数个月至一年的生成，选择和确认的过程。然而，这也是瞬时表达系统的局限性，因为它不会产生遗传稳定的工厂里未列名可以用来产生大规模的商业生产的种子银行。尽管这样的方法已被开发以提高大规模的瞬时表达。在这里，我们演示了一种瞬态蛋白表达烟草植物由A.交付使用解构病毒载体的代农杆菌 。

A.交付正在开发的两个主要方法农杆菌进入植物组织:台秤通过注射器通过真空室的大规模渗透浸润。这里描述的这两个协议都使用N.本生，这是密切相关的普通烟草厂，寄主植物两个荧光蛋白的瞬时表达绿色荧光蛋白（GFP）的，从水母维多利亚和红色荧光蛋白从Discosoma珊瑚（红色荧光蛋白）12,13。 N.本生是最常见的寄主植物重组蛋白，因为它是服从遗传转化，可以产生大量的生物质迅速，是一位多产的种子生产，规模化生产14。的另一个优点，使用全本生作为蛋白表达的主机是可用的多种表达载体2,5。在这项研究中，两个解构病毒载体的烟草花叶病毒（TMV）RNA复制系统（MagnICON向量）和豆黄矮病毒（BeYDV）DNA复制系统（geminiviral向量）4,11是来自于其他的，基于15-18，都是用来携带绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白基因，并把他们交N. A.本生细胞通过根癌农杆菌的三DNA构建将被使用的GFP或红色荧光蛋白与MagnICON载体的表达。它们包括的5'模块（pICH15879）含有启动子和其他的遗传元件的驱动表达的靶基因，含有感兴趣的基因的3'模块（PICH-GFP或PICH红色荧光蛋白），以及整合模块（pICH14011）编码一种酶，它集成了5'和3'的模块组合在一起表达后8,15。 3个DNA构建体，还需要表达用geminiviral载体。除了 ​​含有的的目标的基因（pBYGFP或pBYDsRed）的复制的载体，载体编码复制蛋白（pREP110）的扩增所需的目标复制11,14,16。此外，列入番茄丛矮病毒的载体沉默抑制p19的是理想的高层次目标基因的表达11,16。

一般而言，有三种主要的步骤引入到植物细胞的基因重组蛋白通过农杆菌包括植物生长，A.根癌土壤杆菌培养制备，渗透。作为此过程的最终成功的每一步都是关键，因此，详细描述每个两个注射器渗透和下面的真空渗透。

研究方案

1。植物生长

  1. 将60泥炭颗粒成传播托盘。加入4升自来水和2小时让泥炭颗粒吸收水分。
  2. 添加2 N.本生种子使用播种机，到每个泥炭颗粒覆盖托盘用一个透明的塑料球，让他们在一个25°C，湿度84％的环境与16/8小时日/夜循环（ 图1A）发芽。
  3. 取下球形播种后两周，从托盘排水，杰克的化肥加2升的浓度为1.48克/升（ 图1B）。继续生长的植物，在25°C，湿度50％的环境与16/8小时日/夜循环。供应杰克的肥料，每2天每盘2升。
  4. 第4周时，泥炭颗粒的植物转移到一个新的的托盘承载六家工厂提供足够的空间进一步增长（ 图1C），直到他们准备好要渗透在6周龄（ 图1D）。

2。 农杆菌文化准备

2.1注射器入渗的制备

  1. 数A.根癌农杆菌菌株GV3101菌株包含矢量geminiviral p19的，pREP110，pBYGFP，含有卡那霉素（100微克/毫升）的LB琼脂平板上pBYDsRed的。连续一株每板48小时，在30℃和成长。
  2. 同样地，条纹和生长在LB琼脂培养基上的菌株GV3101菌株窝藏MagnICON的载体的5'模块（pICH15879），3'模块包含靶基因，绿色荧光蛋白，红色荧光蛋白（PICH-GFP或PICH-DsRed的），和整合酶（pCH14011）板含有羧苄青霉素（100微克/毫升）。
  3. 从LB琼脂平板上的单菌落，接种菌株GV3101菌株窝藏geminiviral载体分为3毫升YENB媒体（0.75％细菌酵母提取物，0.8％营养肉汤中，用NaOH调节pH值至7.5）+卡那霉素（100微克/毫升）在一个15毫升的圆底培养管，增长在30℃的液体培养基摇床过夜300 rpm的旋转速度。
  4. 同样，接种和GV3101菌株窝藏MagnICON矢量在YENB媒体+羧苄青霉素（100微克/毫升）中的摇床过夜，在30℃下生长
  5. 测量并记录为每个培养液的OD 600值，用分光光度计，并使用下面的公式计算必要的体积（V 子 ）进行传代培养，在10毫升的YENB媒体与0.025的起始OD 600为一个新的文化与适当的抗生素。
    V基板（毫升）=（10毫升）×（0.025）/ OD 600
  6. 传输V基板（毫升）的过夜培养（10 - V 子 ）每个菌株在含有适当抗生素毫升的YENB媒体。植物新培养过夜，在30℃下在250 rpm的旋转速率的混合器，直到OD 600值在1.7-2.0的范围内。
  7. 测量和记录OD 600值，每个液体培养和使用下面的公式，计算ulate必要的体积（V INF渗透缓冲液在50毫升）稀释，使最终OD 600为0.12，而每个菌株。
    = INF V（毫升）（50毫升）×（0.12）/ OD 600
  8. 传输V INF（毫升）的离心管中的每一种文化和降速细胞离心12,000 XG 2分钟，取出上清液，然后悬浮细胞10毫升渗透缓冲液（10毫米的MES，pH值5.5; 10毫米硫酸镁4）振荡简要。
  9. 混合再悬浮pBYGFP + pREP110 + p19的细胞中，旋转的细胞以12,000 xg离心2分钟，共50毫升渗透缓冲液中重悬。此农杆菌组合GFP geminiviral表达。
  10. 同样，以下组合农杆菌细胞混合，降速，重悬在50毫升的渗透液。它们包括（1）pBYDsRed的+ pREP110 + P19 geminiviral红色荧光蛋白的表达，（2）pBYGFP + pBYDsRed + pREP110+ p19的为geminiviral共表达GFP和DsRed的，（3）pREp110 + p19的作为阴性对照的geminiviral表达，（4）PICH-GFP + pICH15879 + pCH14011为MagnICON GFP表达，（5）PICH-DsRed的+ pICH15879 +中pCH14011为MagnICON红色荧光蛋白的表达，及（6）pICH15879 + pCH14011作为的MagnICON表达的阴性对照。

2.2真空渗透

  1. 接种和培养各菌株GV3101菌株含有geminiviral载体或MagnICON的载体到15毫升YENB介质中与适当的抗生素在一个50毫升的高压灭菌的烧瓶中生长过夜，上述注射器浸润。
  2. 测量并记录为每个培养液的OD 600值，用分光光度计，并使用下面的公式计算必要的体积（V 子 ）的一种新的文化与继代培养的起始OD 600为0.025在250毫升的YENB媒体与适当的抗生素。
    V基板 （毫升）=（250毫升）×（0.025）/ OD 600
  3. 传输V SUB（毫升）过夜培养（250 - V 子 ），1升量瓶中，用适当的抗生素每一株蒸压的YENB媒体毫升过夜所描述的上述注射器浸润成长的新的文化。
  4. 测量和记录为每个培养液OD 600值，并使用下面的公式来计算必要的体积（V INF）在3升的渗透缓冲液稀释，使最终OD 600为0.12，而每个菌株。
    INF V（毫升）=（3000毫升）×（0.12）/ OD 600
  5. 颗粒和重悬V INF（毫升）各培养中所描述的注射器浸润和渗透缓冲液混合再悬浮培养的按照上述注射器浸润组合获得。 Repellet混合农杆菌细胞和悬浮在3 L的渗透液。

3。浸润

3.1注射器渗透

  1. 选择4个6周龄N. benthamiana植物叶5。从每一株植物的顶部算起的第一个三片叶子将会完全A.组合与渗透农杆菌株渗透液。第四片叶子是现货渗透所有四个​​应变组合geminiviral表达或全部三个组合MagnICON表达的。每个工厂将最后一片叶子渗透与阴性对照组的组合。
  2. 创建一个小缺口，用针在表皮中的叶的背面侧（ 图2A）。注意:确保不要划伤这么难刺穿叶通过双方农杆菌细胞渗透混合物中，将通过穿刺到另一侧的叶。
  3. 牢牢把握叶的正面，而申请温柔反压的缺口，用一只手的拇指， 农杆菌在渗透缓冲液的混合物注入到缺口中，与无针注射器（ 图2B）。注:由于农杆菌混合物进入叶的间隙，渗透的区域会变成明显的深绿色（ 图2C）。
  4. 继续农杆菌混合物注入到暗绿色圆圈的缺口，直到停下来扩大。创建另一个缺口，并重复步骤3.1.2-3.1.4直到整个叶片渗透和全叶前三树叶和最后一片叶子变成深绿色。
  5. 对于第四每一株植物的叶，所有四个（geminiviral矢量）或三个（矢量MagnICON）的组合将被渗入。 农杆菌菌株的每一种组合的车型一个缺口，并且渗透与组合每个缺口。
  6. 浸润后，将植物生长室和监器后2-15天浸润（dpi）的蛋白表达之间。

3.2真空渗入

  1. 真空干燥器和转让3 L渗透缓冲液农杆菌菌株浴缸放置一个浴缸。将到VACUUBRAND隔膜真空泵（ 图3A）的干燥器中。
  2. 将植物倒挂干燥器板（ 图3B）和降低板的工厂被淹没，直到整个叶和茎系统渗透缓冲板搁在浴缸之上。将干燥器O形圈沿边缘和上腔放干燥器的盖子（ 图3C）。
  3. 打开真空泵，并开始计时，当真空度达到100毫巴。慢慢打开释放阀，干燥器在100毫巴1分钟后，，允许进入农杆菌成沉水植物组织间隙。重复此步骤的其他onal时间，以确保良好的浸润性。
  4. 后浸润，使工厂的干燥器中，把它恢复到直立位置。搬厂的增长空间和2-15 dpi的显示器之间的蛋白表达。

4。荧光蛋白的检测及摄影

  1. 从2 DPI，搬厂到黑暗的房间，渗透叶子的背面用手提式UV灯UV光照耀。
  2. 观察红色荧光蛋白GFP或红色荧光的绿色荧光。 GFP散发出更强的信号与长波紫外线光，而红色荧光蛋白是强短波紫外线光下。
  3. 一个普通的数码相机，没有闪光灯，拍照荧光叶。
  4. 搬厂后观察或摄影的增长空间。

结果

1。用注射器入渗荧光蛋白的表达

为了演示注射器农杆菌浸润到植物组织中的有效性，我们测试了两个荧光蛋白- GFP和DsRed -表达两种不同的解构植物病毒载体- geminiviral和MagnICON -在N本生 。对于N。本生的叶子被完全渗透与农杆菌的含geminiviral的载体，观察GFP的表达，在整个叶面积在紫外光下从早2 dpi的4 DPI（ 图4C）达到峰值积累。这种早期的...

讨论

全球蛋白质为基础的药品的日益增加的需求所需要的新的生产平台，健壮，可伸缩的，低的成本和安全。植物已显示出是一个最有前途的替代生产系统生产药用蛋白。近年来，开发的解构的病毒为基础的载体已启动，瞬时表达的蛋白质在植物中，从而大大提高了植物表达系统2,10的速度和产率。为了进一步优化瞬时表达系统的效用，我们展示了一个简单而有效的和可扩展的方式引入到植物?...

披露声明

作者没有竞争经济利益。

致谢

我们感谢R. Sun和其他学生陈的实验室所作出的贡献，植物材料的产生。我们也感谢D.格林博士对他的支持本科生科研技术和创新学院（CTI）。这项研究是由美国国立卫生研究院资助U01 AI075549和1R21AI101329陈问:和上证授予CTI亚利桑那州立大学的陈问:部分支持。 ，J. M.登特·柳辛格·乌尔塔多和J. Stahnke是由上证所补助金支持的本科生。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
GFP InvitrogenV353-20www.invitrogen.com See reference: Lico and Chen, et al 2008
DsRedClontech632152www.clontech.com See reference: Baird and Zacharias, et al 2000
MagnICON VectorIcon Geneticsn/awww.icongenetics.com See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006
Geminiviral VectorAuthor's Labn/aSee reference: Chen and He, et al 2011
N. benthamianaAuthor's Labn/aherbalistics.com.au
Agrobacterium tumefaciens strain gv3101Author's Labn/aSee reference: Lai and Chen 2012
LB Agar Carbenicillin-100, platesSigmaL0418www.sigmaaldrich.com
LB Agar Kanamycin-50, platesSigmaL0543www.sigmaaldrich.com
Magnesium sulfate hepa hydrateSigmaM2773-500 gwww.sigmaaldrich.com
Bacto-TryptoneFisher73049-73-7www.fishersci.com
Bacto Yeast ExtractBecton, Dickinson & CO.REF 212750www.bd.com
Difco Nutrient BrothBecton, Dickinson & CO.REF 234000www.bd.com
MES hydrate BufferSigmaM8250-1kgwww.sigmaaldrich.com
CarbenicillinSigmaC1613-1MLwww.sigmaaldrich.com
KanamycinSigma70560-51-9www.sigmaaldrich.com
Sodium HydroxideSigma221465www.sigmaaldrich.com
Jack's FertilizerHummert InternationalJul-25www.hummert.com
Equipment
Vacuubrand MD4 Vacuum PumpFisher13-878-113www.fishersci.com
Vacuum Air Regulator ValveFisherNC9386590www.fishersci.com
Desiccator 12 1/8" with O ringFisher08-594-15C www.fishersci.com
3 L TubRubber-Maidn/aRubbermaid Servn' Saver Bowl, 10-cup will work
plate/shelf 230MLFisherNC9489269www.fishersci.com
Peat PelletHummert International14-2370-1www.hummert.com
Propagation Tray Domehydrofarm132052www.hydroponics.net
Propagaiton Trayhydrofarm138758www.hydroponics.net
Virbo Hand SeederGro-Mor INCn/awww.gro-morent.com
Flora Cart 4 shelfHummert International65-6924-1www.hummert.com
15 ml Round Bottom Culture TubesSigmaCLS430172-500EAhttp://www.sigmaaldrich.com
SpectrophotometerBio-Rad170-2525www.bio-rad.com
Spectrophotometer CuvettesBio-Rad223-9950www.bio-rad.com
Microcentrifuge TubesUSA Scientific1415-2500www.usascientific.com
Benchtop CentrifugeBio-Rad166-0602EDUwww.bio-rad.com
Incubator/ShakerEppendorfExcella E25www.eppendorf.com
Ultraviolet Light Model#: UVGL-25UVP95-0021-12www.uvp.com

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