Effiziente Agroinfiltration von Pflanzen für High-Level-Transient Expression von rekombinanten Proteinen

Zusammenfassung

Pflanzen bieten ein neuartiges System für die Produktion von pharmazeutischen Proteinen in einem kommerziellen Maßstab, die besser skalierbare, kosteneffiziente und sichere als aktuellen Ausdruck Paradigmen ist. In dieser Studie berichten wir über eine einfache und bequeme, aber skalierbaren Ansatz zur Ziel-Gen enthält, einführen Agrobacterium tumefaciens In Anlagen zur Protein transiente Expression.

Zusammenfassung

Säugerzellen ist das wichtigste Plattform für die kommerzielle Produktion von menschlichen Impfstoffen und therapeutischen Proteinen. Allerdings kann es nicht die steigende weltweite Nachfrage nach Arzneimitteln wegen seiner begrenzten Skalierbarkeit und hohe Kosten. Pflanzen haben gezeigt, dass eine der vielversprechendsten alternativen pharmazeutischen Produktion Plattformen, die robuste, skalierbare, kostengünstige und sicher sind. Die jüngste Entwicklung von Virus-basierten Vektoren hat rasche und High-Level transiente Expression von rekombinanten Proteinen in Pflanzen erlaubt. Zur weiteren Optimierung der Nützlichkeit des transienten Expressionssystem zeigen wir eine einfache, effiziente und skalierbare Methode zur Target-Gen, das in Agrobacterium Pflanzengewebe einzuführen in dieser Studie. Unsere Ergebnisse zeigen, dass sowohl mit Agroinfiltration Spritze und Vakuumverfahren bei der effizienten Einführung von Agrobacterium in Blätter und robuste Produktion von zwei fluoreszierenden Proteinen geführt haben; GFP und DsRed. Fernerdemonstrieren wir die einzigartigen Vorteile von beiden Methoden angeboten. Spritze Infiltration ist einfach und braucht keine teure Ausrüstung. Es ermöglicht auch die Flexibilität, um entweder die gesamte infiltrieren verlassen mit einem Ziel-Gen oder von Genen von mehreren Zielen auf ein Blatt einzuführen. So kann es für Labormaßstab Expression rekombinanter Proteine ​​sowie für den Vergleich verschiedener Proteine ​​oder Vektoren für die Ausbeute oder Expressionskinetik verwendet werden. Die Einfachheit der Spritze Infiltration schlägt auch ihre Nutzbarkeit in der High School und College-Ausbildung für das Fach Biotechnologie. Im Gegensatz dazu ist Vakuuminfiltration robuster und Scale-Up für die kommerzielle Herstellung von pharmazeutischen Proteinen. Es bietet auch den Vorteil, dass sie in der Lage, Pflanzenarten, die nicht zugänglich sind für Spritze Infiltration wie Salat und Arabidopsis agroinfiltrate. Insgesamt bietet die Kombination aus Spritze und Vakuum Agroinfiltration Forscher und Pädagogen eine einfache, effiziente und robusteMethodik für die transiente Proteinexpression. Es wird dadurch wesentlich erleichtert die Entwicklung von pharmazeutischen Proteinen und Förderung von Wissenschaft Bildung.

Einleitung

Seit den 1970er Jahren haben die Pflanzen als Alternative zu Säugetier-, Insekten-und bakteriellen Zellkulturen für die kommerzielle Produktion von rekombinanten Proteinen und Protein-Therapeutika ¹ untersucht. Plant-basierte Systeme für die Expression von Biopharmazeutika haben Versprechen in den letzten Jahren als mehrere neue Behandlungen für Krankheiten, wie Morbus Gaucher ² und aviäre Influenza H5N1 ³ dargestellt ist, haben gezeigt, Erfolg in klinischen Studien. Die Entwicklung von Mechanismen für die zuständigen Expression rekombinanter Proteine ​​in Pflanzen in den Jahrzehnten seit den ersten Versuchen hat das Potenzial für eine Anlage-basierte Systeme, um die aktuelle Paradigma der Protein-Produktion für drei Hauptgründe verändern erstellt. Erstens gibt es eine bemerkenswerte Abnahme der Kosten als Säugetier-, Insekten und Bakterien Bioreaktoren erfordern erhebliche Anlaufkosten, teure Nährmedien und komplizierte Prozesse für Downstream-Reinigung ^4. Die Schaffung von stabilen transgenen PflanzeLinien ermöglicht ihnen auch die Skalierbarkeit der Systeme übertreffen anderen Ausdruck als Protein exprimieren Pflanzen angebaut und geerntet werden in einem landwirtschaftlichen Skala ^5. Zweitens, auf pflanzlicher Basis Ausdruck Systeme deutlich reduzieren das Risiko der Übertragung eines menschlichen oder tierischen Erreger aus dem Protein-Expression Host für den Menschen, zeigt Überlegenheit in der öffentlichen Sicherheit ^6. Schließlich verwenden Pflanzen einen eukaryotischen Endomembransystem ähnlich Säugerzellen ist, für eine angemessene posttranslationale Modifikation von Proteinen einschließlich Glycosylierung und der Zusammenbau von mehreren Untereinheit Proteine ^​​7. Diese Fähigkeit bringt pflanzliche Systeme vor solche auf Basis von prokaryotischen Systemen, wie Bakterien, da eine größere Anzahl von pharmazeutischen rekombinanten Proteinen, einschließlich monoklonale Antikörper (mAbs), eine kompliziertere Struktur und erfordern umfangreiche posttranslationale Modifikationen oder Anordnung ^8.

Es gibt zwei große entspreschmerzt zu Expression rekombinanter Proteine ​​in Pflanzen. Die erste ist die Entwicklung einer stabilen transgenen Linie, wobei DNA, die für das Zielprotein in eine Expressionskassette kloniert und eingeführt, um die Kern-oder Chloroplastengenome nicht. Dabei wird die Fremd-DNA durch die nachfolgenden Generationen vererbbar und ermöglicht enorm verbesserte Skalierbarkeit, weit über die anderer Expressionssysteme ^1. Einführung von exogener DNA in das Kerngenom wird normalerweise durch Agrobacterium tumefaciens Infektion von Pflanzengewebe erreicht oder, seltener, durch Mikroprojektilbeschuss des Gewebes ^9. Pflanzenhormone werden dann verwendet, um die Differenzierung und das Wachstum von transgenen Pflanzengewebe wie Wurzeln und Blätter zu induzieren. Transformation des Chloroplasten-Genom nicht erreicht werden A. tumefaciens, sondern verlässt sich ganz auf Gold-oder Wolfram-Partikel mit DNA beschichtet gefeuert ballistisch in Pflanzenzellen. Das zweite Verfahren zur Expression Rekombinationnt-Protein in Pflanzen durch transiente Expression ^10. In diesem Szenario werden Virus-abgeleiteten Vektoren, die das Gen von Interesse via A. geliefert tumefaciens zu voll entwickelten Pflanzen durch einen Prozess namens Agroinfiltration. Statt der Integration in das pflanzliche Genom, wird die gelieferte Genkonstrukt dann damit beginnen, die transiente Produktion des gewünschten Proteins, die geerntet und nach kurzer Inkubationszeit isoliert werden zu lenken. Transient Genexpression bietet den Vorteil einer größeren allgemeinen Protein-Akkumulation sowie einer verbesserten Zeit von Protein-Produktion, wie die Pflanzen bereit sein wird, ca. 1-2 Wochen nach Agroinfiltration ¹¹ ernten. Dies ist deutlich schneller als die Prozesse der Erzeugung, Auswahl und Bestätigung von stabilen transgenen Linien, die mehrere Monate dauern kann bis zu einem Jahr. Dies ist aber auch die Begrenzung der transienten Expressionssystem, da es nicht ergeben genetisch stabile Anlage lines, die verwendet werden, um eine Samenbank für groß angelegte kommerzielle Produktion erzeugen kann. Trotzdem haben Ansätze entwickelt worden, um in großem Maßstab transiente Expression zu verbessern. Hier zeigen wir eine Methode zur Erzeugung von transienten Protein-Expression Nicotiana benthamiana Pflanzen mittels viraler Vektoren dekonstruiert von A. geliefert tumefaciens.

Zwei wichtige Methoden werden für die Lieferung von A. entwickelt tumefaciens in Pflanzengewebe: bench scale Infiltration über eine Spritze und große Infiltration über Vakuumkammer. Beide Protokolle werden hier mit N. beschrieben benthamiana, die eng mit der gemeinsamen Tabakpflanze verwandt ist, als Wirtspflanze für transiente Expression von zwei fluoreszierende Proteine: das grün fluoreszierende Protein (GFP) aus Qualle Aequorea victoria und der rot fluoreszierendes Protein aus Discosoma Koralle (DsRed) ^12,13. N. benthamiana ist die häufigste Wirtspflanzerekombinantes Protein, weil es zugänglich für genetische Transformation ist, können große Mengen an Biomasse rasch ergeben, und ist ein überaus produktiver Saatguthersteller für Scale-up-Produktion ^14. Ein weiterer Vorteil der Verwendung von N. benthamiana als Gastgeber für die Proteinexpression ist die Verfügbarkeit einer Vielzahl von Expressionsvektoren ^2,5. In dieser Studie wurden zwei dekonstruiert virale Vektoren, eine auf einer Tabak-Mosaik-Virus (TMV) RNA Replikon System (magnICON Vektoren) und die andere von der Bohne yellow dwarf virus (BeYDV) DNA Replikon System (geminiviral Vektoren) ^{4,11 ermittelt, die 15-18,} werden verwendet, um die GFP und DsRed-Gen tragen und sie geben in N. benthamiana Zellen über A. tumefaciens. Drei DNA-Konstrukte für GFP oder DsRed Expression mit magnICON Vektoren verwendet werden. Dazu gehören das 5'-Modul (pICH15879), das den Promotor und andere genetische Elemente für den Antrieb der Expression des Ziel-Gens, das 3'-Modul, das das Gen von Interesse (PICH-GFP oder PICH-DsRed) und der Integrase-Modul (pICH14011) für ein Enzym codiert, das die 5 'und 3'-Module miteinander integriert bei Expression ^8,15. Drei DNA-Konstrukte werden auch für die Expression mit geminiviral Vektoren benötigt. Zusätzlich zu Vektoren, die Replikon des Zielgens (pBYGFP oder pBYDsRed) ist ein Vektor, der für die Replikation Protein (pREP110) für die Amplifikation der Ziel-Replikon ^11,14,16 erforderlich. Darüber hinaus ist die Einbeziehung eines Vektors Codieren des Silencing Suppressor p19 aus Tomate buschigen stunt virus für hohe Zielgenexpression ^11,16 gewünscht.

Im Allgemeinen gibt es drei wesentliche Schritte zur Einführung von Genen von rekombinanten Proteinen in Pflanzenzellen durch Agroinfiltration einschließlich Pflanzenwachstums, A. tumefaciens Kultur Vorbereitung und Infiltration. Da jeder Schritt ist entscheidend für den letztendlichen Erfolg dieses Verfahrens daher wird eine detaillierte Beschreibung für jede vorgesehen istsowohl für Spritze Infiltration und Vakuuminfiltration unten.

Protokoll

1. Plant Growth

1. Platz 60 Torf Pellets in einem Anzuchtplatte. In 4 l Leitungswasser und lassen Sie den Torf Pellets absorbieren das Wasser für 2 Stunden.
2. In 2 N. benthamiana Samen in jeder Torf Pellets mit einem seeder, decken Sie das Fach mit einem transparenten Kunststoff-Kuppel und es ihnen ermöglichen, in einem 25 ° C, 84% Luftfeuchtigkeit Umgebung mit einem 16/8 h Tag / Nacht-Zyklus (Abbildung 1A) keimen.
3. Entfernen Sie die Kuppel zwei Wochen nach Aussaat, lassen Sie das Wasser aus dem Fach, und mit 2 L von Jacks Dünger in einer Konzentration von 1,48 g / L (Abbildung 1B). Weiter zu Pflanzen in einem 25 ° C, 50% Luftfeuchtigkeit Umgebung mit einem 16/8 h Tag / Nacht-Zyklus wachsen. Versorgung 2 L von Jacks Dünger alle 2 Tage pro Fach.
4. In Woche 4, übertragen Sie die Pflanzen mit Torf Pellets zu einem neuen Fach, das sechs Pflanzen beherbergt, um ausreichend Platz für weiteres Wachstum (Abbildung 1C) bereitzustellen, bis sie bereit sind, an Alter von 6 Wochen (Abbildung infiltriert werden1D).

2. A. tumefaciens Kultur Vorbereitung

2.1 Vorbereitung für Spritze Infiltration

1. Serie A. tumefaciens GV3101 Stämme mit den geminiviral Vektoren p19, pREP110, pBYGFP und pBYDsRed auf LB-Agar-Platten mit Kanamycin (100 ug / ml). Streak ein Stamm pro Platte und wachsen bei 30 ° C für 48 Stunden.
2. Ebenso Streifen und wachsen GV3101 Stämmen, die magnICON Vektoren der 5 'Modul (pICH15879), das 3'-Modul, das die Target-Gen von GFP oder DsRed (Pich-GFP oder Pich-DsRed) und Integrase (pCH14011) auf LB-Agar Platten mit Carbenicillin (100 ug / ml).
3. Von einer einzigen Kolonie auf der LB-Agar Platte, impfen GV3101 Stämmen, geminiviral Vektoren in 3 ml YENB Medien (0,75% Bacto Hefeextrakt, 0,8% Nährbouillon, pH-Wert auf 7,5 mit NaOH) + Kanamycin (100 ug / ml) in eine 15-ml-Tube Kultur, wachsen die Flüssigkeit Kultur bei 30 ° C ina Schüttler über Nacht mit einer 300 rpm Drehzahl.
4. Ebenso impfen und zu wachsen GV3101 Stämmen, magnICON Vektoren in YENB media + Carbenicillin (100 ug / ml) in einem Schüttler über Nacht bei 30 ° C.
5. Messung und Aufzeichnung von OD _600-Werte für jede Flüssigkeit Kultur mit einem Spektralphotometer und verwenden Sie die folgende Formel, um das notwendige Volumen (V _sub), um für eine neue Kultur mit einem Startpreis von 0,025 OD ₆₀₀ werden in 10 ml YENB subkultiviert mit geeigneten Antibiotika berechnen .
   V _sub (ml) = (10 ml) x (0,025) / OD ₆₀₀
6. Transfer-V _sub (ml) der Übernacht-Kultur auf (10 - V _sub) ml YENB Medien mit entsprechenden Antibiotika für jeden Stamm. Wachsen die neue Kultur über Nacht bei 30 ° C in einem Schüttler mit einer 250 rpm Drehzahl bis die OD _600-Wert im Bereich von 1,7-2,0.
7. Messen und aufzeichnen OD _600-Werte für jede Flüssigkeit Kultur und verwenden Sie die folgende Formel in CalcUlate das benötigte Volumen (V _inf) in 50 ml Infiltration Puffer verdünnt werden, um einen endgültigen OD ₆₀₀ von 0,12 für jeden Stamm geben.
   V _inf (ml) = (50 ml) x (0,12) / OD ₆₀₀
8. Transfer-V _inf (ml) von jeder Kultur in ein Mikrozentrifugenröhrchen und Spin-Down der Zellen durch Zentrifugation bei 12.000 xg für 2 min, Überstand entfernen und dann die Zellen in 10 ml Infiltration Puffer (10 mM MES, pH 5,5; 10 mM MgSO ₄₎ durch Vortexen kurz.
9. Mischen resuspendiert Zellen pBYGFP + + pREP110 p19, drehen Sie die Zellen nach unten bei 12.000 xg für 2 min, und resuspendieren in insgesamt 50 ml Puffer Infiltration. Diese Kombination ist für Agrobakterien geminiviral Expression von GFP.
10. Ebenso mischen die folgenden Kombinationen von Agrobakterien Zellen, Spin-down und resuspendieren sie in 50 ml Puffer Infiltration. Dazu gehören (1) pBYDsRed + + pREP110 p19 für geminiviral Expression von DsRed, (2) pBYGFP + + pBYDsRed pREP110+ P19 für geminiviral Co-Expression von GFP und DsRed, (3) pREp110 + p19 als negative Kontrolle geminiviral Ausdruck, (4) Pich-GFP + + pICH15879 pCH14011 für magnICON Expression von GFP, (5) Pich-DsRed + + pICH15879 pCH14011 für magnICON Expression von DsRed, und (6) pICH15879 + pCH14011 als negative Kontrolle für magnICON Ausdruck.

2.2 Vorbereitung für Vakuuminfiltration

1. Impfen und Kultur jedes GV3101 Stamm, geminiviral Vektoren oder magnICON Vektoren in 15 ml YENB Medien mit entsprechenden Antibiotika in einem 50 ml Autoklaven überführt und über Nacht wachsen wie für Spritze Infiltration oben beschrieben.
2. Messung und Aufzeichnung von OD _600-Werte für jede Flüssigkeit Kultur mit einem Spektralphotometer und verwenden Sie die folgende Formel, um das notwendige Volumen (V _sub), um für eine neue Kultur mit einem Startpreis von 0,025 OD ₆₀₀ werden in 250 ml YENB subkultiviert mit geeigneten Antibiotika berechnen .
   V _sub (Ml) = (250 ml) x (0.025) / OD ₆₀₀
3. Transfer-V _sub (ml) der Übernacht-Kultur auf (250 - V _sub) ml YENB Medien in einer 1 L autoklavierte Kolben mit geeigneten Antibiotika für jeden Stamm und wachsen die neue Kultur über Nacht wie für Spritze Infiltration oben beschrieben.
4. Messen und aufzeichnen OD _600-Werte für jede Flüssigkeit Kultur und verwenden Sie die folgende Formel, um das notwendige Volumen (V _inf) in 3 L der Infiltration verdünnt werden, um eine endgültige OD ₆₀₀ von 0,12 für jeden Stamm geben berechnen.
   V _inf (ml) = (3000 ml) x (0,12) / OD ₆₀₀
5. Pellet resuspendieren und V _inf (ml) von jeder Kultur in Infiltration Puffer für Spritze Infiltration beschrieben und mischen Sie die resuspendierten Kulturen nach den Kombinationen für Spritze Infiltration beschrieben. Repellet die gemischten Agrobakterien Zellen resuspendieren und sie in 3 L der Infiltration Puffer.

3. Infiltration

3.1 Spritze Infiltration

1. Wählen Sie vier 6-Wochen alten N. benthamiana Pflanzen mit 5 verlässt jeder. Die ersten drei Blätter von oben gezählt von jeder Pflanze wird vollständig mit einer der Kombinationen von A. infiltriert tumefaciens-Stämme in Infiltration Puffer. Das vierte Blatt wird spot-infiltriert mit allen vier Stamm-Kombinationen für geminiviral Ausdruck oder allen drei Kombinationen für magnICON Ausdruck. Das letzte Blatt auf jeder Anlage wird mit einer Kombination aus negativen Kontrollen infiltriert werden.
2. Erstellen einer kleinen Einschnitt mit einer Nadel in der Epidermis an der Rückseite des Flügels (Abbildung 2A). Vorsicht: Achten Sie darauf, nicht zu kratzen, so hart wie zu durchbohren das Blatt durch beide Seiten, da die Zellen in der Agrobakterien Infiltration Mischung wird durch die Punktion auf die andere Seite des Blattes passieren.
3. Nehmen Sie einen festen Halt der Vorderseite des Blattes und unter sanftemGegendruck der nick mit dem Daumen einer Hand, injizieren die Mischungen in Agrobacterium Infiltration Puffer in die nick mit einer Spritze ohne Nadel (Abbildung 2B). Hinweis: Da die Agrobacterium Gemisch tritt die Interzellulärraum des Blattes, das infiltrierte Bereich wird sichtbar dunkleren Grün drehen (Abbildung 2C).
4. Fahren Sie mit dem Agrobacterium Mischungen in die nick injizieren, bis die dunkleren grünen Kreis stoppt, um zu erweitern. Erstellen Sie eine weitere nick und wiederholen Sie die Schritte, bis die gesamte 3.1.2-3.1.4 Blatt infiltriert wird und das ganze Blatt wird dunkler grün für die ersten drei Blätter und das letzte Blatt.
5. Für das vierte Blatt jeder Pflanze, werden alle vier (geminiviral Vektor) oder drei (magnICON Vektor) Kombinationen hinein infiltriert werden. Machen Sie einen nick für jede Kombination von Agrobacterium-Stämme, und infiltrieren jede nick mit einer Kombination.
6. Nach der Infiltration bewegen Pflanzen wieder zum Wachstum Zimmer und monitor Proteinexpression zwischen 2-15 Tage nach der Infiltration (dpi).

3.2 Vakuuminfiltration

1. Legen Sie eine Badewanne in einem Vakuum-Exsikkator und Transfer 3 L Infiltration Puffer, die Agrobacterium-Stämme in die Wanne. Verbinden Sie den Exsikkator zu einem Vacuubrand Membran-Vakuumpumpe (3A).
2. Legen Sie eine Pflanze kopfüber auf den Exsikkator Platte (3B) und senken Sie die Platte mit der Pflanze, bis das gesamte Blatt und Stamm-System wird in den Puffer Infiltration mit der Platte ruht oben auf der Wanne untergetaucht. Setzen Sie den O-Ring Exsikkator entlang des Randes und setzen Sie den Deckel auf den Exsikkator Kammer (3C).
3. Einschalten der Vakuumpumpe und den Startzeitpunkt, wenn das Vakuum erreicht 100 mbar. Langsam öffnen Sie das Ablassventil auf dem Exsikkator nach 1 min bei 100 mbar bis zum Eingang von Agrobakterien in die Zwischenräume des untergetauchten Pflanzengewebe zu ermöglichen. Wiederholen Sie diesen Schritt ein additionalen Zeit, um gute Infiltration zu gewährleisten.
4. Nach der Infiltration, nehmen Sie die Pflanze aus dem Exsikkator und steckte es wieder in die aufrechte Position. Bewegen Pflanzen wieder zum Wachstum Zimmer und Monitor Proteinexpression zwischen 2-15 dpi.

4. Fluorescent Protein Detection and Photography

1. Ausgehend von 2 dpi, move Pflanzen in dunklen Raum und Glanz UV-Licht auf der Rückseite des infiltrierten Blätter mit einem handgeführten UV-Lampe.
2. Beachten Sie die grüne Fluoreszenz von GFP oder die rote Fluoreszenz von DsRed. GFP gibt ein stärkeres Signal mit langwelligen UV-Licht, während DsRed ist stärker unter kurzwelligem UV-Licht.
3. Machen Sie Fotos von fluoreszierenden Blätter mit einer normalen Digitalkamera ohne Blitz.
4. Bewegen Pflanzen wieder zum Wachstum Zimmer nach Beobachtung oder Fotografie.

Ergebnisse

1. Expression von fluoreszierenden Proteinen durch Spritze Infiltration

Um die Wirksamkeit der Spritze Infiltration von Agrobacterium in Pflanzengewebe zu demonstrieren, testeten wir die Expression von zwei fluoreszierenden Proteinen - GFP und DsRed - von zwei verschiedenen dekonstruiert Anlage virale Vektoren - geminiviral und magnICON - in N. benthamiana. Für N. benthamiana Blätter, die vollständig mit Agrobakterien haltigen geminiviral Vektoren wurden i...

Diskussion

Die steigenden Anforderungen an die Protein-basierten Pharmazeutika weltweit erfordern neue Produktion Plattformen, die robuste, skalierbare, kostengünstige und sicher sind. Pflanzen haben gezeigt, dass eine der vielversprechendsten alternativen Produktionssystemen für Herstellung pharmazeutischer Proteine ​​sein. In den letzten Jahren wurde die Entwicklung von deconstructed Virus basierende Vektoren transienten Expression von Proteinen in Pflanzen, die eine wesentliche Steigerung der Geschwindigkeit und Ausbeute ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagents
GFP	Invitrogen	V353-20	www.invitrogen.com See reference: Lico and Chen, et al 2008
DsRed	Clontech	632152	www.clontech.com See reference: Baird and Zacharias, et al 2000
MagnICON Vector	Icon Genetics	n/a	www.icongenetics.com See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006
Geminiviral Vector	Author's Lab	n/a	See reference: Chen and He, et al 2011
N. benthamiana	Author's Lab	n/a	herbalistics.com.au
Agrobacterium tumefaciens strain gv3101	Author's Lab	n/a	See reference: Lai and Chen 2012
LB Agar Carbenicillin-100, plates	Sigma	L0418	www.sigmaaldrich.com
LB Agar Kanamycin-50, plates	Sigma	L0543	www.sigmaaldrich.com
Magnesium sulfate hepa hydrate	Sigma	M2773-500 g	www.sigmaaldrich.com
Bacto-Tryptone	Fisher	73049-73-7	www.fishersci.com
Bacto Yeast Extract	Becton, Dickinson & CO.	REF 212750	www.bd.com
Difco Nutrient Broth	Becton, Dickinson & CO.	REF 234000	www.bd.com
MES hydrate Buffer	Sigma	M8250-1kg	www.sigmaaldrich.com
Carbenicillin	Sigma	C1613-1ML	www.sigmaaldrich.com
Kanamycin	Sigma	70560-51-9	www.sigmaaldrich.com
Sodium Hydroxide	Sigma	221465	www.sigmaaldrich.com
Jack's Fertilizer	Hummert International	Jul-25	www.hummert.com
			Equipment
Vacuubrand MD4 Vacuum Pump	Fisher	13-878-113	www.fishersci.com
Vacuum Air Regulator Valve	Fisher	NC9386590	www.fishersci.com
Desiccator 12 1/8" with O ring	Fisher	08-594-15C	www.fishersci.com
3 L Tub	Rubber-Maid	n/a	Rubbermaid Servn' Saver Bowl, 10-cup will work
plate/shelf 230ML	Fisher	NC9489269	www.fishersci.com
Peat Pellet	Hummert International	14-2370-1	www.hummert.com
Propagation Tray Dome	hydrofarm	132052	www.hydroponics.net
Propagaiton Tray	hydrofarm	138758	www.hydroponics.net
Virbo Hand Seeder	Gro-Mor INC	n/a	www.gro-morent.com
Flora Cart 4 shelf	Hummert International	65-6924-1	www.hummert.com
15 ml Round Bottom Culture Tubes	Sigma	CLS430172-500EA	http://www.sigmaaldrich.com
Spectrophotometer	Bio-Rad	170-2525	www.bio-rad.com
Spectrophotometer Cuvettes	Bio-Rad	223-9950	www.bio-rad.com
Microcentrifuge Tubes	USA Scientific	1415-2500	www.usascientific.com
Benchtop Centrifuge	Bio-Rad	166-0602EDU	www.bio-rad.com
Incubator/Shaker	Eppendorf	Excella E25	www.eppendorf.com
Ultraviolet Light Model#: UVGL-25	UVP	95-0021-12	www.uvp.com