Agroinfiltration היעילה של צמחים לביטוי חולף ברמה גבוהה של חלבונים רקומביננטי

Summary

צמחים מציעים מערכת חדשנית לייצור של חלבוני תרופות בהיקף מסחרי, כי הוא יותר ניתן להרחבה, יעיל וחסכונית ובטוחה יותר מפרדיגמות ביטוי הנוכחיות. במחקר זה, אנו מדווחים גישה פשוטה ונוחה, אך ניתן להרחבה להציג את היעד של גן המכיל Agrobacterium tumefaciens לצמחים לביטוי חלבון חולף.

Abstract

תרבית תאי יונקים היא הפלטפורמה הגדולה לייצור מסחרי של חיסונים לבני אדם וחלבונים טיפוליים. עם זאת, הוא לא יכול לענות על ביקוש העולמי הגובר לתרופות בשל יכולת הרחבה המוגבלת שלה ועלותו הגבוהה. צמחים הראו להיות אחת פלטפורמות ייצור התרופות החלופיות המבטיחות ביותר כי הם חזקים, ניתן להרחבה, בעלות נמוכה ובטוחים. ההתפתחות האחרונה של וקטורים מבוססי וירוס אפשרה ביטוי חולף ומהיר ברמה גבוהה של חלבונים רקומביננטיים בצמחים. כדי לייעל עוד יותר את השירות של מערכת הביטוי החולף, אנחנו מדגימים שיטה פשוטה, יעילה וניתן להרחבה להציג Agrobacterium המכיל יעד גן לתוך רקמות צמח במחקר זה. התוצאות שלנו מעידות agroinfiltration שעם שניהם ומזרק ואקום שיטות הביאו במבוא יעיל של Agrobacterium לעלים וייצור חזק של שני חלבוני ניאון; GFP וDsRed. יתר על כן,אנחנו מדגימים את היתרונות הייחודיים המוצעים על ידי שתי השיטות. חדירת המזרק היא פשוטה ואינה זקוק לציוד יקר. זה גם מאפשר את הגמישות או לחדור לכל החופשה עם גן המטרה אחת, או להציג את הגנים של מטרות מרובות בדף אחד. לפיכך, ניתן להשתמש בו לביטוי בקנה מידה מעבדה של חלבונים רקומביננטיים, כמו גם להשוואה בין חלבונים או וקטורים שונים לקינטיקה תשואה או הביטוי. הפשטות של חדירת המזרק גם מציעה השירות שלה בבית הספר תיכון ומכללה לחינוך לנושא של ביוטכנולוגיה. לעומת זאת, חדירת האבק היא חזקה יותר, וניתן לשנות כלפי מעלה לייצור מסחרי של חלבוני תרופות. הוא מציע גם את היתרון של להיות מסוגל agroinfiltrate מיני צמחים שאינם ניתן לחדירת המזרק כגון חסה וארבידופסיס. בסך הכל, שילוב של מזרק וagroinfiltration הוואקום מספק לחוקרים ומחנכים פשוטים, יעיל וחזקהמתודולוגיה לביטוי חולף חלבון. זה יהיה מאוד להקל על הפיתוח של חלבוני תרופות ולקדם את החינוך מדעי.

Introduction

מאז 1970, צמחים נחקרו כחלופות לתרביות של תאי יונקים, חרקים, חיידקים ולייצור המסחרי של חלבונים רקומביננטיים ותרופות ¹ חלבון. מערכות המבוססות על הצמח לביטוי של תרופות ביולוגיות הראו הבטחה בשנים האחרונות כמספר טיפולים החדשניים למחלות, כמו מחלת גושה ^2, ושפעת עופות H5N1 ^3, הראו הצלחה בניסויים קליניים. פיתוח מנגנונים מוסמכים לביטוי חלבון רקומביננטי בצמחים בעשורים שחלף מאז ניסויים הראשוניים יצר את הפוטנציאל למערכות המבוססות על הצמח לשנות את הפרדיגמה הנוכחית של ייצור חלבון משלוש סיבות עיקריות. ראשית, יש ירידה בולטת בעלות כbioreactors יונקים, חרקים, חיידקים ודורשים עלויות משמעותיות בהפעלה, תקשורת צמיחה היקרות, מסובכים ותהליכים לטיהור מורד הזרם ^4. יצירת הצמח מהונדס יציבקווים גם מאפשר להם לעבור את יכולת ההרחבה של מערכות ביטוי אחרות ניתן לגדל צמחים לבטא חלבון ונקטפו בקנה מידה חקלאית ^5. שנית, מערכות ביטוי על בסיס צמחי להפחית באופן משמעותי את הסיכון להעברת הפתוגן אדם או בעל חיים מהמארח החלבון להביע לבני אדם, הוכיחו עליונות בביטחון ציבור ^6. לבסוף, צמחים לנצל את מערכת endomembrane אוקריוטים כי הוא דומה לתאי יונקים, דבר המאפשרים לשינוי לאחר translational הנכון של חלבונים, כולל glycosylation וההרכבה של חלבונים מרובים מקטע ^7. יכולת זו מעמידה את מערכות על בסיס צמחי לפני אלה המבוססים על מערכות פרוקריוטים, כגון חיידקים, שכן מספר רחב יותר של חלבונים רקומביננטיים תרופות, כולל נוגדנים חד שבטיים (מבז), יש מבנה מסובך יותר ודורש שינויים נרחבים posttranslational או הרכבה ^8.

ישנם שתי appro הגדולהכאבים כדי לבטא חלבונים רקומביננטיים בצמחים. הראשון הוא הפיתוח של קו מהונדס ביציבות, כאשר ה-DNA המקודד חלבון המטרה הוא משובט לתוך קלטת ביטוי והציג גם את הגנום הגרעיני או הכלורופלסט. בתוך כך, דנ"א הזר הופך להיות תורשתי באמצעות דורות הבאים ומאפשר ליכולת הרחבה השתפרה מאוד, הרבה מעבר לזה של מערכות ביטוי אחרות ^1. מבוא של ה-DNA אקסוגני לגנום הגרעיני מושגת בדרך כלל על ידי זיהום Agrobacterium tumefaciens של רקמת צמח או, לעתים קרובות יותר, בהפצצות microprojectile של הרקמה ^9. הורמונים צמחיים משמשים לאחר מכן כדי לגרום להתמיינות וגדילה של רקמות צמח מהונדס כמו שורשים ועלים. הפיכתו של הגנום הכלורופלסט לא ניתן להשיג עם א ' tumefaciens, אלא מסתמך אך ורק על חלקיקי זהב או טונגסטן מצופה דנ"א ירה בליסטי לתוך תאי צמח. השיטה השנייה של הבעת recombinaחלבון NT בצמחים הוא דרך ביטוי חולף ^10. בתרחיש זה, וקטורי הנגזרות וירוס מחסה הגן של עניין מועברים דרך א tumefaciens לצמחים המפותחים באמצעות תהליך הנקרא agroinfiltration. במקום להשתלב בגנום הצמח, מבנה הגן נמסר אז יהיה להתחיל לכוון את הייצור החולף של החלבון הרצוי, שיכול להיות שנקטפו ומבודד לאחר תקופת דגירה קצרה. ביטוי חולף גן מציע את היתרון של הצטברות גדולה יותר הכוללת חלבון, כמו גם זמן משופר של ייצור חלבון, כמו צמחים יהיו מוכנים לקצור כ 1-2 שבועות לאחר agroinfiltration ^11. זו מהירה יותר באופן משמעותי מתהליכי ייצור, בחירה ואישור של קווי צמחים מהונדסים יציבים, אשר יכול לקחת מספר חודשים עד שנה. זה לעומת זאת, הוא גם המגבלה של מערכת הביטוי החולף, כפי שהוא לא יניב יציב גנטי צמח Liנס שיכול לשמש ליצירת בנק זרע לייצור מסחרי בקנה מידה גדול. למרות זאת, גישות פותחו כדי לשפר את הביטוי חולף בקנה מידה גדול. כאן אנו מדגימים שיטה אחת של דור של צמחים חולפים חלבון המבטא-ניקוטיאנה benthamiana באמצעות וקטורים ויראליים מפורקים נמסרו על ידי א tumefaciens.

שתי שיטות עיקריות מפותחות עבור המשלוח של א ' tumefaciens לתוך רקמות צמח: היקף חדירת ספסל באמצעות מזרק והסתננות בקנה מידה גדולה באמצעות תא ואקום. שני הפרוטוקולים מתוארים כאן באמצעות נ benthamiana, אשר קשור באופן הדוק לצמח הטבק המשותף, כצמח הפונדקאי לביטוי זמני של שני חלבוני ניאון: החלבון פלואורסצנטי הירוק (GFP) מהמדוזה Aequorea ויקטוריה וחלבון פלואורסצנטי האדום מDiscosoma אלמוגים (DsRed) ^12,13. נ benthamiana הוא הצמח הפונדקאי הנפוץ ביותר עבורחלבון רקומביננטי כי זה ניתן לשינוי גנטי, יכול להניב כמויות גבוהות של ביומסה במהירות, והוא מפיק זרעים פורה לייצור בהיקף של עד ^14. יתרון נוסף של שימוש בנ benthamiana כמארחים לביטוי חלבון הוא הזמינות של מגוון רחב של וקטורי ביטוי ^2,5. במחקר זה, שני וקטורים ויראליים מפורקים, אחד המבוסס על נגיף פסיפס טבק (TMV) רנ"א replicon מערכת (וקטורי MagnICON) והאחר שהופק ממערכת replicon DNA (וקטורי geminiviral) ^4,11 וירוס הגמד הצהוב השעועית ^{(BeYDV), 15-18,} משמשים לביצוע ה-GFP וגן DsRed ולספק אותם לנ תאי benthamiana Via A. tumefaciens. שלוש בונה DNA תשמש לGFP או ביטוי DsRed עם וקטורי MagnICON. הם כוללים 'מודול (pICH15879) המכיל את האמרגן ואלמנטים גנטיים אחרים לנהיגת הביטוי של גן המטרה, 3' 5 מודול המכיל את הגן של עניין (Pich-GFP או Pich-DsRed), ומודול integrase (pICH14011) קידוד לאנזים המשלב 5 'ו 3' מודולים יחד על ביטוי ^8,15. שלושה מבני DNA גם יש צורך לביטוי עם וקטורי geminiviral. בנוסף לוקטורים המכילים replicon של גן המטרה (pBYGFP או pBYDsRed), וקטור המקודד חלבון השכפול (pREP110) נדרש ההגברה של יעד replicon ^11,14,16. יתר על כן, הכללתו של וקטור קידוד P19 מדכא השתקה מוירוס פעלולים סבוך עגבנייה היא רצויה לביטוי גן המטרה ברמה גבוה ^11,16.

יש בדרך כלל שלושה שלבים עיקריים לכניסתה של הגנים של חלבונים רקומביננטיים לתוך תאי צמח על ידי agroinfiltration כולל גידול צמח, א tumefaciens תרבות הכנה, והסתננות. כמו בכל שלב הוא קריטי להצלחתו הסופית של הליך זה ולכן, תיאור מפורט, לכל אחד מהם סיפקעבור שניהם חדירת מזרק וחדירת ואקום בהמשך.

Protocol

1. גידול צמחים

1. מקום 60 כדורי כבול לתוך מגש התפשטות. הוסף 4 ליטר של מים ברז ולתת כדורי הכבול לספוג את המים במשך שעה 2.
2. הוסף 2 נ ' זרעי benthamiana לכל כבול גלולה בשימוש במזרעה, לכסות את המגש עם כיפת פלסטיק שקופה, ולאפשר להם לנבוט ב25 מעלות צלזיוס, סביבת לחות 84% עם מחזור יום / לילה שעות 16/8 (איור 1 א).
3. הסר את כיפת שבועיים לאחר זריעה, לנקז מים מהמגש, ולהוסיף 2 ליטר של הדשן של ג'ק בריכוז של 1.48 גר '/ ל' (איור 1). תמשיך לגדל צמחים ב25 מעלות צלזיוס, בסביבת לחות של 50% ביום לשעה / לילה מחזור 16/8. אספקת 2 ליטר של הדשן של ג'ק כל 2 ימים במגש.
4. בשבוע 4, להעביר את הצמחים עם כדורי כבול למגש חדש שמארח את שישה צמחים כדי לספק מרחב מספיק להמשך הצמיחה (איור 1 ג) עד שהם מוכנים להסתננו לאחר 6 שבועות של גיל (איור1D).

2. א תרבות הכנת tumefaciens

2.1 הכנה להסתננות מזרק

1. א הפס זני tumefaciens GV3101 המכילים את וקטורי geminiviral P19, pREP110, pBYGFP וpBYDsRed על צלחות אגר LB המכילים kanamycin (100 מיקרוגרם / מ"ל). פס זן אחד לכל צלחת ולגדול ב 30 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
2. באופן דומה, פס ולגדול GV3101 זני מחסה וקטורי MagnICON של 5 'מודול (pICH15879), 3' מודול המכיל את גן המטרה של ה-GFP או DsRed (Pich-GFP או Pich-DsRed), וintegrase (pCH14011) על אגר LB צלחות המכילות carbenicillin (100 מיקרוגרם / מ"ל).
3. ממושבה אחת על הצלחת אגר LB, לחסן GV3101 זני מחסה וקטורי geminiviral ל3 מ"ל של תקשורת YENB (0.75 תמצית שמרי Bacto%, 0.8% מרק מזין, כדי להתאים את pH 7.5 עם NaOH) + kanamycin (100 מיקרוגרם / מ"ל) ב צינור תרבות מסביב לתחתית 15 מ"ל, לגדול התרבות הנוזלית על 30 מעלות צלזיוס בשייקר לילה עם קצב סיבוב סל"ד 300.
4. באופן דומה, לחסן ולגדול GV3101 זני מחסה וקטורי MagnICON בYENB תקשורת + carbenicillin (100 מיקרוגרם / מ"ל) בלילה בשעה שייקר 30 ° C.
5. מדוד ורשום ערכי OD ₆₀₀ לכל תרבות נוזלית עם ספקטרופוטומטר ולהשתמש בנוסחא הבאה כדי לחשב את הנפח הדרוש (V _משנה) להיות subcultured לתרבות חדשה עם ₆₀₀ OD של 0.025 מתחיל ב 10 מ"ל של תקשורת YENB עם אנטיביוטיקה מתאימה .
   V _תת (מ"ל) = (10 מ"ל) x (0.025) / ₆₀₀ OD
6. העברת V _משנה (מ"ל) של תרבות הלילה ל( 10 - V _משנה) מ"ל של תקשורת YENB עם אנטיביוטיקה מתאימה לכל זן. לגדול התרבות החדשה בין לילה על 30 מעלות צלזיוס בייקרה עם קצב סיבוב סל"ד 250 עד ₆₀₀ OD הערך הוא בטווח של 1.7-2.0.
7. מדוד ורשום OD ₆₀₀ ערכים עבור כל תרבות נוזלית ולהשתמש בנוסחה הבאה לCalculate הנפח הדרוש (V _INF) להיות מדולל ב 50 מ"ל של חיץ חדירה לתת OD ₆₀₀ סופי של 0.12 לכל זן.
   V _inf (מ"ל) = (50 מ"ל) X (0.12) / ₆₀₀ OD
8. העברת V _inf (מ"ל) של כל תרבות ותרבות לצינור microcentrifuge ולסובב את התאים על ידי צנטריפוגה XG ב 12,000 במשך 2 דקות, ולאחר מכן להסיר supernatant resuspend התאים 10 מיליליטר חיץ הסתננות (10 מ"מ MES, pH 5.5, 10 מ"מ MgSO ₄₎ על ידי vortexing לזמן קצר.
9. מערבבים resuspended תאים של pBYGFP + + pREP110 P19, לסובב את התאים למטה XG ב 12,000 במשך 2 דקות, וresuspend בסכום כולל של 50 מ"ל של חיץ הסתננות. שילוב Agrobacteria זה לביטוי geminiviral של ה-GFP.
10. בדומה לכך, לערבב את השילובים הבאים של תאי Agrobacteria, ספין למטה וresuspend אותם 50 מ"ל של חיץ הסתננות. הם כוללים (1) pBYDsRed + + pREP110 P19 לביטוי geminiviral של DsRed, (2) pBYGFP + + pBYDsRed pREP110+ P19 לשיתוף ביטוי של ה-GFP וDsRed, (3) pREp110 + P19 כבקרה שלילית של ביטוי geminiviral, (4) Pich-GFP + + pICH15879 pCH14011 לביטוי MagnICON של ה-GFP, (5) Pich-DsRed + + pICH15879 geminiviral pCH14011 לביטוי MagnICON של DsRed, ו( 6) pICH15879 + pCH14011 כביקורת שלילית לביטוי MagnICON.

2.2 הכנה להסתננות אבק

1. לחסן ותרבות כל זן GV3101 המכיל וקטורי geminiviral או וקטורי MagnICON לתוך 15 מ"ל של תקשורת YENB עם אנטיביוטיקה מתאימה בבקבוק 50 מ"ל autoclaved ולגדול בין לילה כמתואר לחדירת מזרק לעיל.
2. מדוד ורשום ערכי OD ₆₀₀ לכל תרבות נוזלית עם ספקטרופוטומטר ולהשתמש בנוסחא הבאה כדי לחשב את הנפח הדרוש (V _משנה) להיות subcultured לתרבות חדשה עם ₆₀₀ OD של 0.025 מתחיל ב250 מ"ל של תקשורת YENB עם אנטיביוטיקה מתאימה .
   V _תת > (מ"ל) = (250 מ"ל) x (0.025) / ₆₀₀ OD
3. העברת V _משנה (מ"ל) של תרבות הלילה ל( 250 - V _משנה) מ"ל של תקשורת YENB בבקבוק 1 ליטר autoclaved עם אנטיביוטיקה מתאימה לכל זן ולגדול התרבות החדשה בין לילה, כמתואר לחדירת מזרק לעיל.
4. מדוד ורשום OD ₆₀₀ ערכים עבור כל תרבות נוזלית ולהשתמש בנוסחא הבאה כדי לחשב את הנפח הדרוש (V _INF) להיות מדולל ב3 ליטר של חיץ חדירה לתת OD ₆₀₀ סופי של 0.12 לכל זן.
   V _inf (מ"ל) = (3000 מ"ל) X (0.12) / ₆₀₀ OD
5. גלולה וresuspend V _inf (מ"ל) של כל תרבות ותרבות במאגר החדירה כמתואר לחדירת מזרק ומערבבים תרבויות resuspended בהתאם לשילובים שתוארו לחדירת המזרק. Repellet תאי Agrobacteria המעורבים resuspend אותם 3 ליטר של חיץ הסתננות.

S = "jove_title"> 3. הסתננות

הסתננות מזרק 3.1

1. בחר ארבע הזקן נ 6 שבועות צמחי benthamiana עם 5 משאיר כל אחד. שלושת הדפים הראשונים לספור מהחלק העליון של כל צמח יהיה הסתנן לחלוטין עם אחד מהשילובים של א ' tumefaciens זנים בחיץ הסתננות. העלה הרביעי יהיה ספוט שחדר עם כל צירופי זן ארבעת לביטוי geminiviral או כל שלושת שילובים לביטוי MagnICON. הדף האחרון בכל מפעל יהיה הסתנן עם שילובים של ביקורת שלילית.
2. צור ניק קטן עם מחט בעור בצד האחורי של העלה (איור 2 א). שים לב: הקפד לא לשרוט כל כך קשה כמו לחדור דרך העלה משני הצדדים, כמו תאי Agrobacteria בתערובת ההסתננות יעברו דרך לנקב לצד השני של העלה.
3. קח את אחיזה איתנה של הצד הקדמי של העלה ותוך יישום עדיןלחץ נגדי לניק עם האגודל של יד אחת, להזריק את תערובות Agrobacterium בחיץ חדירה לניק עם מזרק בלי מחט (איור 2). הערה: כתערובת Agrobacterium נכנסה למרחב אינטר של העלה, באזור שהחדר יהפוך ירוקה בעליל כהה (איור 2 ג).
4. המשך להזריק את תערובות Agrobacterium לניק עד העיגול הירוק הכהה מפסיק להתרחב. ליצור עוד ניק וחזור על שלבי 3.1.2-3.1.4 עד שכל העלים הוא שחדר ועלו כולו הופך ירוקה כהה יותר בשלושת הדפים הראשונים ובדף האחרון.
5. לעלה הרביעי של כל צמח, ארבעה (וקטור geminiviral) או שלוש (MagnICON וקטור) כל השילובים יהיו חדרו לתוכו. לעשות אחד ניק עבור כל שילוב של זני Agrobacterium, ולחדור לכל ניק עם שילוב אחד.
6. לאחר חדירה, לחזור צמחים לחדר הצמיחה ומוניביטוי חלבון טור בין חדירת פוסט 2-15 ימים (dpi).

הסתננות אבק 3.2

1. הנח אמבטיה לייבוש ואקום וחיץ חדירת L 3 העברה המכיל את זני Agrobacterium לאמבטיה. חברו לתא ייבוש משאבת ואקום סרעפת VACUUBRAND (איור 3 א).
2. הנח צמח במהופך על צלחת ייבוש (איור 3) ולהוריד את הצלחת עם הצמח עד שמערכת כולה גבעול העלה והוא שקוע לתוך מאגר החדירה עם הצלחת מונחת על של האמבטיה. מניחים את טבעת O ייבוש לאורך השפה ולשים את מכסה תא ייבוש על החדר (איור 3 ג).
3. הפעל את משאבת הוואקום ולהתחיל עיתוי שבו מגיע ל -100 mbar הוואקום. לאט לאט לפתוח את שסתום השחרור בייבוש לאחר דקות 1 ב 100 mbar, כדי לאפשר כניסה של Agrobacteria לתוך חללי ביניים של רקמת צמח מתחת למים. חזור על פעולה זו אחת additiזמן onal כדי להבטיח חדירה טובה.
4. לאחר חדירה, לקחת את הצמח מחוץ לייבוש והחזיר אותו למצב הזקוף שלו. להעביר צמחים לחדר הצמיחה וביטוי חלבון לפקח בין 2-15 dpi.

4. איתור חלבון פלואורסצנטי וצילום

1. החל מ 2 dpi, צמחים לעבור לחדר חשוך ולהאיר אור UV בצד האחורי של עלים שחדר עם מנורת UV מוחזקת ביד.
2. שים לב פלואורסצנטי הירוקה של GFP או הקרינה האדומה של DsRed. GFP נותן את אות חזקה עם אור UV גל ארוך, בעוד DsRed הוא חזק יותר תחת אור UV גל קצר.
3. קח את התמונות של עלים ניאון עם מצלמה דיגיטלית רגילה ללא פלאש.
4. להעביר צמחים לחדר הצמיחה לאחר תצפית או צילום.

תוצאות

1. ביטוי של חלבונים ניאון על ידי חדירת המזרק

כדי להדגים את היעילות של חדירת המזרק של Agrobacterium לתוך רקמות צמח, בדקנו את הביטוי של שני חלבוני ניאון - GFP וDsRed - ידי שני וקטורים שונים מפורקים צמחים ויראלי - geminiviral וMagnICON - בנ benthamiana. לנ

Discussion

הדרישה הגוברת לתרופות המבוססות על חלבונים ברחבי העולם דורשת פלטפורמות ייצור חדשות כי הם חזקים, ניתן להרחבה, בעלות נמוכה ובטוחים. צמחים הראו להיות אחת ממערכות הייצור החלופיות המבטיחות ביותר לייצור חלבון תרופות. בשנים האחרונות, ההתפתחות של וקטורים מבוססי וירוס מפורק?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagents
GFP	Invitrogen	V353-20	www.invitrogen.com See reference: Lico and Chen, et al 2008
DsRed	Clontech	632152	www.clontech.com See reference: Baird and Zacharias, et al 2000
MagnICON Vector	Icon Genetics	n/a	www.icongenetics.com See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006
Geminiviral Vector	Author’s Lab	n/a	See reference: Chen and He, et al 2011
N. benthamiana	Author’s Lab	n/a	herbalistics.com.au
Agrobacterium tumefaciens strain gv3101	Author’s Lab	n/a	See reference: Lai and Chen 2012
LB Agar Carbenicillin-100, plates	Sigma	L0418	www.sigmaaldrich.com
LB Agar Kanamycin-50, plates	Sigma	L0543	www.sigmaaldrich.com
Magnesium sulfate hepa hydrate	Sigma	M2773-500 g	www.sigmaaldrich.com
Bacto-Tryptone	Fisher	73049-73-7	www.fishersci.com
Bacto Yeast Extract	Becton, Dickinson CO.	REF 212750	www.bd.com
Difco Nutrient Broth	Becton, Dickinson CO.	REF 234000	www.bd.com
MES hydrate Buffer	Sigma	M8250-1kg	www.sigmaaldrich.com
Carbenicillin	Sigma	C1613-1ML	www.sigmaaldrich.com
Kanamycin	Sigma	70560-51-9	www.sigmaaldrich.com
Sodium Hydroxide	Sigma	221465	www.sigmaaldrich.com
Jack’s Fertilizer	Hummert International	Jul-25	www.hummert.com
Equipment
Vacuubrand MD4 Vacuum Pump	Fisher	13-878-113	www.fishersci.com
Vacuum Air Regulator Valve	Fisher	NC9386590	www.fishersci.com
Desiccator 12 1/8" with O ring	Fisher	08-594-15C	www.fishersci.com
3 L Tub	Rubber-Maid	n/a	Rubbermaid Servn’ Saver Bowl, 10-cup will work
plate/shelf 230ML	Fisher	NC9489269	www.fishersci.com
Peat Pellet	Hummert International	14-2370-1	www.hummert.com
Propagation Tray Dome	hydrofarm	132052	www.hydroponics.net
Propagaiton Tray	hydrofarm	138758	www.hydroponics.net
Virbo Hand Seeder	Gro-Mor INC	n/a	www.gro-morent.com
Flora Cart 4 shelf	Hummert International	65-6924-1	www.hummert.com
15 ml Round Bottom Culture Tubes	Sigma	CLS430172-500EA	http://www.sigmaaldrich.com
Spectrophotometer	Bio-Rad	170-2525	www.bio-rad.com
Spectrophotometer Cuvettes	Bio-Rad	223-9950	www.bio-rad.com
Microcentrifuge Tubes	USA Scientific	1415-2500	www.usascientific.com
Benchtop Centrifuge	Bio-Rad	166-0602EDU	www.bio-rad.com
Incubator/Shaker	Eppendorf	Excella E25	www.eppendorf.com
Ultraviolet Light Model#: UVGL-25	UVP	95-0021-12	www.uvp.com