Эффективное Агроинфильтрация растений для высокого уровня переходных Экспрессия рекомбинантных белков

Резюме

Растения предложить новую систему для производства фармацевтических белков в промышленном масштабе, который является более масштабируемым, экономически эффективным и безопасным, чем текущий парадигмы выражения. В этом исследовании мы сообщаем простой и удобный, но масштабируемый подход ввести целевой ген, содержащий Agrobacterium tumefaciens В растения для временной экспрессии белка.

Аннотация

Культуре клеток млекопитающих является основной платформы для коммерческого производства вакцин для человека и терапевтических белков. Тем не менее, она не может удовлетворить растущий во всем мире спрос на лекарственные из-за его ограниченной масштабируемостью и высокой стоимостью. Растения показано, что одним из наиболее перспективных альтернативных платформ фармацевтического производства, которые являются надежной, масштабируемой, недорогой и безопасный. Недавнее развитие вируса векторы на основе позволило быстро и на высоком уровне временной экспрессии рекомбинантных белков в растениях. Для дальнейшей оптимизации полезности переходные системы экспрессии, мы демонстрируем простое, эффективное и масштабируемое методологии ввести целевой ген, содержащий Agrobacterium в ткань растений в данном исследовании. Наши результаты показывают, что агроинфильтрации как с шприц и вакуумные методы привели к эффективному введение в Agrobacterium листьев и надежный выпуск двух флуоресцентные белки, GFP и DsRed. Кроме того,мы демонстрируем уникальные достоинства обоих методов. Шприц инфильтрации прост и не требует дорогостоящего оборудования. Это также позволяет гибко либо проникать весь отпуск одного гена-мишени, или для введения генов из нескольких целей на одном листе. Таким образом, он может быть использован для лабораторного масштаба экспрессии рекомбинантных белков, а также для сравнения различных белков или векторы выход или выражение кинетики. Простота шприц инфильтрации также предполагает его полезность в средней школе и колледже образования для предмета биотехнологии. В отличие от вакуумной инфильтрации является более надежной и может быть расширены для коммерческого производства фармацевтических белков. Он также предлагает то преимущество, что в состоянии agroinfiltrate видов растений, которые не поддаются для шприца инфильтрации, такие как салат и Arabidopsis. В целом, сочетание и вакуумного шприца агроинфильтрации предоставляет исследователям и педагогам простой, эффективный и надежныйМетодология временной экспрессии белка. Это будет в значительной степени способствовать развитию фармацевтических белков и поощрения научного образования.

Введение

С 1970-х растений были изучены в качестве альтернативы млекопитающих, насекомых и бактериальные культуры клеток для промышленного производства рекомбинантных белков и белковых терапевтических ^1. Завод-систем для выражения биофармацевтических препаратов показали обещание в последние годы в несколько обработок романа для заболевания, как болезнь Гоше ^2, и птичьего гриппа H5N1 ^3, показали успехи в клинических испытаниях. Развитие компетентного механизмы экспрессии рекомбинантных белков в растениях в течение десятилетий после тех первых экспериментов были созданы возможности для растительных систем для изменения существующей парадигмы производства белка по трем основным причинам. Во-первых, существует заметное снижение стоимости, как млекопитающих, насекомых, и бактериальные биореакторов потребует значительных стартовых затрат, дорогих питательных сред и сложных процессов для последующей очистки ^4. Создание стабильных трансгенного растениялиний также позволяет им опережать масштабируемости в системах экспрессии белка как выражения растения могут быть выращены и собраны на сельскохозяйственных масштабе ^5. Во-вторых, растительных системах экспрессии значительно снизить риск передачи человека или животного патогена из белка, экспрессирующих множество для человека, демонстрирующий превосходство в общественной безопасности ^6. Наконец, растения используют эукариотической системе endomembrane, который похож на клетки млекопитающих, что позволяет должным пост-трансляционной модификации белков, включая гликозилирования и сборка нескольких субъединиц белки ^7. Эта способность ставит растительных системах раньше тех, на основе прокариотических системах, таких как бактерии, так как более широкий круг фармацевтических рекомбинантных белков, в том числе моноклональных антител (МКА), имеют более сложную структуру и требуют больших посттрансляционных модификаций или сборки ^8.

Есть два основных соответствуюболи в экспрессирующих рекомбинантные белки в растениях. Первым является разработка стабильно трансгенной линии, где ДНК, кодирующей целевой белок, клонировали в экспрессирующую кассету и введены либо к ядерной или хлоропластов геномов. При этом чужеродной ДНК становится наследственной через грядущие поколения и позволяет значительной мере улучшилась масштабируемость, намного превосходящее другие системы выражения ^1. Введение экзогенной ДНК в ядерном геноме обычно достигается путем Agrobacterium tumefaciens инфекции тканей растений или, реже, на бомбардировки микрочастицами ткани ^9. Завод гормонов затем используются для индукции дифференцировки и роста тканей трансгенных растений, таких как корней и листьев. Трансформация геном хлоропласта не может быть достигнуто с А. tumefaciens, но полностью полагается на золотые или вольфрамовые частицы, покрытые ДНК уволен баллистическим в клетки растений. Второй способ выражения рекомбинацииNT белка в растениях через временной экспрессии ^10. В этом случае вирус полученных векторов, содержащих ген доставляется через А. tumefaciens в полной мере разработаны растений посредством процесса, называемого агроинфильтрации. Вместо интеграции в геном растения, поставленного генная конструкция начнет направлять переходного производства желаемого белка, которые могут быть собраны и изолированы после короткого периода инкубации. Переходные экспрессии гена дает преимущество более высокой общей накопление белка, а также улучшенное время производства белка, как растения будут готовы для сбора примерно через 1-2 недели после агроинфильтрации ^11. Это значительно быстрее, чем процессы генерации, выбора и подтверждения стабильного линии трансгенных растений, что может занять от нескольких месяцев до года. Это, однако, является также ограничение переходного системы экспрессии, так как она не даст генетически стабильными завода Лидругом месте, которые могут быть использованы для создания банка семян для крупномасштабного коммерческого производства. Несмотря на это, подходы были разработаны для улучшения больших масштабах временной экспрессии. Здесь мы показываем один метод генерации переходных белка-экспрессирующие растения Nicotiana benthamiana деконструкции использованием вирусных векторов выступил А. tumefaciens.

Две основные методы разрабатываются для доставки А. tumefaciens в ткань растений: стендовом инфильтрации через шприц и большие масштабы инфильтрации через вакуумную камеру. Оба протокола описаны здесь используя N. benthamiana, которая тесно связана с общим завода табака, а растения-хозяина для временной экспрессии двух флуоресцентных белков: зеленый флуоресцентный белок (GFP) из медузы Aequorea Виктории и красного флуоресцентного белка из Discosoma коралл (DsRed) ^12,13. Н. benthamiana является наиболее распространенным растением-хозяиномрекомбинантного белка, потому что это поддается генетической трансформации, может дать большое количество биомассы быстро, и плодовитый производитель семян для расширения масштабов производства ^14. Другое преимущество использования N. benthamiana качестве хозяев для экспрессии белка является наличие различных векторов экспрессии ^2,5. В этом исследовании, вскрывают две вирусные векторы, основанный на вирус табачной мозаики (ВТМ) РНК репликона системы (MagnICON векторы) и другие, полученные из бобов вирус желтой карликовости (BeYDV) ДНК репликон системы (geminiviral векторы), ^{4,11, 15-18,} которые используются для выполнения GFP и ген DsRed и доставить их в N. benthamiana клеток с помощью А. tumefaciens. Три конструкции ДНК будет использоваться для GFP или DsRed выражение с MagnICON векторов. Они включают в себя 5 'модуль (pICH15879), содержащий промотор и другие генетические элементы для запуска экспрессии гена-мишени, 3'-модуль, содержащий представляющий интерес ген (PICH-GFP или PICH-DsRed) и интегразы модуль (pICH14011), кодирующий фермент, который объединяет 5 'и 3' модулей вместе при экспрессии ^8,15. Три конструкции ДНК также необходимы для выражения geminiviral векторов. В дополнение к векторы, содержащие репликон гена-мишени (pBYGFP или pBYDsRed), вектор кодирующий белок репликации (pREP110) требуется для амплификации целевой репликон ^11,14,16. Кроме того, включение вектор, кодирующий p19 супрессоров глушителей из томатной густые вируса трюков желательно за высокий уровень Экспрессия гена-мишени ^11,16.

Есть вообще три основных этапа для введения генов рекомбинантных белков в клетки растений путем агроинфильтрации в том числе рост растений, А. tumefaciens культуры подготовки и инфильтрации. Как и каждый шаг имеет решающее значение для конечного успеха этой процедуры, поэтому, подробное описание для каждого предусмотрендля инфильтрации шприц и вакуумной инфильтрации ниже.

протокол

1. Роста растений

1. Место 60 торфяных гранул в распространении лоток. Добавить 4 л водопроводной воды и дайте Торфяные гранулы поглощают воды в течение 2 часов.
2. Добавить 2 N. benthamiana семена в торфяные каждый осадок в сеялку, накройте поднос с прозрачным пластиковым куполом, и дать им возможность прорасти в 25 ° С, 84% влажности с 16/8 часов день / ночь цикла (рис. 1А).
3. Удалить купола через две недели после посева, слива воды из поддона, а также добавить 2 л удобрения Джека при концентрации 1,48 г / л (фиг. 1В). Продолжают расти растения в 25 ° С, 50% влажности с 16/8 часов день / ночь цикла. Питание 2 л удобрения Джека каждые 2 дня в лоток.
4. На 4 неделе, передавать растениям топливные гранулы, торф в новый лоток на котором размещены шесть заводов, чтобы обеспечить достаточное пространство для дальнейшего роста (рис. 1в), пока они не будут готовы к проникли в возрасте 6 недель (рис.1D).

2. А. Подготовка tumefaciens культуры

2.1 Подготовка к Шприц инфильтрация

1. А. подряд tumefaciens GV3101 штаммов, содержащих geminiviral векторов p19, pREP110, pBYGFP и pBYDsRed на LB-агаром, содержащим канамицин (100 мкг / мл). Подряд один штамм на чашке и расти при температуре 30 ° С в течение 48 часов.
2. Кроме того, полоса и расти GV3101 Штаммы MagnICON векторов 5 'модуль (pICH15879), 3'-модуля, содержащего целевой ген GFP или DsRed (PICH-GFP или PICH-DsRed) и интегразы (pCH14011) на LB-агар чашки, содержащие карбенициллин (100 мкг / мл).
3. С одной колонии на агаром LB, прививку GV3101 Штаммы geminiviral векторов в 3 мл YENB носитель (0,75% Bacto дрожжевой экстракт, 0,8% питательный бульон, довести рН до 7,5 с помощью NaOH) + канамицин (100 мкг / мл) в 15 мл с круглым дном пробирку, расти жидкой культуры при 30 ° С вшейкере в течение ночи при скорости вращения 300 оборотов в минуту.
4. Кроме того, прививку и расти GV3101 Штаммы MagnICON векторов в YENB медиа + карбенициллин (100 мкг / мл) в шейкере в течение ночи при 30 ° С.
5. Измерение и запись OD ₆₀₀ значений для каждой культуральной жидкости с помощью спектрофотометра и использовать приведенную ниже формулу для расчета необходимого объема (V _суб) для пересевали на новую культуру с начальной OD ₆₀₀ 0,025 в 10 мл среды YENB с соответствующими антибиотиками .
   В _суб (мл) = (10 мл) х (0,025) / OD ₆₀₀
6. Передача _суб V (мл) в течение ночи культуру (10 - V _суб) мл среды YENB с соответствующими антибиотиками для каждого штамма. Вырастить новую культуру в течение ночи при 30 ° C в шейкере со скоростью вращения 250 оборотов в минуту, пока OD ₆₀₀ значение не находится в диапазоне 1,7-2,0.
7. Измерьте и запишите OD ₆₀₀ значений для каждой культуральной жидкости и использовать следующую формулу известковоУлате необходимый объем (V _инф) в разбавлении в 50 мл инфильтрации буфере до конечной OD ₆₀₀ 0,12 для каждого штамма.
   V _инф (мл) = (50 мл) х (0.12) / OD ₆₀₀
8. Передача _инф V (мл) каждой культуры в микроцентрифужных трубки и спином вниз клетки центрифугированием при 12000 х г в течение 2 мин, удалить супернатант и затем клетки вновь суспендируют в 10 мл буфера инфильтрация (10 мМ MES, рН 5,5, 10 мМ MgSO ₄₎ путем встряхивания кратко.
9. Смешать ресуспендировали клетки pBYGFP pREP110 + + p19, спина клетки вниз при 12000 х г в течение 2 мин и ресуспендируют в общей сложности 50 мл инфильтрации буфера. Это Agrobacteria комбинация для geminiviral выражения GFP.
10. Аналогично, смешайте следующие комбинации Agrobacteria клетки, спин вниз и ресуспендируйте их в 50 мл буфера инфильтрации. Они включают в себя (1) + pBYDsRed pREP110 + P19 для geminiviral выражение DsRed, (2) pBYGFP + + pBYDsRed pREP110+ P19 для geminiviral совместной экспрессии GFP и DsRed, (3) pREp110 + p19 как отрицательный контроль geminiviral выражения, (4) Пич-GFP + + pICH15879 pCH14011 MagnICON для выражения GFP, (5) Пич-DsRed + + pICH15879 pCH14011 для MagnICON выражение DsRed, и (6) + pICH15879 pCH14011 в качестве отрицательного контроля для MagnICON выражения.

2.2 Подготовка к вакуумной инфильтрации

1. Inoculate и культуры каждого штамма GV3101 содержащий geminiviral векторы или MagnICON векторов в 15 мл среды YENB с соответствующими антибиотиками в 50-мл автоклаве колбу и расти в течение ночи, как описано в шприц инфильтрации выше.
2. Измерение и запись OD ₆₀₀ значений для каждой культуральной жидкости с помощью спектрофотометра и использовать приведенную ниже формулу для расчета необходимого объема (V _суб) для пересевали на новую культуру с начальной OD ₆₀₀ 0,025 в 250 мл среды YENB с соответствующими антибиотиками .
   В _суб (Мл) = (250 мл) х (0,025) / OD ₆₀₀
3. Передача _суб V (мл) в течение ночи культуру (250 - V _суб) мл среды YENB в 1 л автоклаве колбе с соответствующими антибиотиками для каждого штамма и расти новую культуру быстро, как описано в шприц инфильтрации выше.
4. Измерение и запись OD ₆₀₀ значений для каждой культуральной жидкости и использовать приведенную ниже формулу для расчета необходимого объема (V _инф), чтобы развести в 3 л инфильтрации буфере до конечной OD ₆₀₀ 0,12 для каждого штамма.
   _Инф V (мл) = (3000 мл) х (0.12) / OD ₆₀₀
5. Гранулы и ресуспендируют V _инф (мл) каждой культуры в инфильтрация буфера, как описано в шприц инфильтрации и смешивать ресуспендировали культур в соответствии с описанной комбинации для шприца инфильтрации. Repellet смешанный агробактерий клетки и ресуспендируют их в 3 л инфильтрации буфера.

3. Инфильтрация

Шприц 3,1 инфильтрация

1. Выбор четырех 6-недельных N. benthamiana растения с 5 листьев каждая. В первых трех листьев считая сверху каждого растения будут проникли полностью с одной из комбинаций А. tumefaciens штаммов инфильтрации в буфер. Четвертый лист будет спот-проникли со всеми четырьмя комбинациями деформации для geminiviral выражения или все три комбинации для MagnICON выражения. Последний лист на каждое растение будет проникли с комбинациями отрицательных контролей.
2. Создание уменьшенной ник с иглой в эпидермисе на обратной стороне листа (фиг. 2А). Внимание: убедитесь, чтобы не поцарапать сильно, чтобы не проколоть листать обеих сторон, а Agrobacteria клеток в инфильтрации смесь пройдет через прокол на другой стороне листа.
3. Возьмем твердую провести на передней стороне листа и при применении нежныйСчетчик давление на Ника с большим пальцем одной руки, вводят в Agrobacterium смесей инфильтрации буфера в ник с помощью шприца без иглы (рис. 2В). Примечание: Так как смесь Agrobacterium входит в межклеточное пространство листа, проникли Область станет заметно темнее зеленый (рис. 2С).
4. Продолжают вводить Agrobacterium смесей в ник, пока темно-зеленый круг не перестает расширяться. Создайте другой ник и повторите шаги 3.1.2-3.1.4, пока весь лист не проникли и весь лист станет темно-зеленым в течение первых трех листьев и последний лист.
5. За четвертый лист каждого растения, все четыре (geminiviral вектор) или три (MagnICON вектор) комбинаций будет проникли в нее. Сделайте один ник для каждой комбинации штаммов Agrobacterium, и проникновения в каждом нике с одной комбинации.
6. После инфильтрации, переместите растения обратно в комнату роста и мониторингаTor экспрессии белка между 2-15 дней после инфильтрации (точек на дюйм).

3,2 вакуумной инфильтрации

1. Положите в ванну вакуум эксикаторе и передачи 3 л инфильтрации буфер, содержащий штаммы Agrobacterium к ванне. Подключите эксикаторе Vacuubrand вакуумный насос диафрагмы (рис. 3А).
2. Поместите растение вверх дном на эксикаторе пластины (рис. 3В) и опустите пластину с заводом, пока весь листьев и стеблей система не будет погружена в инфильтрации буфера с пластиной отдыхал на вершине из ванны. Установите кольцо O эксикаторе по кругу и положить эксикаторе крышку на камеру (рис. 3в).
3. Включите вакуумный насос и начать отсчет, когда вакуум достигает 100 мбар. Медленно откройте выпускной клапан на эксикаторе после 1 мин при 100 мбар, чтобы вход Agrobacteria в промежуточные места подводных растительных тканей. Повторите этот шаг одним дополнительнальных время, чтобы обеспечить хорошее проникновение.
4. После инфильтрации, возьмите растение из эксикаторе и положил его обратно в вертикальное положение. Переместить растения обратно в комнату рост и выражение белка между монитором 2-15 точек на дюйм.

4. Флуоресцентной детекции белков и фотография

1. Начиная с 2 точек на дюйм, перемещение растений в темной комнате и блеск ультрафиолетового света на задней стороне пропитанных листов с ручным УФ-лампы.
2. Обратите внимание на зеленую флуоресценцию GFP или красной флуоресценции DsRed. GFP испускает сильный сигнал с длиной волны ультрафиолетового света, в то время DsRed сильнее под короткие световые волны УФ.
3. Сфотографировать люминесцентные листья с обычной цифровой камерой без вспышки.
4. Переместить растения обратно в комнату после роста наблюдения или фотографии.

Результаты

1. Выражение флуоресцентных белков с помощью шприца инфильтрация

Чтобы продемонстрировать эффективность шприца инфильтрации Agrobacterium в ткань растений, мы протестировали экспрессии двух флуоресцентных белков - GFP и DsRed - двумя разными деконструкции завода вирусных ве?...

Обсуждение

Растущие требования к основе белка во всем мире фармацевтическая требуют новых добывающих платформ, которые являются надежной, масштабируемой, недорогой и безопасный. Растения показано, что одним из наиболее перспективных альтернативных производственных систем для фармацевтическо?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagents
GFP	Invitrogen	V353-20	www.invitrogen.com See reference: Lico and Chen, et al 2008
DsRed	Clontech	632152	www.clontech.com See reference: Baird and Zacharias, et al 2000
MagnICON Vector	Icon Genetics	n/a	www.icongenetics.com See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006
Geminiviral Vector	Author’s Lab	n/a	See reference: Chen and He, et al 2011
N. benthamiana	Author’s Lab	n/a	herbalistics.com.au
Agrobacterium tumefaciens strain gv3101	Author’s Lab	n/a	See reference: Lai and Chen 2012
LB Agar Carbenicillin-100, plates	Sigma	L0418	www.sigmaaldrich.com
LB Agar Kanamycin-50, plates	Sigma	L0543	www.sigmaaldrich.com
Magnesium sulfate hepa hydrate	Sigma	M2773-500 g	www.sigmaaldrich.com
Bacto-Tryptone	Fisher	73049-73-7	www.fishersci.com
Bacto Yeast Extract	Becton, Dickinson CO.	REF 212750	www.bd.com
Difco Nutrient Broth	Becton, Dickinson CO.	REF 234000	www.bd.com
MES hydrate Buffer	Sigma	M8250-1kg	www.sigmaaldrich.com
Carbenicillin	Sigma	C1613-1ML	www.sigmaaldrich.com
Kanamycin	Sigma	70560-51-9	www.sigmaaldrich.com
Sodium Hydroxide	Sigma	221465	www.sigmaaldrich.com
Jack’s Fertilizer	Hummert International	Jul-25	www.hummert.com
Equipment
Vacuubrand MD4 Vacuum Pump	Fisher	13-878-113	www.fishersci.com
Vacuum Air Regulator Valve	Fisher	NC9386590	www.fishersci.com
Desiccator 12 1/8" with O ring	Fisher	08-594-15C	www.fishersci.com
3 L Tub	Rubber-Maid	n/a	Rubbermaid Servn’ Saver Bowl, 10-cup will work
plate/shelf 230ML	Fisher	NC9489269	www.fishersci.com
Peat Pellet	Hummert International	14-2370-1	www.hummert.com
Propagation Tray Dome	hydrofarm	132052	www.hydroponics.net
Propagaiton Tray	hydrofarm	138758	www.hydroponics.net
Virbo Hand Seeder	Gro-Mor INC	n/a	www.gro-morent.com
Flora Cart 4 shelf	Hummert International	65-6924-1	www.hummert.com
15 ml Round Bottom Culture Tubes	Sigma	CLS430172-500EA	http://www.sigmaaldrich.com
Spectrophotometer	Bio-Rad	170-2525	www.bio-rad.com
Spectrophotometer Cuvettes	Bio-Rad	223-9950	www.bio-rad.com
Microcentrifuge Tubes	USA Scientific	1415-2500	www.usascientific.com
Benchtop Centrifuge	Bio-Rad	166-0602EDU	www.bio-rad.com
Incubator/Shaker	Eppendorf	Excella E25	www.eppendorf.com
Ultraviolet Light Model#: UVGL-25	UVP	95-0021-12	www.uvp.com