Agroinfiltration efficace des plantes pour l'expression transitoire de haut niveau de protéines recombinantes

Résumé

Les plantes offrent un nouveau système pour la production de protéines pharmaceutiques à l'échelle commerciale qui est plus évolutive, rentable et sûre de paradigmes d'expression actuels. Dans cette étude, nous présentons une approche simple et pratique, mais évolutive pour introduire du gène cible contenant Agrobacterium tumefaciens Dans les plantes pour l'expression transitoire de protéines.

Résumé

Culture de cellules de mammifères est la plate-forme importante pour la production commerciale de vaccins humains et protéines thérapeutiques. Toutefois, il ne peut pas répondre à la demande mondiale croissante pour les produits pharmaceutiques en raison de son évolutivité limitée et coût élevé. Les plantes ont montré pour être l'une des plateformes les plus prometteuses alternatives de production pharmaceutiques qui sont robustes, évolutives et à faible coût et en toute sécurité. Le développement récent de vecteurs à base de virus a permis l'expression transitoire rapide et à haut niveau de protéines recombinantes dans les plantes. Pour optimiser davantage l'utilité du système d'expression transitoire, nous démontrons une méthode simple, efficace et évolutive pour introduire du gène cible contenant Agrobacterium dans un tissu végétal dans cette étude. Nos résultats indiquent que agroinfiltration à la fois avec une seringue vide et méthodes ont abouti à la mise en place efficace d'Agrobacterium dans des feuilles et de la production robuste de deux protéines fluorescentes, GFP et DsRed. Par ailleurs,nous démontrons les avantages uniques offerts par les deux méthodes. infiltration de la seringue est simple et ne nécessite pas de matériel coûteux. Il permet également la souplesse voulue pour infiltrer la durée du congé avec un gène cible, ou d'introduire des gènes cibles multiples sur une feuille. Ainsi, il peut être utilisé pour l'expression de l'échelle du laboratoire de protéines recombinantes ainsi que pour comparer différentes protéines ou des vecteurs de rendement ou d'expression cinétique. La simplicité de l'infiltration de la seringue suggère également son utilité dans l'enseignement secondaire et collégial pour le sujet de la biotechnologie. En revanche, l'infiltration sous vide est plus robuste et peut être adapté en place pour la production commerciale de protéines pharmaceutiques. Il offre également l'avantage d'être en mesure de agroinfiltrate espèces végétales qui ne se prêtent pas à l'infiltration de la seringue comme la laitue et Arabidopsis. Dans l'ensemble, la combinaison de la seringue et agroinfiltration à vide offre aux chercheurs et éducateurs un moyen simple, efficace et robusteméthodologie pour l'expression transitoire de protéines. Il va grandement faciliter le développement de protéines pharmaceutiques et de promouvoir l'enseignement des sciences.

Introduction

Depuis les années 1970, les plantes ont été étudiées comme des alternatives aux cultures de cellules de mammifères, d'insectes et des bactéries pour la production commerciale de protéines recombinantes et des protéines thérapeutiques ^1. Les systèmes à base de plantes pour l'expression de produits biopharmaceutiques ont montré des résultats prometteurs au cours des dernières années, plusieurs nouveaux traitements pour les maladies, comme la maladie de Gaucher ^2, et la grippe aviaire H5N1 ^3, ont connu le succès dans les essais cliniques. Le développement des mécanismes compétents pour l'expression de protéines recombinantes dans les plantes dans les décennies qui ont suivi ces premières expériences a créé le potentiel pour les systèmes à base de plantes pour modifier le paradigme actuel de la production de protéines pour trois raisons principales. Tout d'abord, il ya une diminution notable des coûts de bioréacteurs de mammifères, d'insectes et bactéries nécessitent des dépenses considérables de démarrage, les médias de croissance coûteux, et les processus complexes de purification en aval ^4. La création de plante transgénique stablelignes leur permet aussi de dépasser l'évolutivité d'autres systèmes d'expression que les plantes exprimant des protéines pourraient être cultivées et récoltées à l'échelle agricole ^5. Deuxièmement, les systèmes d'expression à base de plantes réduisent considérablement le risque de transmission d'un agent pathogène humain ou d'un animal à partir de l'hôte protéines exprimant à l'homme, ce qui démontre la supériorité de la sécurité publique ^6. Enfin, les plantes utilisent un système endomembranaire eucaryote qui est semblable à des cellules de mammifères, ce qui permet à la bonne modification post-traductionnelle de protéines comprenant la glycosylation et l'assemblage des protéines à sous-unités multiples ^7. Cette capacité met systèmes à base de plantes en avance sur ceux basés sur des systèmes procaryotes, comme les bactéries, car un plus grand nombre de protéines recombinantes pharmaceutiques, y compris les anticorps monoclonaux (Acm), ont une structure plus complexe et nécessiterait d'importantes modifications post-traductionnelles ou assemblage ^8.

Il existe deux grands appromaux à l'expression de protéines recombinantes dans les plantes. Le premier est le développement d'une lignée transgénique stable, où l'ADN codant pour la protéine cible est clonée dans une cassette d'expression et introduit soit à des génomes nucléaires ou chloroplastiques. Pour ce faire, l'ADN étranger devient héréditaire à travers les générations et permet de considérablement amélioré l'évolutivité, bien au-delà que d'autres systèmes d'expression ^1. Introduction d'ADN exogène dans le génome nucléaire est habituellement obtenue par Agrobacterium tumefaciens infection des tissus de la plante ou, plus rarement, par bombardement de microprojectiles du tissu ^9. Les hormones végétales sont ensuite utilisés pour induire la différenciation et de la croissance du tissu de plante transgénique tel que les racines et les feuilles. La transformation du génome chloroplastique ne peut pas être obtenue avec A. tumefaciens, mais repose entièrement sur ​​des particules d'or ou de tungstène recouvertes d'ADN tiré balistique dans des cellules végétales. La seconde méthode d'exprimer recombinaisonnt protéines dans les plantes est à travers l'expression transitoire ^10. Dans ce scénario, les vecteurs dérivés de virus hébergeant le gène d'intérêt sont livrés via A. tumefaciens aux plantes entièrement développées par un processus appelé agroinfiltration. Au lieu d'intégrer dans le génome de la plante, la construction du gène livré va alors commencer à diriger la production transitoire de la protéine désirée, qui peut être récoltée et isolé après une courte période d'incubation. Expression transitoire de gènes offre l'avantage d'une plus grande accumulation de la protéine globale ainsi qu'une amélioration du temps de production de protéines, comme les plantes seront prêts à récolter environ 1-2 semaines après agroinfiltration ^11. Ce chiffre est nettement plus rapide que les procédés de production, la sélection et la confirmation de lignées de plantes transgéniques stables, ce qui peut prendre plusieurs mois à un an. Cependant, c'est aussi la limitation du système d'expression transitoire, car il ne cédera pas génétiquement stable plante lines qui peuvent être utilisés pour générer une banque de semences pour la production commerciale à grande échelle. Malgré cela, des approches ont été développées pour améliorer l'expression transitoire à grande échelle. Ici, nous démontrons une méthode de génération de protéines exprimant transitoires Nicotiana benthamiana utilisant des vecteurs viraux déconstruits livrés par A. tumefaciens.

Deux grandes méthodes sont en cours d'élaboration pour la livraison de A. tumefaciens dans les tissus de la plante: l'infiltration de l'échelle du laboratoire via une seringue et d'infiltration à grande échelle via la chambre à vide. Les deux protocoles sont décrits ici en utilisant N. benthamiana, qui est étroitement liée à la plante de tabac commun, comme la plante hôte pour l'expression transitoire de deux protéines fluorescentes: la protéine fluorescente verte (GFP) de méduse Aequorea victoria et la protéine fluorescente rouge de Discosoma corail (DsRed) ^12,13. N. benthamiana est la plante hôte la plus courante pourprotéine recombinante, car il se prête à la transformation génétique, peut produire de grandes quantités de biomasse rapidement, et est un producteur prolifique de semences pour la production à grande échelle jusqu'à ^14. Un autre avantage de l'utilisation de N. benthamiana comme hôtes pour l'expression des protéines est la disponibilité d'une variété de vecteurs d'expression ^2,5. Dans cette étude, deux vecteurs viraux déconstruits, l'un basé sur un ARN système réplicon (vecteurs MagnICON) et l'autre dérivé du système réplicon ADN (vecteurs geminiviral) ^4,11 virus du nanisme jaune de haricot ^(BeYDV), le virus de la mosaïque du tabac (TMV) ^15-18, sont utilisés pour transporter le gène GFP et DsRed et de les livrer dans N. cellules benthamiana Via A. tumefaciens Trois constructions d'ADN. seront utilisés pour la GFP ou expression DsRed avec des vecteurs d'MagnICON. Ils comprennent en 5 'module (pICH15879) contenant le promoteur et d'autres éléments génétiques pour entraîner l'expression du gène cible, l'extrémité 3' module contenant le gène d'intérêt (PICH-GFP-PICH ou DsRed), et le module de l'intégrase (pICH14011) codant pour une enzyme qui intègre les extrémités 5 'et 3' modules ensemble lors de l'expression ^8,15. Trois constructions d'ADN sont également nécessaires pour l'expression des vecteurs geminiviral. En plus de vecteurs contenant le réplicon du gène cible (pBYGFP ou pBYDsRed), un vecteur codant pour la protéine de réplication (pREP110) est requise pour l'amplification de la cible réplicon ^11,14,16. En outre, l'inclusion d'un vecteur codant pour la p19 suppresseur de silence à partir de virus de rabougrissement de la tomate est souhaitée pour l'expression d'un gène cible de haut niveau ^11,16.

Il ya généralement trois grandes étapes pour l'introduction de gènes de protéines recombinantes dans des cellules végétales par agroinfiltration y compris la croissance des plantes, A. préparation culture tumefaciens, et l'infiltration. Comme chaque étape est cruciale pour le succès final de cette procédure, par conséquent, une description détaillée de chaque est fournià la fois pour l'infiltration de la seringue et l'infiltration sous vide en dessous.

Protocole

1. Croissance des végétaux

1. Lieu 60 pastilles de tourbe dans un bac de propagation. Ajouter 4 L d'eau du robinet et laisser les pastilles de tourbe absorber l'eau pendant 2 heures.
2. Ajouter 2 N. benthamiana graines dans chaque tourbe granulés à l'aide d'un semoir, couvrent le plateau avec un dôme en plastique transparent, et leur permettre de germer dans une ° C, l'environnement d'humidité de 25 à 84% avec un cycle jour / nuit 16/8 h (figure 1A).
3. Retirez le dôme deux semaines après le semis, drainer l'eau du bac, et ajouter 2 litres d'engrais de Jack à une concentration de 1,48 g / L (figure 1B). Continuer à pousser des plantes dans une ° C, l'environnement d'humidité de 25 à 50% avec un HR jour / cycle de nuit 16/8. Fournir 2 L de l'engrais Jack de tous les 2 jours par plateau.
4. A la semaine 4, transférer les plantes avec pastilles de tourbe à un nouveau plateau qui héberge six usines de fournir suffisamment d'espace pour davantage de croissance (figure 1C) jusqu'à ce qu'ils soient prêts à être infiltré à 6 semaines d'âge (figure1D).

2. A. tumefaciens Culture Préparation

2.1 Préparation pour l'infiltration de la seringue

1. Série A. GV3101 souches tumefaciens contenant les vecteurs geminiviral p19, pREP110, pBYGFP et pBYDsRed sur des plaques d'agar LB contenant de la kanamycine (100 pg / ml). Morts à une souche par plaque et croître à 30 ° C pendant 48 heures.
2. De même, série et grandir GV3101 souches portant les vecteurs de MagnICON de l'extrémité 5 'module (pICH15879), 3' module contenant le gène cible de la GFP ou DsRed (Pich-GFP ou Pich-DsRed) et intégrase (pCH14011) sur gélose LB des plaques contenant de la carbénicilline (100 ug / ml).
3. À partir d'une seule colonie sur la plaque de gélose LB, inoculer GV3101 souches portant vecteurs geminiviral dans 3 ml de milieu YENB (0,75% d'extrait de levure Bacto, 0,8% de bouillon de nutriments, ajuster le pH à 7,5 avec NaOH) + kanamycine (100 pg / ml) dans un tube de culture à fond rond de 15 ml, grandir la culture liquide à 30 ° C dansun agitateur pendant une nuit avec une vitesse de rotation de 300 tours par minute.
4. De même, ensemencer et cultiver GV3101 souches portant les vecteurs de MagnICON dans YENB médias + carbénicilline (100 ug / ml) dans un shaker pendant la nuit à 30 ° C.
5. Mesurer et enregistrer DO ₆₀₀ valeurs pour chaque culture liquide avec un spectrophotomètre et utiliser la formule suivante pour calculer le volume nécessaire (V _sub) pour être repiquées pour une nouvelle culture avec un OD à partir de 0,025 ₆₀₀ dans 10 ml de milieu YENB avec des antibiotiques appropriés .
   V _sub (ml) = (10 ml) x (0,025) / OD ₆₀₀
6. Transfert V _sub (ml) de la culture de la nuit à (10 - V _sub) ml de milieu YENB avec des antibiotiques appropriés pour chaque souche. Cultiver la nouvelle culture d'une nuit à 30 ° C dans un agitateur avec une vitesse de rotation de 250 tours par minute jusqu'à ce que de la valeur de DO ₆₀₀ est dans la gamme de 1,7 à 2,0.
7. Mesurer et enregistrer OD ₆₀₀ valeurs pour chaque culture liquide et utiliser la formule ci-dessous pour calculer le volume nécessaire (V _inf) doit être dilué dans 50 ml de tampon d'infiltration de donner une DO finale ₆₀₀ de 0,12 pour chaque souche.
   V _inf (ml) = (50 ml) x (0,12) / OD ₆₀₀
8. Transfert V _inf (ml) de chaque culture dans un tube à centrifuger et centrifuger les cellules par centrifugation à 12000 g pendant 2 min, retirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans un tampon d'infiltration de 10 ml (10 mM MES, pH 5,5, 10 mM MgSO ₄₎ au vortex brièvement.
9. Mélanger les cellules de pBYGFP + pREP110 + p19 remis en suspension, tourner les cellules vers le bas à 12.000 g pendant 2 min, et remettre au total de 50 ml de tampon d'infiltration. Cette combinaison Agrobacteria est l'expression de la GFP geminiviral.
10. De même, mélanger les combinaisons suivantes de cellules agrobactéries, ralentit et les remettre en suspension dans 50 ml de tampon d'infiltration. Ils incluent (1) pBYDsRed + pREP110 + p19 d'expression geminiviral de DsRed, (2) pBYGFP + + pBYDsRed pREP110+ P19 pour geminiviral co-expression de la GFP et DsRed, (3) pREp110 + p19 comme contrôle négatif de l'expression geminiviral, (4) Pich-GFP + + pICH15879 pCH14011 d'expression MagnICON de la GFP, (5) Pich-DsRed + pICH15879 + pCH14011 pour l'expression de MagnICON DsRed, et (6) pICH15879 + pCH14011 comme témoin négatif pour l'expression d'MagnICON.

2.2 Préparation pour une infiltration sous vide

1. Inoculate et la culture de chaque souche GV3101 contenant des vecteurs geminiviral ou vecteurs de MagnICON dans 15 ml de milieu YENB avec des antibiotiques appropriés dans un flacon stérilisé à l'autoclave de 50 ml et de croître pendant la nuit comme décrit pour seringue infiltration ci-dessus.
2. Mesurer et enregistrer DO ₆₀₀ valeurs pour chaque culture liquide avec un spectrophotomètre et utiliser la formule suivante pour calculer le volume nécessaire (V _sub) pour être repiquées pour une nouvelle culture avec un départ OD ₆₀₀ de 0.025 dans 250 ml de milieu YENB avec des antibiotiques appropriés .
   V _sous (Ml) = (250 ml) x (0,025) / OD ₆₀₀
3. Transfert V _sub (ml) de la culture de la nuit à (250 - V _sub) ml de milieu YENB dans un ballon de 1 autoclave avec des antibiotiques appropriés pour chaque souche et croître la nouvelle culture de la nuit tel que décrit à l'infiltration de la seringue au-dessus.
4. Mesurer et enregistrer OD ₆₀₀ valeurs pour chaque culture liquide et utiliser la formule suivante pour calculer le volume nécessaire (V _inf) à diluer dans 3 L de tampon d'infiltration de donner une DO finale ₆₀₀ de 0,12 pour chaque souche.
   V _inf (ml) = (3000 ml) x (0,12) / OD ₆₀₀
5. Pellet et remettre en suspension _inf V (ml) de chaque culture dans le tampon d'infiltration tel que décrit à l'infiltration de la seringue et mélanger les cultures remises en suspension en fonction des combinaisons mentionnées à l'infiltration de la seringue. Repellet les cellules agrobactéries mixtes et les remettre en suspension dans 3 L de tampon d'infiltration.

3. Infiltration

3.1 Seringue Infiltration

1. Choisissez quatre âgées de 6 semaines N. benthamiana avec 5 feuilles chacun. Les trois premières feuilles de comptage à partir de la partie supérieure de chaque plante sont infiltrés entièrement à l'une des combinaisons de A. tumefaciens souches dans le tampon d'infiltration. La quatrième feuille sera ponctuelle infiltré avec toutes les combinaisons de contrainte quatre pour l'expression geminiviral ou trois combinaisons pour l'expression MagnICON. La dernière feuille de chaque plante sera infiltrée par des combinaisons de contrôles négatifs.
2. Créer une petite entaille avec une aiguille dans l'épiderme de la face arrière de la feuille (figure 2A). Attention: veillez à ne pas rayer si difficile à percer la feuille par les deux parties, comme les cellules agrobactéries dans le mélange d'infiltration vont passer à travers la ponction de l'autre côté de la feuille.
3. Prendre une prise ferme de la face avant de la feuille et en appliquant doucecontre-pression à l'entaille avec le pouce d'une main, injecter des mélanges d'Agrobacterium dans le tampon d'infiltration dans le nick avec une seringue sans aiguille (figure 2B). Remarque: Comme le mélange Agrobacterium pénètre dans l'espace intercellulaire de la feuille, la zone d'infiltration devient vert visiblement plus sombre (figure 2C).
4. Continuer à injecter des mélanges d'Agrobacterium dans le nick jusqu'à ce que le cercle vert foncé cesse de se développer. Créer un autre nick et répétez les étapes 3.1.2-3.1.4 jusqu'à la feuille entière est infiltrée et la feuille entière devient vert foncé pour les trois premières feuilles et la dernière feuille.
5. Pour la quatrième feuille de chaque plante, toutes les combinaisons de quatre (vecteur geminiviral) ou trois (MagnICON vecteur) seront infiltrés dedans. Faire une entaille pour chaque combinaison de souches d'Agrobacterium, et infiltrer chaque entaille avec une combinaison.
6. Après infiltration, déplacer des plantes à la salle de la croissance et Moniexpression de protéine TOR entre 2-15 jours après l'infiltration (dpi).

3.2 Infiltration vide

1. Placer un bac dans un dessiccateur à vide et un tampon d'infiltration de L 3 de transfert contenant les souches d'Agrobacterium à la baignoire. Raccorder le dessiccateur à une pompe à vide à membrane Vacuubrand (figure 3A).
2. Placer une plante à l'envers sur la plaque de dessiccateur (figure 3B) et abaisser la plaque avec la plante jusqu'à ce que toute la feuille et le système de tige est immergée dans le tampon d'infiltration avec la plaque de repos au sommet de la cuve. Placez l'anneau de dessiccateur O le long de la jante et mettre le couvercle de dessiccateur sur la chambre (figure 3C).
3. Mettre la pompe à vide et commencer à chronométrer quand le vide atteint 100 mbar. Ouvrez lentement la vanne de sortie sur le dessiccateur après 1 min à 100 mbar pour permettre l'entrée de Agrobacteria dans les espaces interstitiels des tissus de la plante submergée. Répétez cette étape une additional temps pour assurer une bonne infiltration.
4. Après infiltration, prenez la plante sur le dessiccateur et le remettre dans sa position verticale. Déplacez plantes à la salle de la croissance et de l'expression de la protéine de contrôle entre 2-15 dpi.

4. Détection de la protéine fluorescente et Photographie

1. A partir de 2 dpi, déplacer des plantes dans une pièce sombre et faire briller la lumière UV sur la face arrière des feuilles infiltrées avec une lampe UV à main.
2. Respecter la fluorescence verte de la GFP ou la fluorescence rouge de DsRed. GFP émet un signal plus fort avec de la lumière UV à ondes longues, tandis que DsRed est plus forte sous la lumière UV à ondes courtes.
3. Prenez des photos de feuilles fluorescentes avec un appareil photo numérique ordinaire sans flash.
4. Déplacez plantes à la salle de la croissance après l'observation ou la photographie.

Résultats

1. L'expression de protéines fluorescentes par infiltration de la seringue

Pour démontrer l'efficacité de la seringue infiltration d'Agrobacterium dans les tissus de la plante, nous avons testé l'expression de deux protéines fluorescentes - GFP et DsRed - par deux plantes vecteurs viraux différents déconstruits - geminiviral et MagnICON - en N. benthamiana. Pour N. benthamiana feuilles qui ont été entièrement infiltrés avec agrobactérie...

Discussion

La demande croissante de produits pharmaceutiques à base de protéines dans le monde entier exigent de nouvelles plates-formes de production qui sont robustes, évolutives et à faible coût et en toute sécurité. Les plantes ont montré pour être l'un des systèmes de production alternatifs les plus prometteurs pour la production de protéines pharmaceutiques. Au cours des dernières années, le développement de déconstruits vecteurs à base de virus a permis l'expression transitoire de protéines dans les...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagents
GFP	Invitrogen	V353-20	www.invitrogen.com See reference: Lico and Chen, et al 2008
DsRed	Clontech	632152	www.clontech.com See reference: Baird and Zacharias, et al 2000
MagnICON Vector	Icon Genetics	n/a	www.icongenetics.com See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006
Geminiviral Vector	Author’s Lab	n/a	See reference: Chen and He, et al 2011
N. benthamiana	Author’s Lab	n/a	herbalistics.com.au
Agrobacterium tumefaciens strain gv3101	Author’s Lab	n/a	See reference: Lai and Chen 2012
LB Agar Carbenicillin-100, plates	Sigma	L0418	www.sigmaaldrich.com
LB Agar Kanamycin-50, plates	Sigma	L0543	www.sigmaaldrich.com
Magnesium sulfate hepa hydrate	Sigma	M2773-500 g	www.sigmaaldrich.com
Bacto-Tryptone	Fisher	73049-73-7	www.fishersci.com
Bacto Yeast Extract	Becton, Dickinson CO.	REF 212750	www.bd.com
Difco Nutrient Broth	Becton, Dickinson CO.	REF 234000	www.bd.com
MES hydrate Buffer	Sigma	M8250-1kg	www.sigmaaldrich.com
Carbenicillin	Sigma	C1613-1ML	www.sigmaaldrich.com
Kanamycin	Sigma	70560-51-9	www.sigmaaldrich.com
Sodium Hydroxide	Sigma	221465	www.sigmaaldrich.com
Jack’s Fertilizer	Hummert International	Jul-25	www.hummert.com
Equipment
Vacuubrand MD4 Vacuum Pump	Fisher	13-878-113	www.fishersci.com
Vacuum Air Regulator Valve	Fisher	NC9386590	www.fishersci.com
Desiccator 12 1/8" with O ring	Fisher	08-594-15C	www.fishersci.com
3 L Tub	Rubber-Maid	n/a	Rubbermaid Servn’ Saver Bowl, 10-cup will work
plate/shelf 230ML	Fisher	NC9489269	www.fishersci.com
Peat Pellet	Hummert International	14-2370-1	www.hummert.com
Propagation Tray Dome	hydrofarm	132052	www.hydroponics.net
Propagaiton Tray	hydrofarm	138758	www.hydroponics.net
Virbo Hand Seeder	Gro-Mor INC	n/a	www.gro-morent.com
Flora Cart 4 shelf	Hummert International	65-6924-1	www.hummert.com
15 ml Round Bottom Culture Tubes	Sigma	CLS430172-500EA	http://www.sigmaaldrich.com
Spectrophotometer	Bio-Rad	170-2525	www.bio-rad.com
Spectrophotometer Cuvettes	Bio-Rad	223-9950	www.bio-rad.com
Microcentrifuge Tubes	USA Scientific	1415-2500	www.usascientific.com
Benchtop Centrifuge	Bio-Rad	166-0602EDU	www.bio-rad.com
Incubator/Shaker	Eppendorf	Excella E25	www.eppendorf.com
Ultraviolet Light Model#: UVGL-25	UVP	95-0021-12	www.uvp.com