組換えタンパク質の高レベルの一過性発現のための植物の効率的なアグロ

要約

植物は現在の式のパラダイムより、スケーラブルでコスト効率の高い、安全である商業規模で医薬品タンパク質の生産のための新たなシステムを提供しています。本研究では、我々を含む、標的遺伝子を導入するための簡単​​で便利な、まだスケーラブルなアプローチを報告アグロバクテリウム·ツメファシエンスタンパク質一過性発現のための植物へ。

要約

哺乳動物細胞培養は、ヒト用ワクチンと治療用タンパク質の商業生産のための主要なプラットフォームです。しかし、その限られたスケーラビリティと高コストのために医薬の増加世界的な需要を満たすことができない。植物は、低コストで安全な、スケーラブル、堅牢で最も有望な代替医薬品製造プラットフォームの1つであることが示されている。ウイルスベースのベクターの最近の開発は、植物における組換えタンパク質の迅速かつ高レベルの一過性発現を可能にした。さらに一過性発現システムの有用性を最適化するために、我々はこの研究では、植物組織に標的遺伝子を含有するアグロバクテリウムを導入するための、単純で効率的でスケーラブルな方法を示す。 GFPとDsRedの、両方シリンジ、真空方法は葉と2つの蛍光タンパク質の強固な生産にアグロバクテリウムの効率的な導入につながったとの我々の結果は、アグロを示している。さらに、我々は両方の方法によって提供されるユニークな利点を示しています。シリンジ浸潤は簡単で、高価な機器を必要としません。また、柔軟性がいずれかの標的遺伝子で全体の休暇に潜入するために、または1つの葉に複数のターゲットの遺伝子を導入することができます。このように、組換えタンパク質の実験室規模の発現のために、並びに収率又は発現動態のために異なるタンパク質またはベクターを比較するために使用することができる。シリンジ浸潤のシンプルさは、またバイオテクノロジーの主題のための高校や大学教育におけるその有用性を示唆している。対照的に、真空浸潤がより堅牢であり、医薬タンパク質の商業的製造のためにスケールアップすることができる。また、レタスやシロイヌナズナなどのシリンジ浸潤従順でない植物種をagroinfiltrateすることができるという利点があります。全体的には、注射器、真空アグロの組み合わせは、シンプルで効率的、かつ堅牢な研究者や教育者を提供しています一過性タンパク質発現のための方法。それが大幅に医薬品タンパク質の開発を促進し、科学教育を推進していきます。

概要

1970年代から、植物は、組換えタンパク質およびタンパク質治療¹の商業的生産のために、哺乳動物、昆虫、および細菌細胞培養物の代替として検討されている。バイオ医薬品の発現のための植物ベースのシステムでは、ゴーシェ病^2、鳥H5N1インフルエンザ³のように、病気のためのいくつかの新規治療法として近年の約束を示している臨床試験の成功を示している。それらの最初の実験以来、数十年の植物での組換えタンパク質の発現のために有能なメカニズムの開発には、3つの主な理由のためにタンパク質生産の現在のパラダイムを変更する植物ベースのシステムの可能性を作成しました。まず、哺乳類、昆虫、そして細菌のバイオリアクターは、かなりのスタートアップコスト、高価な増殖培地、下流浄化⁴のための複雑なプロセスを必要とし、コストの顕著な低下を起こすことがあります。安定したトランスジェニック植物の作成ラインはまた、タンパク質を発現する植物が成長し、農業の規模⁵で収穫することができるように、彼らが他の発現システムのスケーラビリティを上回ることができます。第二に、植物に基づく発現系は、著しく公共の安全⁶の優位性を実証し、ヒトへのタンパク質を発現する宿主からヒトまたは動物の病原体を送信する危険性を低減する。最後に、植物は、グリコシル化およびマルチサブユニットタンパク質のアセンブリ⁷を含むタンパク質の適切な翻訳後修飾を可能にする、哺乳動物細胞に類似している真核細胞内膜システムを利用する。この能力が先に細菌などの原核生物系、に基づいて、それらの植物ベースのシステムを置き、モノクローナル抗体（mAb）を含む医薬品の組換えタンパク質の広い数が、より複雑な構造を持ち、広範な翻訳後修飾またはアセンブリ^8が必要です。

二つの主要な適切があります植物において組換えタンパク質を発現する痛み。まず、標的タンパク質をコードするDNAを発現カセットにクローニングし、核または葉緑体ゲノムのいずれかに導入されて安定してトランスジェニック系統の開発である。そうすることで、外来DNAは、後続世代を遺伝になり、はるかに他の発現系¹のそれを超えて、途方もなく改善されたスケーラビリティを可能にします。核ゲノムへの外来DNAの導入は通常、組織⁹の微粒子銃によって、よりしばしば、植物組織のアグロバクテリウム·ツメファシエンスの感染によって達成されるか。植物ホルモンは、その後、根や葉などのトランスジェニック植物組織の分化と増殖を誘導するために使用される。葉緑体ゲノムの形質転換は、A.では達成できないツメファシエンスが、DNAでコーティングされた金またはタングステン粒子に完全に依存しては、植物細胞に弾道発射。再結合を表現する第二の方法植物中のntタンパク質は、一過性発現¹⁰を介してである。このシナリオでは、目的の遺伝子を保持するウイルス由来のベクターは、A.を介して配信されていアグロと呼ばれるプロセスを経て完全に開発された植物にツメファシエンス 。代わりに、植物ゲノムに統合することで、送達、遺伝子構築物は、短い潜伏期間の後に採取し、単離することができる所望のタンパク質の一時的な生産を指示し始める。植物はアグロ¹¹後約1〜2週間を収穫できるようになりますように一過性の遺伝子発現は、より大きな全体のタンパク質の蓄積だけでなく、タンパク質生産の改善、時間の利点を提供しています。これは、生成、選択、年に数ヶ月かかることが安定したトランスジェニック植物系統の確認、のプロセスよりもかなり高速です。それは遺伝的に安定植物リチウムが得られないのでしかし、これは、また、一過性発現系の制限です大規模な商業生産のための種子バンクを生成するために使用することができる別項。これにもかかわらず、アプローチは、大規模な一過性の発現を改善するために開発されてきた。ここでは、A.によって配信解体ウイルスベクターを用いた一過性タンパク質発現ベンサミアナタバコ植物の発生する1つの方法を示すツメファシエンス 。

二つの主要な方法がAの送達のために開発されている植物組織へのツメファシエンス ：真空チャンバを介して注射器や大規模溶浸を介してベンチスケールの浸潤。両方のプロトコルは、Nを使用してここで説明されている密接に共通のタバコ植物に関連しているベンサミ、、2つの蛍光タンパク質の一過性発現のための宿主植物として：クラゲオワンクラゲとDiscosomaサンゴ（DsRedを^）12,13から赤色蛍光タンパク質から緑色蛍光タンパク質（GFP）。 N. benthamianaのはのための最も一般的な宿主植物であるそれは遺伝的形質転換に従順であるため、組換えタンパク質は、急速にバイオマスを大量に産出し、スケールアップ生産¹⁴多作シードプロデューサーであることができます。 N.を使用することの別の利点タンパク質発現のための宿主としては、ベンサミ発現ベクター^2,5の様々な可用性である。本研究では、2解体ウイルスベクター、タバコモザイクウイルス（TMV）RNAレプリコンシステム（MagnICONベクトル）とBean黄色萎縮ウイルス（BeYDV）DNAレプリコン系（geminiviralベクトル^）4,11由来その他^、に基づくもの^15-18は 、GFPとDsRedの遺伝子を運ぶとNにそれらを提供するために使用されA.経由benthamianaの細胞ツメファシエンス。スリーDNA構築物は、GFPまたはMagnICONベクトルとDsRedの発現のために使用されます。彼らは、5 'プロモーターおよび標的遺伝子の発現を駆動するための他の遺伝要素を含むモジュール（pICH15879）、3'関心のある遺伝子（PICHを含むモジュールを含む-GFPまたはPICH-DsRedを）、およびインテグモジュール（pICH14011）は、式^8,15次第5 'および3'モジュールを一緒に統合する酵素をコードする。三DNA構築物はまた、geminiviralベクターで発現のために必要とされる。標的遺伝子（pBYGFP又はpBYDsRed）のレプリコンを含むベクターに加えて、複製タンパク質（pREP110）をコードするベクターは、標的レプリコン^11,14,16の増幅に必要とされる。また、トマト毛スタントウイルス由来のサイレンシング抑制P19をコードするベクターの包含は、高レベルの標的遺伝子発現^11,16が望まれる。

植物の成長、A.含むアグロによる植物細胞への組換えタンパク質の遺伝子を導入するための3つの手順は、一般にありツメファシエンス文化の準備、および浸潤。すべてのステップでは、それぞれの詳細な説明が提供され、したがって、この手順の最終的な成功のために重要であるように、シリンジ浸潤と下減圧浸潤の両方に。

プロトコル

1。植物成長

1. 伝播トレイに60泥炭ペレットを置きます。水道水4リットルを追加し、泥炭ペレットは2時間のために水を吸収することができます。
2. 2 Nを追加シーダーを使用して、各泥炭ペレットにbenthamianaの種子は、透明なプラスチックドームでトレイをカバーし、それらが8分の16時間の昼/夜サイクル（ 図1A）で25℃、84％湿度環境で発芽することができます。
3. 二週間播種後ドームを外し、トレイから水を排水し、1.48グラム/ L（ 図1B）の濃度でジャックの肥料の2 Lを追加します。 8分の16時間昼/夜サイクルは25℃、湿度50％の環境下で植物を成長を続けています。トレイあたり2日ごとにジャックの肥料の2 Lを供給してください。
4. 彼らは6週齢（ 図で浸透させることが準備が整うまで、4週では、更なる成長（ 図1C）のために十分なスペースを提供するために6工場をホストする新しいトレイに泥炭ペレット工場を移転1D）。

2。A.ツメファシエンス文化準備

シリンジ浸潤用2.1準備

1. ストリークA. geminiviralベクトルP19、pREP110、pBYGFP、およびカナマイシン（100μgの/ ml）を含有するLB寒天プレート上でpBYDsRedを含むツメファシエンス GV3101菌株。ストリーク1プレート当たりひずみと48時間30℃で成長する。
2. 同様に、筋や5のMagnICONベクトル宿すGV3101株 'モジュール（pICH15879）、3' LB寒天上にGFPあるいはDsRedを（PICH-GFPまたはPICH-DsRedを）、およびインテグ（pCH14011）の標的遺伝子を含むモジュールを育てるカルベニシリンを（は100μg/ ml）を含有するプレート。
3. LB寒天プレート上の単一のコロニーから、YENBメディア3mlの（0.75％バクトイーストエキス、0.8％栄養ブロスは、NaOHでpHを7.5に調整）+カナマイシン（100μgの/ ml）の中にgeminiviralベクトルを保有GV3101株を接種15ミリリットル丸底培養管、30℃で液体培養を成長°Cで300 rpmの回転速度で一晩振とう機。
4. 同様に、30℃で一晩振とう機に+カルベニシリン（100μg/mlの/ ml）を℃のYENBメディアにMagnICONベクトルを保有GV3101株を接種し、成長
5. 分光光度計で各液体培養のために測定し、記録OD ₆₀₀値は、適切な抗生物質でYENB培地10ml中の0.025の開始OD ₆₀₀と新しい文化のために継代培養することに必要な容積（V _サブ ） _を計算するには、以下の式を使用し。
   V _サブ （溶液）=（10ml）溶液×（0.025）/ OD ₆₀₀
6. 一晩培養の譲渡V _サブ （ML）（10 - V _サブ ）に各菌株に対する適切な抗生物質とYENBメディアのmlの。 OD ₆₀₀値が1.7から2.0の範囲内になるまで、250 rpmの回転速度で30℃で一晩新しい文化°シェーカーでCを育てる。
7. 測定し、それぞれの液体培養のためにOD ₆₀₀の値を記録し、計算値には、以下の式を使用し各株について0.12の最終的なOD _600を与えるために浸透バッファー50mlに希釈することが必要な容積（V _INF）を ulate。
   V _{infファイル} （溶液）=（50ミリリットル）×（0.12）/ OD ₆₀₀
8. 転送Vマイクロ遠心チューブに各培養の_{infファイル} （ml）と2分間12,000 xgで遠心分離して細胞をスピンダウンし、10mMのMES、pHは5.5（10ミリリットル浸潤バッファーに細胞を再懸濁後、上清を除去し、10mMの硫酸マグネシウム_4）簡単にボルテックスで。
9. 、pBYGFP + pREP110 + P19の再懸濁した細胞を混ぜて2分間12,000 xgで細胞をスピンダウンし、浸潤バッファー50mlの合計に懸濁します。このアグロバクテリウム組み合わせは、GFPのgeminiviral表現のためである。
10. 同様に、 アグロバクテリウム細胞の次の組み合わせを混ぜ、スピンダウンと浸潤バッファー50mlに再懸濁します。彼らは、（1）pBYDsRed + pREP110 DsRedのgeminiviralの表現、（2）pBYGFP + pBYDsRed + pREP110用+ P19GFPとDsRedを、（3）pREp110のgeminiviral共発現のための+ P19 + P19 geminiviral式のネガティブコントロールとして、（4）PICH-GFP + pICH15879 GFP、（5）PICH-DsRedをのMagnICON発現用+ pCH14011 + pICH15879 + DsRedを、（6）pICH15879のMagnICON発現のpCH14011 + pCH14011 MagnICON発現のネガティブコントロールとして。

減圧浸潤用2.2準備

1. 接種や文化それぞれGV3101 50ミリリットルオートクレーブフラスコ内の適切な抗生物質でYENBメディアの15ミリリットルにgeminiviralベクトルまたはMagnICONベクトルを含むひずみと成長は一晩、上記のシリンジ浸潤に関して説明。
2. 分光光度計、適切な抗生物質でYENBメディアの250ml中に0.025の開始OD ₆₀₀と新しい文化のために継代培養することに必要な容積（V _サブ ） _を計算するには、以下の式を使用して各液体培養のための測定と記録OD ₆₀₀値。
   V _サブ （溶液）=（250ml）中×（0.025）/ OD ₆₀₀
3. （250 - V _サブ ）に一晩培養の譲渡V _サブ （ml）を各株のための適切な抗生物質を1 Lオートクレーブフラスコ中YENBメディアmlの一夜上記シリンジ浸潤に関して説明新しい文化を育てる。
4. 測定し、それぞれの液体培養のためにOD ₆₀₀の値を記録し、各株に対して0.12の最終OD _600を与える浸透バッファ3Lに希釈されるために必要な容積（V _INF）を計算するには、以下の式を使用します。
   V _{infファイル} （ML）=（3000ミリリットル）×（0.12）/ OD ₆₀₀
5. ペレットと浸透バッファ内の各文化の再懸V _INF（ml）を注射器浸潤で説明し、シリンジ浸潤のため記載の組合せに応じて再懸濁培養液を混ぜると。 Repellet混合アグロバクテリウム細胞と浸潤バッファ3Lに、それらを再懸濁します。

3。浸潤

3.1シリンジ浸透

1. 4 6週齢のNを選択してください5葉それぞれにベンサミは植物。各工場の上から数えて最初の三つの葉はAの組み合わせのいずれかが完全に浸透されます浸透バッファ内の歪みをツメファシエンス 。第四の葉がgeminiviral式またはMagnICON式の3つのすべての組み合わせについてすべての4つの歪みの組み合わせでスポット浸透されます。各工場の最後の葉が陰性対照の組み合わせで浸透されます。
2. 葉の裏側（ 図2A）上の表皮に針で小さなニックネームを作成します。注意：浸潤混合物中のアグロバクテリウム細胞は葉の反対側に穿刺を通過するように、両側を通して葉貫通するように一生懸命傷つけないように注意してください。
3. 葉の表側をしっかりホールドを取り、穏やかかけながら片手の親指でニックにカウンター圧力が、針（ 図2B）なしシリンジでニックに浸透バッファ内のアグロバクテリウムの混合物を注入する。注： アグロバクテリウムの混合物は、葉の細胞間隙に入ると、浸潤領域（ 図2C）目に見えて暗く緑色に変わります。
4. 暗い緑色の円が拡大して止まるまでニックにアグロバクテリウム混合物を注入し続けています。全体の葉が浸透し、全体の葉は最初の三つの葉と最後の葉のために暗い緑色に点灯するまで、別のニックネームと繰り返し3.1.2-3.1.4を作成します。
5. 各工場の第四の葉は、4つのすべて（geminiviralベクトル）または3（MagnICONベクトル）の組み合わせは、それに浸透されます。 アグロバクテリウム株の組み合わせごとに1つのニックネームを作成し、1つの組み合わせで、各ニックネームに潜入。
6. 浸透した後、成長室とMONIに工場を戻すポスト浸潤（dpi）で2-15日の間にTorのタンパク質発現。

3.2減圧浸潤

1. 真空デシケーターと浴槽へのアグロバクテリウム株を含む振込3 L浸潤バッファに浴槽を置きます。 Vacuubrandダイヤフラム真空ポンプ（ 図3A）にデシケーターを接続します。
2. デシケータープレート（ 図3B）に逆さまに工場を置き、全体の葉や茎システムは浴槽の上に休んでいる板を浸透バッファに浸漬されるまで、植物とプレートを下げる。リムに沿ってデシケーターOリングを置き、室（ 図3C）のデシケーターのふたを置く。
3. 真空ポンプの電源を入れ、真空が100ミリバールに達したときにタイミングを開始します。ゆっくり沈んで植物組織の間質空間にアグロバクテリウムの入り口を可能にするために100ミリバールで1分後にデシケーターのリリースバルブを開きます。このステップを1 additiを繰り返し良い浸透を確保するためonal時間。
4. 浸透した後、デシケーターの植物を取り出し、その直立の位置に戻す。成長室とモニター2-15解像度間でのタンパク質発現に植物をバックに移動します。

4。蛍光タンパク質の検出と写真

1. 暗い部屋に2解像度、移動植物からの起動と手持ちのUVランプで浸潤葉の裏面にUV光を当てる。
2. GFPまたはDsRedのの赤色蛍光の緑色の蛍光を観察する。 DsRedのは、短波のUV光の下で強くなる一方GFPは、長波長のUV光で強い信号を放つ。
3. フラッシュなしとの定期的なデジタルカメラで蛍光葉の写真を撮る。
4. 観察や撮影後の成長部屋に植物をバックに移動します。

結果

1。シリンジ浸潤を蛍光タンパク質の発現

geminiviralとMagnICON - - N.二つの異なる解体植物ウイルスベクターによって- GFPとDsRedの-植物組織へのアグロバクテリウムのシリンジ浸潤の有効性を実証するため、我々は、2つの蛍光タンパク質の発現を試験したベンサミ 。 N.のために完全にアグロバクテリウムを含有geminiviralベクトル、GFPの発現と浸?...

ディスカッション

タンパク質ベースの医薬品の需要の増加は、世界的な堅牢でスケーラブルな、低コストかつ安全で新しい生産プラットフォームが必要です。植物は、医薬用タンパク質生産のための最も有望な代替的な生産システムのいずれかであることが示されている。近年では、解体ウイルスに基づくベクターの開発が大きく速度および植物発現系^2,10の収率を高める植物におけるタンパク質の一?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagents
GFP	Invitrogen	V353-20	www.invitrogen.com See reference: Lico and Chen, et al 2008
DsRed	Clontech	632152	www.clontech.com See reference: Baird and Zacharias, et al 2000
MagnICON Vector	Icon Genetics	n/a	www.icongenetics.com See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006
Geminiviral Vector	Author’s Lab	n/a	See reference: Chen and He, et al 2011
N. benthamiana	Author’s Lab	n/a	herbalistics.com.au
Agrobacterium tumefaciens strain gv3101	Author’s Lab	n/a	See reference: Lai and Chen 2012
LB Agar Carbenicillin-100, plates	Sigma	L0418	www.sigmaaldrich.com
LB Agar Kanamycin-50, plates	Sigma	L0543	www.sigmaaldrich.com
Magnesium sulfate hepa hydrate	Sigma	M2773-500 g	www.sigmaaldrich.com
Bacto-Tryptone	Fisher	73049-73-7	www.fishersci.com
Bacto Yeast Extract	Becton, Dickinson CO.	REF 212750	www.bd.com
Difco Nutrient Broth	Becton, Dickinson CO.	REF 234000	www.bd.com
MES hydrate Buffer	Sigma	M8250-1kg	www.sigmaaldrich.com
Carbenicillin	Sigma	C1613-1ML	www.sigmaaldrich.com
Kanamycin	Sigma	70560-51-9	www.sigmaaldrich.com
Sodium Hydroxide	Sigma	221465	www.sigmaaldrich.com
Jack’s Fertilizer	Hummert International	Jul-25	www.hummert.com
Equipment
Vacuubrand MD4 Vacuum Pump	Fisher	13-878-113	www.fishersci.com
Vacuum Air Regulator Valve	Fisher	NC9386590	www.fishersci.com
Desiccator 12 1/8" with O ring	Fisher	08-594-15C	www.fishersci.com
3 L Tub	Rubber-Maid	n/a	Rubbermaid Servn’ Saver Bowl, 10-cup will work
plate/shelf 230ML	Fisher	NC9489269	www.fishersci.com
Peat Pellet	Hummert International	14-2370-1	www.hummert.com
Propagation Tray Dome	hydrofarm	132052	www.hydroponics.net
Propagaiton Tray	hydrofarm	138758	www.hydroponics.net
Virbo Hand Seeder	Gro-Mor INC	n/a	www.gro-morent.com
Flora Cart 4 shelf	Hummert International	65-6924-1	www.hummert.com
15 ml Round Bottom Culture Tubes	Sigma	CLS430172-500EA	http://www.sigmaaldrich.com
Spectrophotometer	Bio-Rad	170-2525	www.bio-rad.com
Spectrophotometer Cuvettes	Bio-Rad	223-9950	www.bio-rad.com
Microcentrifuge Tubes	USA Scientific	1415-2500	www.usascientific.com
Benchtop Centrifuge	Bio-Rad	166-0602EDU	www.bio-rad.com
Incubator/Shaker	Eppendorf	Excella E25	www.eppendorf.com
Ultraviolet Light Model#: UVGL-25	UVP	95-0021-12	www.uvp.com