Agroinfiltration eficiente de plantas para alto nível de expressão transiente de proteínas recombinantes

Resumo

Plantas oferecer um novo sistema para a produção de proteínas farmacêuticas, em escala comercial, que é mais escalável e de custo eficaz e segura que paradigmas expressão corrente. Neste estudo, apresentamos uma abordagem simples e conveniente, mas escalável para introduzir genes alvo contendo Agrobacterium Em plantas para a expressão transiente da proteína.

Resumo

Cultura de células de mamífero é a plataforma principal para a produção comercial de vacinas humanas e proteínas terapêuticas. No entanto, ele não pode atender à crescente demanda mundial por produtos farmacêuticos, devido à sua escalabilidade limitada e de alto custo. As plantas têm demonstrado ser uma das plataformas de produção farmacêuticos alternativos mais promissores que são robustas, adaptar, de baixo custo e segura. O recente desenvolvimento de vectores baseados em vírus, permitiu a expressão transiente rápida e de alto nível de proteínas recombinantes em plantas. Para optimizar ainda mais a utilidade do sistema de expressão transitória, que demonstram uma metodologia simples, eficiente e de adaptar a introdução do gene alvo contendo de Agrobacterium para o tecido vegetal neste estudo. Os nossos resultados indicam que tanto a seringa agroinfiltration com vácuo e métodos têm como resultado a introdução eficiente de Agrobacterium em folhas e robusta de produção de duas proteínas fluorescentes; GFP e DsRed. Além disso,que demonstram as vantagens únicas oferecidas pelos dois métodos. Infiltração seringa é simples e não precisa de equipamentos caros. Ele também permite a flexibilidade, quer se infiltrar toda a licença com um gene alvo, ou a introdução de genes de múltiplos alvos em uma folha. Assim, ele pode ser usado para a expressão à escala laboratorial de proteínas recombinantes, bem como para a comparação de diferentes proteínas ou vectores para a cinética de produção ou expressão. A simplicidade de infiltração seringa também sugere a sua utilidade no ensino médio e educação superior para o tema da biotecnologia. Em contraste, a infiltração por vácuo é mais robusto e pode ser dimensionada e para produção comercial de proteínas farmacêuticas. Também apresenta a vantagem de ser capaz de agroinfiltrate espécies de plantas que não são passíveis de seringa infiltração tais como a alface e Arabidopsis. Em geral, a combinação de uma seringa e agroinfiltration vácuo fornece investigadores e formadores de uma simples, eficiente e robustametodologia para a expressão da proteína transiente. Vai facilitar muito o desenvolvimento de proteínas farmacêuticas e promover a educação científica.

Introdução

Desde os anos 1970, as plantas foram explorados como alternativas a culturas de células de mamíferos, insectos, bactérias e para a produção comercial de proteínas recombinantes e ^uma proteína terapêutica. Sistemas à base de plantas para a expressão de biofármacos têm se mostrado promissor nos últimos anos, vários novos tratamentos para doenças, como a doença de Gaucher ² e ³ da gripe aviária H5N1, têm demonstrado sucesso em ensaios clínicos. O desenvolvimento de mecanismos competentes para a expressão de proteínas recombinantes em plantas nas décadas desde os primeiros experimentos criou o potencial para sistemas à base de plantas para alterar o paradigma atual de produção de proteína por três razões principais. Em primeiro lugar, há uma diminuição notável do custo como bioreactores de mamíferos, insectos, bactérias e exigem custos consideráveis ​​de arranque, meios de cultura caros e processos complicados para a purificação a jusante ^4. A criação de planta transgênica estávellinhas também lhes permite superar a escalabilidade de outros sistemas de expressão como plantas que expressam proteínas poderiam ser cultivadas e colhidas em escala agrícola ^5. Em segundo lugar, os sistemas de expressão à base de plantas reduzem significativamente o risco de transmissão de um agente patogénico humano ou animal, a partir do hospedeiro que expressa a proteína para os seres humanos, demonstrando a superioridade em segurança pública ^6. Por fim, as plantas utilizam um sistema endomembranar eucariota que é semelhante à de células de mamífero, permitindo a correcta modificação pós-tradução, incluindo a glicosilação de proteínas e o conjunto de proteínas de várias subunidades ^7. Esta capacidade coloca sistemas baseados em plantas antes de aqueles baseados em sistemas procariotas, tais como bactérias, uma vez que um número maior de proteínas recombinantes farmacêuticos, incluindo os anticorpos monoclonais (mAbs), tem uma estrutura complicada e requer extensas modificações pós-tradução ou de montagem ^8.

Existem dois grandes adedores de expressar proteínas recombinantes em plantas. O primeiro é o desenvolvimento de uma linha transgénica de forma estável, onde o ADN que codifica para a proteína alvo é clonado em uma cassete de expressão e introduzido tanto o genoma nuclear ou do cloroplasto. Ao fazer isso, o DNA estranho se torna hereditário através de gerações sucessivas e permite tremendamente melhorado escalabilidade, além de outros sistemas de expressão ^1. A introdução de ADN exógeno no genoma nuclear é geralmente conseguido por infecção por Agrobacterium tumefaciens de tecido de planta ou, menos frequentemente, por bombardeamento de microprojécteis de tecido ^9. Hormonas de plantas são depois utilizados para induzir a diferenciação e o crescimento de tecido de planta transgénica como raízes e folhas. A transformação do genoma do cloroplasto não pode ser conseguido com A. tumefaciens, mas depende inteiramente de partículas de ouro ou tungstênio revestidas com DNA demitido balisticamente em células vegetais. O segundo método de expressar recombinaçãont proteína em plantas é através da expressão transitória ^10. Neste cenário, os vetores de vírus derivados abrigando o gene de interesse são entregues via A. tumefaciens para plantas totalmente desenvolvidas através de um processo chamado agroinfiltration. Em vez de integração no genoma da planta, a construção de gene entregue começará então a dirigir a produção transiente da proteína desejada, que pode ser colhida e isolado após um curto período de incubação. A expressão do gene transitório oferece a vantagem de uma maior acumulação de proteína total, bem como um tempo melhorado de produção de proteínas, como as plantas estarão prontas para a colheita, aproximadamente 1-2 semanas após agroinfiltration ^11. Isto é significativamente mais rápido do que os processos de produção, selecção e confirmação de linhas de plantas transgénicas estáveis, o que pode levar vários meses a um ano. Isto, no entanto, é também a limitação do sistema de expressão transitória, uma vez que não irá produzir geneticamente estável planta line que podem ser usados ​​para gerar um banco de sementes para a produção comercial em grande escala. Apesar disso, as abordagens têm sido desenvolvidos para melhorar a expressão transiente em larga escala. Aqui demonstramos um método de geração de proteínas expressam plantas de Nicotiana benthamiana transitórios utilizam vetores virais desconstruídas entregues pela A. tumefaciens.

Existem dois métodos principais estão a ser desenvolvidos para a entrega de A. tumefaciens em tecido vegetal: banco de infiltração escala via seringa e infiltração em larga escala via câmara de vácuo. Ambos os protocolos são descritos aqui, usando N. benthamiana, que está intimamente relacionada com a planta do tabaco comum, como a planta hospedeira para expressão transitória de duas proteínas fluorescentes: a proteína verde fluorescente (GFP) de água-viva Aequorea victoria ea proteína fluorescente vermelha de Discosoma coral (DsRed) ^12,13. N. benthamiana é a planta hospedeira mais comum paraproteína recombinante porque é susceptível à transformação genética, podem produzir quantidades elevadas de biomassa rapidamente, e é um produtor de sementes para a produção prolífica aumento de escala ^14. Outra vantagem do uso de N. benthamiana como hospedeiros para a expressão da proteína é a disponibilidade de uma variedade de vectores de expressão de ^2,5. Neste estudo, dois vetores virais desconstruídas, uma baseada em um vírus do mosaico do tabaco (TMV) RNA sistema replicon (vetores MagnICON) eo outro derivado do vírus anã amarela feijão (BeYDV) sistema replicon DNA (vetores geminiviral) ^{4,11, 15-18,} são usados ​​para transportar o gene GFP e DsRed e entregá-los em N. células benthamiana via A. tumefaciens. três construções de DNA serão utilizados para GFP ou com vectores de expressão DsRed MagnICON. Eles incluem "módulo (pICH15879) contendo o promotor e outros elementos genéticos para a condução da expressão do gene alvo, a 3 'do módulo 5 que contém o gene de interesse (Pich-GFP ou Pich-DsRed), e o módulo de integrase (pICH14011) que codifica para uma enzima que integra a 5 'e 3' módulos juntos após expressão ^8,15. Três construções de DNA também são necessários para a expressão com vetores geminiviral. Em adição a vectores que contêm o replicão do gene-alvo (ou pBYGFP pBYDsRed), um vector que codifica para a proteína de replicação (pREP110) é necessária para a amplificação do alvo replicão ^11,14,16. Além disso, a inclusão de um vector que codifica para o silenciamento p19 supressor de tomate espesso vírus duplos é desejado para a expressão do gene alvo de elevado nível de ^11,16.

Em geral, há três passos principais para a introdução de genes de proteínas recombinantes em células de plantas por agroinfiltration incluindo o crescimento das plantas, A. tumefaciens cultura de preparação, e a infiltração. Como cada passo é crítico para o sucesso final deste procedimento, por conseguinte, uma descrição detalhada de cada uma é fornecidatanto para a infiltração seringa e infiltração por vácuo abaixo.

Protocolo

1. O crescimento das plantas

1. Lugar de 60 de turfa pelotas em uma bandeja de propagação. Adicionar 4 L de água da torneira e deixar a turfa pelotas de absorver a água por 2 horas.
2. Adicionar 2 N. benthamiana sementes em cada pastilha de turfa utilizando um semeador, cobrir a bandeja com uma cúpula de plástico transparente, e permitir que elas germinam num ° C, 84% de humidade ambiente de 25 com um ciclo de dia / noite de 16/8 horas (Figura 1A).
3. Remover a cúpula de duas semanas após a sementeira, drenar a água da bandeja, e adicionar 2 L de fertilizante de Jack a uma concentração de 1,48 g / L (Figura 1B). Continuar a crescer as plantas numa ° C, 50% de humidade ambiente de 25 horas com um ciclo de dia / noite de 16/8. Fornecimento 2 L de fertilizante de Jack a cada 2 dias por bandeja.
4. Na semana 4, transferir as plantas com turfa peletes para uma nova bandeja que hospeda seis plantas para proporcionar um espaço adequado para o crescimento (Figura 1C) até que eles estão prontos para ser infiltrado com 6 semanas de idade (Figura1D).

2. A. tumefaciens Cultura Preparação

2.1 Preparação para a infiltração Seringa

1. Streak A. tumefaciens GV3101 estirpes contendo os vectores geminiviral p19, pREP110, pBYGFP pBYDsRed, e em placas de agar LB contendo canamicina (100 ng / ml). Causadas por uma estirpe de placa e crescer a 30 ° C durante 48 horas.
2. Da mesma forma, causadas e crescer estirpes GV3101 albergando os vectores MagnICON do 5 'do módulo (pICH15879), a 3' do módulo que contém o gene alvo de DsRed ou GFP (Pich-GFP ou Pich-DsRed) e da integrase (pCH14011) em LB agar placas contendo carbenicilina (100 ug / ml).
3. A partir de uma única colónia na placa de agar LB, inocular estirpes GV3101 abrigando vectores geminiviral em 3 ml de meio YENB (0,75% de extracto de levedura Bacto, 0,8% Nutrient Broth, ajustar o pH para 7,5 com NaOH) + canamicina (100 ng / ml) em um tubo ml de cultura de fundo redondo de 15, cultivar a cultura líquida, a 30 ° C emnum agitador durante a noite com uma taxa de rotação de 300 rpm.
4. Da mesma forma, e inocular crescer estirpes GV3101 abrigando vectores MagnICON em meios YENB + carbenicilina (100 ug / ml) num agitador durante a noite a 30 ° C.
5. OD valores medir e registrar ₆₀₀ para cada cultura líquido com um espectrofotômetro e utilizar a fórmula abaixo para calcular o volume necessário (V _sub) para ser repicadas para uma nova cultura com uma OD de partida ₆₀₀ de 0.025 em 10 ml de mídia YENB com os antibióticos apropriados .
   _Sub V (mL) = (10 ml) x (0,025) / OD ₆₀₀
6. Transferência V _sub (ml) da cultura durante a noite a (10 - _sub V) ml de meio YENB com os antibióticos apropriados para cada estirpe. Crescer a nova cultura durante a noite a 30 ° C num agitador com uma velocidade de rotação de 250 rpm, até o valor de DO ₆₀₀ está na gama de 1,7-2,0.
7. Meça e registre OD ₆₀₀ valores para cada cultura líquido e usar a fórmula abaixo para calcular o volume necessário (V _inf) para ser diluído em 50 ml de tampão de infiltração para se obter um OD final de ₆₀₀ de 0,12 para cada estirpe.
   _Inf V (mL) = (50 ml) x (0,12) / OD ₆₀₀
8. Transferência V _inf (ml) de cada cultura para um tubo de microcentrífuga e girar as células por centrifugação a 12.000 xg durante 2 minutos, em seguida, remover o sobrenadante e ressuspender as células em 10 ml de tampão de infiltração (MES 10 mM, pH 5,5; MgSO 10 mM ₄₎ em vortex brevemente.
9. Misturar as células ressuspensas de pBYGFP pREP110 + + p19, rodar para baixo as células a 12.000 xg durante 2 minutos, e ressuspender em total de 50 ml de tampão de infiltração. Esta combinação de Agrobacterium é geminiviral para expressão da GFP.
10. Do mesmo modo, misturar as seguintes combinações de células de Agrobacterium, girar e ressuspender-los em 50 ml de tampão de infiltração. Eles incluem: (1) pBYDsRed + pREP110 + p19 para a expressão geminiviral de DsRed, (2) pBYGFP + + pBYDsRed pREP110+ P19 geminiviral por co-expressão da GFP e DsRed, (3) pREp110 + p19 como controlo negativo de expressão geminiviral, (4) Pich-GFP + + pICH15879 pCH14011 MagnICON para a expressão de GFP, (5) Pich-DsRed + + pICH15879 pCH14011 para a expressão MagnICON de DsRed, e (6) pICH15879 + pCH14011 como controle negativo para a expressão MagnICON.

2.2 Preparação para a infiltração a vácuo

1. Após a inoculação, a cultura de cada estirpe GV3101 contendo vectores ou vectores geminiviral MagnICON em 15 ml de meio YENB com antibióticos apropriados em um frasco de 50 ml e autoclavado a crescer durante a noite como descrito acima para a seringa de infiltração.
2. OD valores medir e registrar ₆₀₀ para cada cultura líquido com um espectrofotômetro e utilizar a fórmula abaixo para calcular o volume necessário (V _sub) para ser repicadas para uma nova cultura com uma OD de partida ₆₀₀ de 0.025 em 250 ml de mídia YENB com os antibióticos apropriados .
   V _sub (Ml) = (250 ml) x (0,025) / OD ₆₀₀
3. Transferência V _sub (ml) da cultura durante a noite a (250 - V _sub) mL de meio YENB num balão de 1 L autoclavado com os antibióticos apropriados para cada estirpe e crescer uma nova cultura durante a noite como descrito acima, para a infiltração de seringa.
4. Medir e registar valores de OD ₆₀₀ de cada líquido de cultura e utilizar a seguinte fórmula para calcular o volume necessário (V _inf) para ser diluído em 3 L de tampão de infiltração para se obter um OD final de ₆₀₀ de 0,12 para cada estirpe.
   _Inf V (mL) = (3000 ml) x (0,12) / OD ₆₀₀
5. Ressuspender o sedimento e V _inf (ml) de cada cultura em tampão de infiltração, tal como descrito para a infiltração de seringa e misturar as culturas ressuspensas de acordo com as combinações descritas para a infiltração de uma seringa. Repellet Agrobacteria as células mistas e ressuspender-los em 3 L de tampão de infiltração.

3. Infiltração

3.1 Seringa Infiltração

1. Escolha quatro de 6 semanas de idade N. benthamiana plantas com folhas de 5 cada. As três primeiras folhas de contagem a partir do topo de cada planta vai ser infiltrada inteiramente com uma das combinações de A. tumefaciens estirpes em tampão de infiltração. A quarta folha será spot-infiltrada com todas as quatro combinações de tensão para a expressão geminiviral ou três combinações de expressão MagnICON. A última folha de cada planta será infiltrada com combinações de controles negativos.
2. Criar uma pequena incisão com uma agulha na epiderme, no lado de trás da folha (Figura 2A). Atenção: certifique-se de modo a não arranhar duro como para perfurar a folha através de ambos os lados, tal como as células de Agrobacterium na mistura infiltração irá passar através do furo para o outro lado da folha.
3. Tome um firme do lado da frente da folha e ao aplicar suavecontrapressão para o entalhe com o polegar de uma mão, injecta-se as misturas de Agrobacterium, em tampão de infiltração no entalhe com uma seringa sem agulha (Figura 2B). Nota: A mistura de Agrobacterium entra no espaço intercelular da folha, a área infiltrada ficará visivelmente mais escura verde (Figura 2C).
4. Continuar a injectar as misturas Agrobacterium no nick até que o círculo verde mais escuro pára de se expandir. Criar outro nick e repita os passos 3.1.2-3.1.4 até que toda a folha é infiltrada e toda a folha fica verde mais escuro para as três primeiras folhas ea última folha.
5. Para a quarta folha de cada planta, todas as combinações de quatro geminiviral (vector) ou três (MagnICON vector) serão infiltrados nela. Faça um nick para cada combinação de cepas de Agrobacterium, e se infiltrar cada nick com uma combinação.
6. Após a infiltração, mova plantas de volta para a sala de crescimento e moniexpressão da proteína tor entre 2-15 dias após a infiltração (dpi).

3.2 Vacuum Infiltração

1. Depositar uma banheira num exsicador de vácuo e de transferência 3 tampão de infiltração L contendo as estirpes de Agrobacterium para a banheira. Ligue o exsicador de vácuo a uma bomba de diafragma Vacuubrand (Figura 3A).
2. Coloque uma planta de cabeça para baixo sobre a placa exsicador (Figura 3B) e baixar a placa com a planta, até que todo o sistema de folha e caule é submerso no tampão de infiltração com a placa que descansam sobre a cuba. Coloque o secador O anel ao longo da borda e coloque a tampa do secador na câmara (Figura 3C).
3. Ligar a bomba de vácuo e iniciar a contagem, quando o vácuo atinge 100 mbar. Lentamente abrir a válvula de libertação no exsicador após 1 min a 100 mbar para permitir a entrada de Agrobacterium para dentro dos espaços intersticiais do tecido da planta submersa. Repita este passo um additional tempo para garantir uma boa infiltração.
4. Após infiltração, levar a planta para fora do secador e colocá-lo de volta à sua posição vertical. Mover as plantas de volta para a sala de crescimento e expressão da proteína do monitor entre 2-15 dpi.

4. Proteína fluorescente de detecção e Fotografia

1. A partir de 2 dpi, as plantas se movem em quarto escuro e brilhar a luz UV na parte de trás das folhas infiltradas com uma lâmpada UV de mão.
2. Observar a fluorescência verde de GFP ou a fluorescência vermelha de DsRed. GFP emite um sinal mais forte com o tempo de luz UV de ondas, enquanto DsRed é mais forte sob luz ultravioleta de onda curta.
3. Tire fotos de folhas fluorescentes com uma câmera digital comum, sem flash.
4. Mover as plantas de volta para a sala de crescimento após a observação ou fotografia.

Resultados

1. Expressão de proteínas fluorescentes por infiltração Seringa

Para demonstrar a eficácia da seringa infiltração de Agrobacterium para o tecido vegetal, testou-se a expressão das duas proteínas fluorescentes - GFP e DsRed - por dois vectores virais diferentes de plantas Desconstruído - geminiviral e MagnICON - em N. benthamiana. Para N. benthamiana folhas que foram completamente infiltrados com Agrobacteria geminiviral vectores contendo, a express?...

Discussão

A crescente demanda por produtos farmacêuticos à base de proteínas em todo o mundo exigem novas plataformas de produção que são robustas, escaláveis ​​e de baixo custo e segura. As plantas têm demonstrado ser um dos sistemas de produção alternativos mais promissores para a produção de proteínas farmacêuticas. Em anos recentes, o desenvolvimento de vectores baseados em Desconstruído vírus permitiu a expressão transitória de proteínas em plantas, o que aumenta grandemente a velocidade e o rendimento...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagents
GFP	Invitrogen	V353-20	www.invitrogen.com See reference: Lico and Chen, et al 2008
DsRed	Clontech	632152	www.clontech.com See reference: Baird and Zacharias, et al 2000
MagnICON Vector	Icon Genetics	n/a	www.icongenetics.com See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006
Geminiviral Vector	Author’s Lab	n/a	See reference: Chen and He, et al 2011
N. benthamiana	Author’s Lab	n/a	herbalistics.com.au
Agrobacterium tumefaciens strain gv3101	Author’s Lab	n/a	See reference: Lai and Chen 2012
LB Agar Carbenicillin-100, plates	Sigma	L0418	www.sigmaaldrich.com
LB Agar Kanamycin-50, plates	Sigma	L0543	www.sigmaaldrich.com
Magnesium sulfate hepa hydrate	Sigma	M2773-500 g	www.sigmaaldrich.com
Bacto-Tryptone	Fisher	73049-73-7	www.fishersci.com
Bacto Yeast Extract	Becton, Dickinson CO.	REF 212750	www.bd.com
Difco Nutrient Broth	Becton, Dickinson CO.	REF 234000	www.bd.com
MES hydrate Buffer	Sigma	M8250-1kg	www.sigmaaldrich.com
Carbenicillin	Sigma	C1613-1ML	www.sigmaaldrich.com
Kanamycin	Sigma	70560-51-9	www.sigmaaldrich.com
Sodium Hydroxide	Sigma	221465	www.sigmaaldrich.com
Jack’s Fertilizer	Hummert International	Jul-25	www.hummert.com
Equipment
Vacuubrand MD4 Vacuum Pump	Fisher	13-878-113	www.fishersci.com
Vacuum Air Regulator Valve	Fisher	NC9386590	www.fishersci.com
Desiccator 12 1/8" with O ring	Fisher	08-594-15C	www.fishersci.com
3 L Tub	Rubber-Maid	n/a	Rubbermaid Servn’ Saver Bowl, 10-cup will work
plate/shelf 230ML	Fisher	NC9489269	www.fishersci.com
Peat Pellet	Hummert International	14-2370-1	www.hummert.com
Propagation Tray Dome	hydrofarm	132052	www.hydroponics.net
Propagaiton Tray	hydrofarm	138758	www.hydroponics.net
Virbo Hand Seeder	Gro-Mor INC	n/a	www.gro-morent.com
Flora Cart 4 shelf	Hummert International	65-6924-1	www.hummert.com
15 ml Round Bottom Culture Tubes	Sigma	CLS430172-500EA	http://www.sigmaaldrich.com
Spectrophotometer	Bio-Rad	170-2525	www.bio-rad.com
Spectrophotometer Cuvettes	Bio-Rad	223-9950	www.bio-rad.com
Microcentrifuge Tubes	USA Scientific	1415-2500	www.usascientific.com
Benchtop Centrifuge	Bio-Rad	166-0602EDU	www.bio-rad.com
Incubator/Shaker	Eppendorf	Excella E25	www.eppendorf.com
Ultraviolet Light Model#: UVGL-25	UVP	95-0021-12	www.uvp.com