재조합 단백질의 높은 수준의 과도 발현 식물의 효율적인 Agroinfiltration

요약

식물은 현재의 표현 패러다임을보다 더 확장 가능한 비용 효율적이고 안전 상업적 규모에 제약 단백질의 생산을위한 새로운 시스템을 제공합니다. 본 연구에서는, 우리는 포함하는 대상 유전자를 소개하는 간단하고 편리하면서도 확장 가능한 접근 방법을보고 아그로 박테 리움 단백질의 과도 발현 식물에.

초록

포유류 세포 배양 인간 백신과 치료 단백질의 상업 생산을위한 주요 플랫폼입니다. 그러나, 제한된 확장 성 및 높은 비용으로 인해 의약품에 대한 증가하는 세계적 수요를 충족 할 수 없습니다. 식물은 강력하고, 확장 성, 저렴한 비용과 안전한 가장 유망한 대체 의약품 생산 플랫폼 중 하나가 될 것으로 나타났습니다. 바이러스 기반 벡터의 최근 발전은 식물에서 재조합 단백질의 신속하고 높은 수준의 일시적인 표현을 허용했다. 또한 과도 발현 시스템의 유틸리티를 최적화하기 위해, 우리는이 연구에서 식물 조직에 표적 유전자가 포함 아그로 박테 리움을 소개하는 간단하고 효율적이며 확장 가능한 방법을 보여줍니다. GFP와는 DsRed, 우리의 결과는 방법은 잎 두 형광 단백질의 강력한 생산에 아그로 박테 리움의 효율적인 도입에 성공 주사기, 진공 모두에 해당 agroinfiltration을 나타냅니다. 또한,우리는 두 가지 방법으로 제공하는 독특한 장점을 보여줍니다. 주사기 침투가 간단하고 고가의 장비를 필요로하지 않습니다. 또한 유연성 하나 표적 유전자의 전체 휴가를 침투하거나 하나의 잎에 여러 대상의 유전자를 도입 할 수 있습니다. 따라서,이 재조합 단백질의 실험실 규모의 발현뿐만 아니라 수확량 또는 식 속도론에 대해 서로 다른 단백질이나 벡터를 비교하는 데 사용할 수 있습니다. 주사기 침투의 단순함은 생명 공학의 주제에 대한 고등학교와 대학 교육의 실용성을 제안한다. 반면, 진공 침투는 더 강력하고 제약 단백질의 상업적 제조를위한 스케일 업 할 수 있습니다. 그것은 또한 양상추와 애기 장대와 같은 주사기 침투에 대한 의무가없는 식물 종을 agroinfiltrate 할 수 있다는 장점을 제공합니다. 전반적으로, 주사기 및 진공 agroinfiltration의 조합은 연구자와 교육자를 제공하는, 간단하고 효율적이며 강력한과도 단백질 발현을위한 방법론. 그것은 크게 제약 단백질의 개발을 촉진하고 과학 교육을 추진합니다.

서문

1970 년대 이후, 식물 재조합 단백질 및 단백질 치료제 ^1의 상업 생산을위한, 포유 동물 곤충 및 세균 세포 배양에 대한 대안으로 모색되고있다. 바이오 의약품의 표현을위한 식물 기반 시스템은 임상 시험에서 성공을 보여, 고셔병의 질병 ^2, 조류 H5N1 독감 ^3과 같은 질병에 대한 몇 가지 새로운 치료법으로 최근 몇 년 동안 약속을 보여 주었다. 이러한 초기 실험 이후 수십 년 동안 공장에서 재조합 단백질 발현 능력 메커니즘의 개발은 세 가지 주요 이유로 단백질 생산의 현재 패러다임을 변경하는 식물 기반 시스템의 가능성을 만들었습니다. 첫째, 포유류 곤충, 및 세균 바이오 리액터 상당한 초기 비용, 비싼 성장 매체와 하류 정화 ⁴ 복잡한 과정을 필요로 비용 주목할만한 감소가있다. 안정적인 형질 전환 식물의 생성라인은 또한 단백질 발현 식물이 재배 농업 규모 ^5에 수확 할 수로 다른 표현 시스템의 확장 성을 능가 할 수 있습니다. 둘째, 식물 기반의 발현 시스템은 크게 공공 안전 ⁶ 우수성을 보여주는, 인간 단백질 발현 호스트에서 사람 또는 동물 병원체 전송의 위험을 줄일 수 있습니다. 마지막으로, 식물은 당화와 여러 소단위 단백질 ^7의 조립을 포함한 단백질의 적절한 번역 후 수정을 허용하는, 포유 동물 세포와 유사한 진핵 endomembrane 시스템을 사용합니다. 이 기능은 더 복잡한 구조를 가지고 광범위한 전사 후 수정 또는 어셈블리 ^8가 필요 단클론 항체 (드을) 등의 제약 재조합 단백질의 넓은 수 있기 때문에, 박테리아와 같은 원핵 생물 시스템에 따라 그 앞두고 식물 기반 시스템을 넣습니다.

두 가지 주요 APPRO이 있습니다식물에서 재조합 단백질을 발현에 아파. 첫 번째는 대상 단백질 코딩 DNA가 발현 카세트에 복제 및 핵 또는 엽록체 게놈 중 하나에 도입 안정적으로 형질 전환 라인의 개발이다. 이 과정에서 외국의 DNA가 다음 세대를 통해 유전되고 지금까지 다른 발현 시스템 ^1을 넘어, 엄청난 확장 성이 향상 할 수 있습니다. 핵 게놈에 외래 DNA의 도입은 일반적으로 조직 ⁹ microprojectile 폭격에 의해, 덜 자주, 식물 조직의 아그로 박테 리움 감염에 의해 달성되거나. 식물 호르몬은 그 차별화와 뿌리와 잎 같은 형질 전환 식물 조직의 성장을 유도하는 데 사용됩니다. 엽록체 게놈의 변환은 A. 달성 할 수 없다 DNA로 코팅 박테 리움하지만, 금 또는 텅스텐 입자에 전적으로 의존 식물 세포로 탄도 발사. 재조합을 표현하는 두 번째 방법은식물 NT 단백질은 과도 표현을 통해 ^10입니다. 이 시나리오에서, 관심의 유전자를 품고 바이러스 유래 벡터는 A. 통해 전달됩니다 과정을 통해 완전히 개발 식물 박테 리움은 agroinfiltration을했다. 대신에 식물의 게놈에 통합으로, 전달 된 유전자 구조는 짧은 잠복기 후 수확하고 분리 할 수​​ 있습니다 원하는 단백질의 과도 생산을 지시하기 시작합니다. 식물 agroinfiltration ¹¹ 후 약 1-2 주를 수확 할 준비가 일시적인 유전자 발현은 큰 전체 단백질 축적뿐만 아니라 단백질의 생산 시간을 단축의 이점을 제공합니다. 이 1 년 몇 개월이 걸릴 수있는 안정적인 형질 전환 식물 라인의 생성, 선택 및 확인 프로세스보다 훨씬 빠릅니다. 이 유전자 안정적인 공장 리튬을 얻을하지 않으므로 그러나, 이것은 또한 일시적인 발현 시스템의 한계입니다대규모 상업 생산을위한 종자 은행을 생성 할 수 있습니다 NES. 그럼에도 불구하고, 접근 방식은 대규모의 일시적 발현을 개선하기 위해 개발되었습니다. 여기에서 우리는 A.에 의해 전달 해체 바이러스 벡터를 사용하여 과도 단백질 발현은 Nicotiana benthamiana 공장의 생성하는 한 가지 방법을 보여 박테 리움.

두 가지 주요 방법은 A.의 배달을 위해 개발되고있다 식물 조직에 박테 리움 : 진공 챔버를 통해 주사기와 대규모 침투를 통해 벤치 스케일 침투. 두 프로토콜은 N.를 사용하여 여기에 설명되어 있습니다 밀접 일반 담배 공장과 관련된 benthamiana, 두 형광 단백질의 과도 발현 기주 식물로 : 해파리 Aequorea 빅토리아 Discosoma 산호 (는 DsRed) ^12,13에서 붉은 형광 단백질의 녹색 형광 단백질 (GFP). N. benthamiana에 대한 가장 일반적인 호스트 식물그것은 유전자 변형 의무가 있기 때문에 재조합 단백질은 빠르게 바이오 매스의 높은 금액을 산출하고, 스케일 업 생산 ¹⁴ 다작 종자 생산자 수 있습니다. N. 사용의 또 다른 이점 단백질 발현을위한 호스트로 benthamiana는 발현 벡터 ^2.5의 다양한 가용성이다. 본 연구에서는 두 해체 바이러스 성 벡터, 담배 모자이크 바이러스 (TMV) RNA의 replicon 시스템 (MagnICON 벡터)와 빈 노란색 난쟁이 바이러스 (BeYDV) DNA의 replicon 시스템 (geminiviral 벡터) ^4,11에서 파생 된 ^다른 기준으로 한 ^15-18는 GFP와는 DsRed 유전자를 운반 N.에 그들을 제공하는 데 사용됩니다 A. 통해 benthamiana 세포 박테 리움. 세 DNA의 구조는 GFP 또는 MagnICON 벡터와는 DsRed 표현에 사용됩니다. 그들은 관심의 유전자를 포함하는 모듈 (PICH 5 '대상 유전자 3의 발현 운전 발기인 및 기타 유전 적 요소를 포함하는 모듈 (pICH15879)'을 포함- GFP 또는 PICH-는 DsRed) 및 integrase 모듈 (pICH14011)는 expression ^8,15에 5 '와 3'모듈을 함께를 통합하는 효소를 코딩. 세 DNA의 구조는 geminiviral 벡터를 표현 필요합니다. 표적 유전자 (pBYGFP 또는 pBYDsRed)의의 replicon를 포함하는 벡터뿐만 아니라, 복제 단백질 (pREP110)에 대한 코딩 벡터는 대상의 replicon ^11,14,16의 증폭이 필요합니다. 또한, 토마토 덤불 스턴트 바이러스에서 침묵 억압 P19 인코딩 벡터의 포함은 높은 수준의 목표 유전자의 발현 ^11,16 위해 원하는.

식물의 성장, A. 등 agroinfiltration에 의해 식물 세포에 재조합 단백질의 유전자의 도입을위한 세 가지 주요 단계는 일반적으로있다 박테 리움 문화 준비 및 침투. 각 단계마다이 절차의 궁극적 인 성공에 중요한이기 때문에, 따라서 자세한 설명이 제공됩니다주사기 침투 아래 진공 침투 모두.

프로토콜

1. 식물 성장

1. 전파 트레이에 위치 60 토탄 펠릿. 수돗물 4 L을 추가하고 토탄 펠릿 2 시간 동안 물을 흡수 할 수 있습니다.
2. 2 N. 추가 파종기를 사용하여 각 토탄 펠릿에 benthamiana 씨앗, 투명한 플라스틱 돔 트레이를 커버하고, 그들이 8분의 16 시간 일 / 1 박 사이클 (그림 1A)와 25 ° C, 84 % 습도 환경에서 발아 할 수 있습니다.
3. 2 주 파종 후 돔을 제거하고 트레이에서 물을 배수하고, 1.48 g / L (그림 1B)의 농도 잭의 비료 2 L을 추가합니다. 8분의 16 시간 일 / 밤주기 25 ° C, 습도 50 %의 환경에서 식물을 성장하는 것을 계속한다. 잭의 비료 2 L 트레이 당 2 일마다를 제공합니다.
4. 그들은 나이가 6 주 (그림에 침투 할 준비가 될 때까지 4 주에서 추가 성장 (그림 1C)에 대한 충분한 공간을 제공하는 6 개 발전소를 호스팅하는 새로운 트레이에 이탄 알약과 식물을 전송1D).

2. A. 박테 리움 문화 준비

주사기 침투 2.1 준비

1. 줄무늬 A. geminiviral 벡터 P19, pREP110, pBYGFP 및 카나마이신을 (100 ㎍ / ㎖)이 포함 된 LB 한천 플레이트에 pBYDsRed을 포함 박테 리움 균주 GV3101. 연속 한 판 당 변형 및 48 시간 동안 30 ° C에서 성장.
2. 마찬가지로, 줄무늬와 LB 한천에 GV3101 5 MagnICON 벡터 숨겨 변종 '모듈 (pICH15879)를, 3'GFP 나는 DsRed (PICH-GFP 또는 PICH-는 DsRed)의 표적 유전자를 포함하는 모듈 및 Integrase (pCH14011)을 성장 carbenicillin을 (100 ㎍ / ㎖)이 포함 된 접시.
3. LB 한천 플레이트에 하나의 식민지에서 YENB 미디어 3 ㎖ (0.75 % Bacto 효모 추출물, 0.8 % 영양소 국물, NaOH를 7.5로 산도를 조정)에 geminiviral 벡터를 품고 GV3101 균주를 접종 + 카나마이신 (100 ㎍ / ㎖)의 15 mL 둥근 바닥 문화 관, ° C에서 30 액체 문화를 성장300 RPM의 회전 속도와 하룻밤 셰이커.
4. 마찬가지로, 접종 30시 흔드는 하룻밤에 YENB 미디어 + carbenicillin (100 ㎍ / ml)에 MagnICON 벡터를 품고 GV3101 긴장 ° C. 성장
5. 분광 광도계 적절한 항생제로 YENB 미디어 10ml에 0.025의 시작 OD ₆₀₀ 새로운 문화에 대한 계대 배양 할 필요가 볼륨 (V _이하)를 계산하려면 아래 공식을 사용하여 각 액체 문화를 측정하고 기록한다 OD ₆₀₀ 값 .
   V _이하 (ML) = (10 ㎖) × (0.025) / OD ₆₀₀
6. 에 하룻밤 문화의 양도 V _이하 (ML) (10 - V _이하) 각 변형에 대한 적절한 항생제 YENB 미디어 ML. 새로운 문화 30 하룻밤 250 RPM의 회전 속도와 셰이커 ° C OD ₆₀₀ 값이 1.7-2.0의 범위가 될 때까지. 성장
7. 측정하고 기록 OD 각각의 액체 배양 ₆₀₀ 값을 계산기에 아래 수식을 사용각 변형에 대해 0.12의 최종 OD _600을 제공하기 위해 침투 버퍼의 50 ML에 희석 할 필요 체적 (V _INF)을 ulate.
   V _INF (ML) = (50 ML) × (0.12) / OD ₆₀₀
8. 전송 V microcentrifuge 관에 각 문화의 _INF (ML)과 2 분 12,000 XG에서 원심 분리하여 세포를 스핀 뜨는 제거하고 (10 MM MES, 산도 5.5 10 ML 침투 버퍼에 세포를 resuspend을, 10 mM의 황산 마그네슘 ₄₎ 잠시 텍싱 있습니다.
9. 혼합 pBYGFP + pREP110 + P19의 세포를 재 부유, 2 분 12,000 XG에서 세포를 스핀 다운, 그리고 침투 버퍼의 50 ML의 총에 resuspend을. 이 Agrobacteria 조합은 GFP의 geminiviral 표현입니다.
10. 마찬가지로, Agrobacteria 세포의 다음과 같은 조합을 혼합 스핀 다운 및 침투 버퍼의 50 ML에서 그들을 resuspend을. 그들은 다음을 포함한다 (1) pBYDsRed + pREP110는 DsRed의 geminiviral 표현, (2) pBYGFP + pBYDsRed + pREP110에 대한 + P19GFP와는 DsRed, (3) pREp110 GFP의 MagnICON 식 (5)에 대한 geminiviral 식의 부정적인 컨트롤과 + P19, (4) PICH-GFP + pICH15879 + pCH14011 PICH -는 DsRed + pICH15879는 +의 공동 발현 geminiviral위한 + P19 MagnICON의는 DsRed의 표현, 그리고 MagnICON 식에 대한 대조군으로 (6) pICH15879 + pCH14011에 대한 pCH14011.

진공 침투 2.2 준비

1. 접종과 문화 각 GV3101 50 ML 멸균 플라스크에 적절한 항생제로 YENB 미디어의 15 ML에 geminiviral 벡터 또는 MagnICON 벡터를 포함하는 변형과 성장은 하룻밤 위의 주사기 침투에 대해 설명했다.
2. 분광 광도계 적절한 항생제로 YENB 미디어 250 ㎖에 0.025의 시작 OD ₆₀₀ 새로운 문화에 대한 계대 배양 할 필요가 볼륨 (V _이하)를 계산하려면 아래 공식을 사용하여 각 액체 문화를 측정하고 기록한다 OD ₆₀₀ 값 .
   V _이하 (ML) = (250 ML) × (0.025) / OD ₆₀₀
3. 전송 V의 하룻밤 문화의 _하위 (ML) (250 - V _이하) 각 변형에 대한 적절한 항생제로 1 L 멸균 플라스크에 YENB 미디어의 ML과 하룻밤 위의 주사기 침투에 대해 설명 된 새로운 문화를 성장.
4. 측정하고 기록 OD 각각의 액체 배양 ₆₀₀ 값을 각 변형에 대해 0.12의 최종 OD _600을 제공하기 위해 침투 버퍼의 3 L에 희석 할 필요 체적 (V _INF)를 계산하려면 아래 공식을 사용합니다.
   V _INF (ML) = (3000 ML) × (0.12) / OD ₆₀₀
5. 펠렛 및 주사기 침투에 대한 설명과 주사기 침투에 대해 설명 된 조합에 따라 재 부유 문화를 혼합으로 침투 버퍼에있는 각 문화를 Resuspend V _INF (ML). Repellet 혼합 Agrobacteria 세포 침투 버퍼의 3 L에서 그들을 resuspend을.

3. 침투

3.1 주사기 침투

1. 네 6 주 이전 N. 선택 5와 benthamiana 공장은 각각의 잎. 각 공장의 상단부터 시작하는 처음 세 개의 잎은 A.의 조합 중 하나에 완전히 침투 될 것입니다 침투 버퍼의 변종을 박테 리움. 네 번째 잎이 될 것입니다 스포트 침투 geminiviral 표현을위한 네 가지 변형 조합 또는 MagnICON 식에 대한 세 가지 조합. 각 공장의 마지막 잎 부정적인 컨트롤의 조합으로 침투 될 것입니다.
2. 잎의 뒷면 (그림 2A)의 표피에 바늘로 작은 흠을 만듭니다. 주의 : 침투 혼합물 Agrobacteria 세포가 잎의 다른 측면에 구멍을 통과하므로, 양쪽을 통해 잎 관통하는만큼 열심히 긁히지 않도록해야합니다.
3. 잎의 앞면의 확고한 보류를 가지고 부드러운 적용하는 동안한 손의 엄지 손가락 닉 반대 압력, 니들 (그림 2B)이없는 주사기 닉에 침투 버퍼에있는 아그로 박테 리움 혼합물을 주입. 참고 : 아그로 박테 리움 혼합물 잎의 세포 사이 공간을 입력으로 침투 영역 (그림 2C) 눈에 띄게 어두운 녹색으로 바뀔 것이다.
4. 어두운 녹색 원이 확장 멈출 때까지 별명으로 아그로 박테 리움 혼합물을 주입하는 것을 계속한다. 전체 잎이 침투하고 전체 잎의 처음 세 잎 마지막 잎에는 짙은 녹색으로 점등 될 때까지 또 다른 별명 단계를 반복 3.1.2-3.1.4을 만듭니다.
5. 각 공장의 네 번째 잎의 경우, 모든 4 개 (geminiviral 벡터) 또는 세 (MagnICON 벡터) 조합은 그것으로 침투 될 것입니다. 아그로 박테 리움 균주의 각 조합에 대해 하나의 별명을 만들고, 하나의 조합으로 각 닉에 침투.
6. 침투 한 후, 성장 방 모니 식물을 다시 이동2-15일 포스트 침투 수 (dpi) 간의 토르 단백질 발현.

3.2 진공 침투

1. 진공 건조기와 욕조에 아그로 박테 리움 균주를 포함하는 전송 3 L 침투 버퍼에 욕조를 배치합니다. Vacuubrand 다이아 프램 진공 펌프 (그림 3A)을 데시 케이 터에 연결합니다.
2. 데시 케이 터 플레이트 (그림 3B)에 거꾸로 공장을 배치하고 전체 잎과 줄기 시스템은 욕조의 꼭대기 휴식 플레이트 침투 버퍼에 빠져들 때까지 식물로 판을 낮 춥니 다. 가장자리를 따라 데시 케이 O 링을 배치하고 챔버 (그림 3C)에 데시 케이 터의 뚜껑을 넣어.
3. 진공 펌프를 켜고 진공 100 밀리바에 도달 할 때 타이밍을 시작합니다. 천천히 물속에 잠긴 식물 조직의 틈새 공간에 Agrobacteria의 입학을 허용하는 100 mbar에 1 분 후 데시 케이 터에서 방출 밸브를 엽니 다. 이 단계를 한 책상 외에도 반복좋은 침투을 보장하기 위해 각형 시간입니다.
4. 침투 한 후, 데시 케이 터의 공장을 가지고 그 직립 위치에 다시 넣어. 2-15 dpi로 간 성장 방 모니터 단백질 발현에 식물을 다시 이동합니다.

4. 형광 단백질의 검출 및 사진

1. 어두운 방에 dpi로, 이동 공장 2에서 시작하여 소형 UV 램프로 침투 잎의 뒷면에 UV 빛을.
2. GFP 나는 DsRed의 붉은 형광 녹색 형광을 관찰한다. 는 DsRed는 단파 UV 빛의 밑에 강한 반면 GFP는 장파 자외선에 강한 신호를 제공합니다.
3. 아니 플래시 일반 디지털 카메라로 형광 잎의 사진을 가져 가라.
4. 관찰 또는 촬영 후 성장 방에 식물을 다시 이동합니다.

결과

1. 주사기 침투에 의한 형광 단백질의 발현

geminiviral 및 MagnICON - - N.의 두 가지 해체 식물 바이러스 벡터에 의해 - GFP와는 DsRed - 식물 조직에 아그로 박테 리움의 주사기 침투의 효과를 입증하기 위해, 우리는 두 개의 형광 단백질의 발현을 테스트 benthamiana. N.위한 전체 Agrobacteria 포함 geminiviral 벡터로 침투했다 benthamiana 잎, GFP 발현은 빠르면 2와 d...

토론

단백질 기반의 의약품에 대한 증가하는 요구는 전 세계적으로 강력하고, 확장 성, 저렴한 비용과 안전한 새로운 생산 플랫폼을 필요로합니다. 식물은 제약 단백질 생산을위한 가장 유망한 대체 생산 시스템 중 하나가 될 것으로 나타났습니다. 최근 몇 년 동안, 해체 바이러스 기반 벡터의 개발은 크게 속도와 식물 발현 시스템 ^2,10의 수율을 향상 식물에서 단백질의 일시적인 표현을 사용?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagents
GFP	Invitrogen	V353-20	www.invitrogen.com See reference: Lico and Chen, et al 2008
DsRed	Clontech	632152	www.clontech.com See reference: Baird and Zacharias, et al 2000
MagnICON Vector	Icon Genetics	n/a	www.icongenetics.com See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006
Geminiviral Vector	Author’s Lab	n/a	See reference: Chen and He, et al 2011
N. benthamiana	Author’s Lab	n/a	herbalistics.com.au
Agrobacterium tumefaciens strain gv3101	Author’s Lab	n/a	See reference: Lai and Chen 2012
LB Agar Carbenicillin-100, plates	Sigma	L0418	www.sigmaaldrich.com
LB Agar Kanamycin-50, plates	Sigma	L0543	www.sigmaaldrich.com
Magnesium sulfate hepa hydrate	Sigma	M2773-500 g	www.sigmaaldrich.com
Bacto-Tryptone	Fisher	73049-73-7	www.fishersci.com
Bacto Yeast Extract	Becton, Dickinson CO.	REF 212750	www.bd.com
Difco Nutrient Broth	Becton, Dickinson CO.	REF 234000	www.bd.com
MES hydrate Buffer	Sigma	M8250-1kg	www.sigmaaldrich.com
Carbenicillin	Sigma	C1613-1ML	www.sigmaaldrich.com
Kanamycin	Sigma	70560-51-9	www.sigmaaldrich.com
Sodium Hydroxide	Sigma	221465	www.sigmaaldrich.com
Jack’s Fertilizer	Hummert International	Jul-25	www.hummert.com
Equipment
Vacuubrand MD4 Vacuum Pump	Fisher	13-878-113	www.fishersci.com
Vacuum Air Regulator Valve	Fisher	NC9386590	www.fishersci.com
Desiccator 12 1/8" with O ring	Fisher	08-594-15C	www.fishersci.com
3 L Tub	Rubber-Maid	n/a	Rubbermaid Servn’ Saver Bowl, 10-cup will work
plate/shelf 230ML	Fisher	NC9489269	www.fishersci.com
Peat Pellet	Hummert International	14-2370-1	www.hummert.com
Propagation Tray Dome	hydrofarm	132052	www.hydroponics.net
Propagaiton Tray	hydrofarm	138758	www.hydroponics.net
Virbo Hand Seeder	Gro-Mor INC	n/a	www.gro-morent.com
Flora Cart 4 shelf	Hummert International	65-6924-1	www.hummert.com
15 ml Round Bottom Culture Tubes	Sigma	CLS430172-500EA	http://www.sigmaaldrich.com
Spectrophotometer	Bio-Rad	170-2525	www.bio-rad.com
Spectrophotometer Cuvettes	Bio-Rad	223-9950	www.bio-rad.com
Microcentrifuge Tubes	USA Scientific	1415-2500	www.usascientific.com
Benchtop Centrifuge	Bio-Rad	166-0602EDU	www.bio-rad.com
Incubator/Shaker	Eppendorf	Excella E25	www.eppendorf.com
Ultraviolet Light Model#: UVGL-25	UVP	95-0021-12	www.uvp.com