在面部移植<em&gt;非洲爪蟾</em&gt;胚胎

摘要

的技术移栽“至尊前域” 非洲爪蟾的面巾纸蟾胚胎已经研制成功。组织可以从一个基因表达的背景被转移到另一个，允许对颅面发展和信令面部区域之间的相互作用当地要求的研究。

摘要

颅面先天缺陷发生在1每700出来的活产婴儿，但病因却很少，由于颅面部发育的了解有限知。以识别其中的显影脸的图案形成过程中信号转导途径和组织行动，一个“脸移植”技术已发展中的青蛙非洲爪蟾胚胎。推定面巾纸（在“至尊前域”（EAD））的区域从供体胚胎tailbud阶段取出，并移植到同一个舞台主机胚胎，从中相当于区域已被删除。这可以用于产生嵌合面的主机或供体组织具有在基因中的损耗或增益函数，和/或包括一个谱系标签。愈合后，发展的结果进行监测，并表示捐赠者或周围的宿主组织内的信号转导通路的作用。 非洲爪蟾是面对发展的宝贵的典范，作为面部区域很大，随手一ccessible的显微操作。许多胚胎可以检测，在很短的时间内开发以来迅速发生。青蛙发现是有关人的发展，因为颅面过程出现爪蟾和哺乳动物之间的保守性。

引言

要了解颅面发育过程中相关颅面先天缺陷^1-2，重要组织和他们的贡献的信令机制必须进行标识。在青蛙非洲爪蟾中，面部的一部分，包括口腔和鼻孔形式从“极端前域”（EAD），其中外胚层和内胚层直接并置^3-4。在EAD也作为一个信令中心来影响周围的组织，包括颅神经嵴，形成钳口和其他面部区域^5。识别基因，有助于EAD功能，一个“脸移植”技术被开发，其中组织从供体移植到宿主胚胎，除去对应主机区域之后。继移植，导致面部发育评估。因此，功能丧失（LOF）或功能（GOF）中的EAD特定基因增益的效果的局部分析，其中的h时休息EAD和身体是由野生型的组织。的倒数可移植的执行，其中野生型组织被移植到与全局LOF或GOF中的胚胎特异性基因。移植已被经常使用在非洲爪蟾和小鸡研究^6。例如， 非洲爪蟾移植已经解决了纯合神经诱导，镜头和神经的能力，和神经嵴迁移^7-10。鹌鹑鸡嵌合体移植术分析了前神经板，前神经嵴，神经嵴和颅骨^11-14的发展。这是在非洲爪蟾颅面部发育的研究第一次移植技术，该技术已经证明了的Wnt抑制剂Frzb1和红新月会在推定口⁵调节基底膜形成了一种新的作用。 非洲爪蟾是颅面部发育的研究的理想模型因为胚胎是大的，发展对外，一个ND面对的是随时可见，让显微和发展成像。机制相关的面部发育出现保守，表明在青蛙作出裁断洞察人类发展^4,15-16。

研究方案

1。试剂的准备

1. 10X MBS：准备1升10倍的改进巴特的盐水（MBS）的解决方案^17。参照表1，试剂，成分，和指令。用蒸馏水所有的解决方案。混在烧杯中，用搅拌棒，直到充分溶解。所有溶液应在室温下进行。
2. 1X MBS：稀释于900ml蒸馏水百毫升10倍的MBS解决方案，使1升1X的MBS。加0.7毫升的1M的CaCl ₂溶液。
3. 0.1倍MBS：稀释1X MBS准备1升的0.5倍的MBS解决方案和2升0.1倍的MBS解决方案。以1升的0.1倍的MBS解决方案，加入1毫升10毫克/毫升庆大霉素溶液。与庆大霉素的0.1倍的MBS解决方案将用于长期的胚胎培养。
4. 聚蔗糖/ MBS：添加15克聚蔗糖400至500ml 0.5倍的MBS解决方案。充分混合。添加搅拌棒和搅拌，直到聚蔗糖完全溶解（几个小时）。
5. 70％乙醇：用稀释的100％乙醇70％乙醇蒸馏水。

2。玻璃的准备工作工具

1. 针制剂：加载毛细管进针车夫。
   1. 拉将根据表2所示的设置的织针：针拔出器的设置。该设置是一个萨特仪器有限公司型号P-80/PC微量拉马和毛细管管材，作为特定的试剂和设备的表中描述。但是，这些设置是特定于萨特针车夫，并需要进行调整，其他机器。设置可以使用一个斜坡测试来确定，具体由机床制造商。
   2. 在筹备过程拉4-6针。针应该被打破，使得玻璃尖端的柔性，毛发状部被完全除去，这通常是2-3毫米长。尖端必须是相对刚性的，但仍然足够窄以被用作切割工具。见照片图1A理想的针。
   3. 存储针在培养皿用粘土下来的中心带。按每一针的轴成泥，拿着它在的地方，以保持脆弱的锐利尖端离底部和两侧。
2. 对于额外的工具，获得玻璃盖玻片，一对长标准模式镊子，本生灯，和3-4的玻璃巴斯德吸液管（大小5¾英寸）。
3. 吸管工具：为了使吸移管工具，点燃本生灯和玻璃巴斯德吸管的尖端放置到火焰的蓝色部分 ，同时旋转它，使得该尖端熔化和孔完全密封，形成一个封闭的圆形端。圆形，密封尖稍后用于使凹陷的粘土菜，在操作过程中保持胚胎。 见图1B。
4. 玻璃桥：为了使玻璃桥，用一个较长的标准模式由镊子盖玻片玻璃3毫米大块仔细折断3毫米。按住一块盖玻片用吨weezers，将玻璃中的火焰，直到所有四个边缘软化和曲线向下，形成一个微小的玻璃圆顶。边缘应该不再是尖锐的。参见图1C。
5. 通过将它们存储在玻璃盖片的桥梁，边缘向下放入橡皮泥，衬培养皿的底部。插入的桥梁，使得桥的顶部保持在粘土表面的上方。不要用力过猛，使得桥梁断裂，并不能完全嵌入桥进入粘土，因为它可以是很难去除。灭菌用火焰或70％乙醇后，将桥可以从实验中重复使用试验。

3。准备胚胎操作

1. A线小60毫米塑料培养皿橡皮泥。使用之间，盘子和粘土表面用蒸馏水彻底洗涤，然后用70％的乙醇。
   注：使用红色，白色或黄色，凡阿肯Plastalina橡皮泥，可以在当地被买走y或艺术品商店。黑粘土不建议，因为它释放残余物。
2. 用3％聚蔗糖0.5倍的MBS解决方案，填补了菜。较高浓度的盐可以防止组织离解，并且该多糖的Ficoll有助于增稠溶液，这有助于保持面中的位置。
3. 用火烧巴斯德吸管工具（ 见图1），以使浅2-3毫米的凹陷中的粘土，约20阶段胚胎体的深度。做20-30洼地，1-2 mm处，上的菜的每一面，所以总共有40-60洼地是。标签一侧LOF / GOF，和另一侧的野生型，通过雕刻字母与镊子的粘土。

4。术前准备胚胎

1. 获得文化非洲爪蟾使用标准方法¹⁷胚胎。青蛙养殖的详细说明，请参见西伯等 ¹⁷
   1. 四十八小时在实验前要想获取从雌蛙卵和体外受精执行。
   2. 注入0.5-1纳克的封膜的GFP表达，以及任何所需的基因或反义吗啉代修饰的反义寡核苷酸（“吗啉”）在一个细胞阶段或成2细胞在2细胞期。一个细胞阶段持续约70-90分钟。注入的1-3 NL的总体积。在这里的RNA编码荧光蛋白（如GFP或RFP的RNA）的，可以注入FITC标记的吗啉代或荧光标记的葡聚糖。荧光是用于确定是否移植的组织愈合，并保持在头部重要。
   3. 封顶的mRNA可以从使用​​mMessage mMachine SP6或T7试剂盒的线性质粒准备。吗啉代可以被设计，并通过基因Tools公司订购。所需的所希望的效果吗啉的用量必须为每一个基因¹⁸来确定。
   4. 存储注射的胚胎在15℃下进行48小时，直到它们达到19-20级。 （F或所有后续步骤，根据非洲爪蟾由Nieuwkoop和法贝尔¹⁹的普通表阶段的胚胎。）
      注意：在手术当天，受援国和捐助国的胚胎必须在对方的一个阶段的移植以最佳状态工作。然而，胚胎注射吗啉（“morphants”）有时发展比野生型更慢或控制morphant胚胎，进行必要的协调实验，把它所以无论morphant和野生型胚胎是在同一个舞台。 Morphants可能需要被维持在较高的温度下12-24小时前的程序。以增加的胚胎可以在匹配阶段发现的可能性，胚胎可以保持在不同温度。实验前二十四小时，应该划分胚胎成几盘，放morphants在18-20℃和野生型的胚胎在15-18°C。
2. 在移植实验中，REM的一天从the15℃培养箱奥雅纳胚胎，并根据Nieuwkoop和法贝尔¹⁹阶段他们。如果他们是年龄小于神经胚后期（19级），让它们在室温下放置1-2小时，直到他们达到阶段19。
3. 屏幕的荧光显微镜下注射的胚胎。选择显示均匀，明亮荧光的实验胚胎。
4. 除去杂波和可能的污染物的经​​营面积近。擦拭下来的操作表面，体视显微镜和所有的工具，用70％的乙醇。
5. 一旦胚胎正处于阶段19，删除使用＃45分之5杜蒙钳在立体显微镜下卵黄膜。
   1. 除去各捐助者和东道国胚胎20-30卵黄膜。
   2. 这是第几个脸移植实验，应该练了几个胚胎每个条件。该方法是有挑战性的，需要小心实践它可用于较大规模之前，快速和成功。一个可以工作üp到20做移植/实验。
6. 移动主机的胚胎成使用塑料的操作盘刻度移液管的尖端切断，使得开口比胚胎（至少几个毫米）宽得多。要小心，避免触及胚胎气泡或水面，因为胚胎会在表面张力的爆炸。
7. 使用＃四十五分之五钳子插入胚胎成粘土凹陷，与胚胎中的粘土后部。轻轻关闭周围使用镊子胚胎的基础粘土，留下胚胎的前25％，头部，从抑郁症突出。
8. 一旦所有的主机胚胎固定在其洼地，移动到板的另一侧，并开始将供体胚胎到他们的洼地。重复固定在其孔中的胚胎的过程。

5。进行面部移植手术

1. 割刀：作为切割刀去除捐助EAD组织，使用适当碎玻璃毛细管针（见步骤2.3和图1）。
   注意：一个可以直接持有的手指之间的毛细管（这适用于用小手的人），或者可以安装在针昆虫针固定器。加载到针保持器Electrosharpened钨针¹⁷可以被用来代替毛细管针。请参阅特定的试剂和设备的表中提出销户，钨针。
2. 在立体显微镜下，将针入胚胎的头部到水泥腺的左侧。针应深深插入时，使得它从胚胎外的推移，通过磁头，并进入前肠。移植整个EAD，削减应该从胚胎外延伸到前肠。对于外胚层只移植，削减应该是浅和扩展只能通过外胚层。
   1. 从左侧轻弹针向右侧的头，穿过水泥腺的整个宽度。轻弹是重要的，因为运动给人以干净的切割。参阅图2A的技术和图2B所示的切口的一个示范的概要。水泥腺体和眼睛都为削减重要的地标。切口的顺序不会影响结果，并且可以根据用户的偏好或螺旋性而有所不同。
3. 将针在上切割的起点，在水泥腺的左边框，并且向上轻弹针，直到它到达左眼的底部。这会创建一个从水泥腺的左侧边界的垂直切到左眼的底部。
4. 将针在水泥腺的右边界，并且向上轻弹针，直到它到达右眼的底部。这会创建一个从水泥腺的右边界的垂直切到右眼的底部。
5. 为了充分切除组织，弗力ķ从左眼到右眼的底部的底部针，创建一个横向切，将释放组织。切口可从胚胎的外侧延伸到前肠，包括外胚层和内胚层中的EAD植体。另外，浅切，可用于外胚层只EAD移植。一旦EAD组织被去除，应该有一个矩形孔从胚胎的外进入前肠，从水泥腺拉伸到刚好在眼睛（从上到下）所示。这个洞应该从左眼内侧边界延伸到右眼（边到边）的内部边框。参见图2BB。
6. 轻推针的尖切除的组织，并通过缓冲抬起它包含主机胚胎的菜的一部分。请勿将组织暴露在表面的空气，否则将被损坏。
7. 由宿主胚切除相同的组织，作为供体。丢弃主机EAD外植体或将其保存到插入背板t代入供体的脸，因为相互移植。
8. 将供体植进用＃45分之5钳造成主机孔。
9. 一旦供体组织的位置正确，并完全插入，小心地将玻璃桥（ 见图1和图2BC）对胚胎的脸持有的移植到位。桥的两端应插入到粘土，拿着它到位。这座桥应该轻轻地施加压力，移植的组织，使得移植在于主机头平齐，没有它伸出的头部或深的头内躺着。头部可以通过盖玻片被稍扁平，但要小心，不要损坏胚胎有太大的压力。移植应在5分钟内完成。
   注：一个有经验的调查员可以为每个实验进行约二十移植，过2-3小时。在此期间，将胚胎从阶段20-22进步。完成了面部移植手术在21级或22 s不影响结果。后移植（在阶段22-26）可以做到，但更难以作为波峰 - 自由EAD中线区域变窄为颅神经嵴移动到脸上。整个移植的一致性是至关重要的。

6。脸部移植手术后恢复

1. 治疗通常需要2-3个小时。离开胚胎在室温下不受干扰地在他们的粘土洼地与玻璃桥控股供体组织到位。
2. 一旦移植治好了，小心取出玻璃桥，从各地使用镊子胚胎的底部去掉泥土，并用塑料刻度移液管轻轻真空胚胎他们的洼地。
3. 把胚胎成适当标记的培养皿中，一半充满了干净的0.1倍MBS与庆大霉素。
4. 成长的胚胎在15℃或18℃下了好几天，直到他们达到在40期喂养蝌蚪阶段，W母鸡面部表型可以得分。
   1. 与庆大霉素的0.1倍的MBS溶液应每天更换，任何死胚应及时清除，以防止污染其他胚胎的死亡。
   2. 口开在阶段40。在40-41阶段，必须检查移植的组织仍然未愈的地方通过查看它的荧光。移植偶尔掉下来，所以必须确保所有打进胚胎有供体组织到位。

结果

移植组织应完全插入主机头移植后， 如图3A所示，并有一个玻璃桥适当地放置在胎儿的脸， 如图2BC。移植的供体组织必须正确尺寸为主机开放，为移植成功。在EAD组织不应从头部伸出，以任何方式，如在图3B和3C所示。此外，表面移植不应转动相对于其在供体身体的位置， 如图3D。几个小时后，将移植的组织与周围面应该愈合，并且?...

讨论

关键步骤和限制：EAD换脸程序的时间和密集的工作。它需要实践，稳定的双手，灵巧和完善。换脸协议依赖于研究人员的能力，有效地去除和移植组织。如果时间过长插入移植到宿主的脸，主机脸会开始收缩和愈合。镊子可以用来微妙地扩大面部区域。然而，如果已经发生显著伤口收缩，移植不会愈合，以及与可能需要减小尺寸，以适应宿主的面部孔。移植的尺寸和形状必须大致相匹配的?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pasteur pipette	VWR	14672-400	Lime Glass
Size 5 3/4 in	Cotton Plugged
Graduated Transfer Pipette	VWR	16001-180	Disposable
#5/45 forceps	Fine Science Tools by Dupont medical	11251-35	Angled 45°
Standard Pattern Forceps	Fine Science Tools	11000-20	Straight; serrated tip; stainless steel
Capillary Tubing (for needles)	FHC	30-30-1	Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID/Fiber
Cover slip	VWR	48393 252	24 x 60 mm micro cover glass;
Ficoll 400	Sigma-Aldrich	F9378
Needle Puller	Sutter Instrument Co	Needle Puller: discontinued Filament: FB300B	The most similar, currently available  needle puller is the P-97. For filaments, use Sutter 3.00 mm square box filaments, 3.0 mm wide.
Model P-80	Flaming / Brown micropipette puller
Stereomicroscope	Zeiss
Stereomicroscope Lighting by Fostec	Fostec		Use a light box with 2 fiberoptic arms.
Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26018-17	Jaw Opening Diameter: 0-1 mm
Moria Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26016-12	Jaw opening Diameter: 0-1 mm
Tungsten Needles	Fine Science Tools	10130-05	0.125 mm Rod diameter
Van Aken Plastalina	Blick	#33268-2981
Modeling Clay- white, red, or yellow
mMessage mMashine SP6 or T7 Kit	Ambion	AM1340