Yüz Nakli<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embriyolar

Özet

Xenopus arasında yüz doku "Extreme Anterior Etki" nakli için bir tekniktir embriyolar geliştirilmiştir laevis'den. Doku kraniofasial gelişimi için ve yüz bölgeleri arasındaki etkileşimleri sinyalizasyon için yerel gereksinimleri çalışma izin, başka içine bir gen ekspresyon kökenli taşınmış olabilir.

Özet

Doğumsal kusurları 1 700 her canlı doğumda bir görülür, ancak etyolojisi nadiren nedeniyle kraniofasiyal gelişme sınırlı anlayış bilinmektedir. Sinyal yolları ve dokular gelişen yüzün desenleme sırasında hareket nerede olduğunu belirlemek için, bir 'yüz nakli' tekniği kurbağa Xenopus laevis embriyoların geliştirilmiştir. Olası yüz kağıt ürün ("Extreme Ön Alan" (EAD)) ihtiva eden bir bölge tailbud aşamada bir verici embriyo kaldırılır ve eşdeğer bölgesi kaldırıldı ki aynı aşaması bir dizi embriyo, transplante edilir. Bu, bir ana bilgisayar veya donor dokusu, bir gende bir kayıp ya da fonksiyon kazancı ve / veya bir soy etiket içeren bir kimerik bir yüz oluşturmak için de kullanılabilir. Yüz bölgesi kolayca büyük ve gibi şifa sonra, gelişme sonuç izlenen ve vericiden veya çevredeki konak dokularının içindeki sinyal yolunun rollerini işaret edilir. Ksenopus, yüz gelişimi için değerli bir model birmikromanipülasyon için ccessible. Geliştirme hızla meydana geldiği çoğu embriyolar, kısa bir süre boyunca, tahlil edilebilir. Kraniofasial süreçler Xenopus ve memeliler arasında korunmuş görünen bu yana kurbağa bulguları, insan gelişimi ile ilgili bulunmaktadır.

Giriş

Kraniyofasiyal gelişimi sırasında doğumsal kusurları ^1-2, önemli dokuları ve onların sinyal katkılarını altında yatan mekanizmaları anlamak için tespit edilmelidir. Kurbağa Xenopus laevis, ektoderm ve endoderm doğrudan ^3-4 yan yana olan "Extreme Anterior Domain" (EAD), gelen ağız ve burun delikleri formu dahil olmak üzere yüzün bir parçası olarak. EAD ayrıca çene ve diğer yüz bölgelerini oluşturan ⁵ kranial nöral, dahil çevredeki dokuları etkilemek için bir sinyal merkezi olarak görür. Doku gelen konak bölgeyi çıkardıktan sonra, bir ev sahibi embriyo bir donörden nakledilen nerede EAD işlevine katkıda genleri tanımlamak için, bir 'yüz nakli' tekniği geliştirildi. Nakilden sonra, yüz gelişme elde değerlendirilir. Böylece, fonksiyon kaybı (LOF) ya da EAD belirli bir genin fonksiyonu (GOF) kazancı etkisi, yerel olarak incelendiğinde burada h geri kalanıead ve vücut vahşi tip dokusu oluşur. Vahşi tip dokuya özgü gen, küresel LOFveya GOF olan embriyoların içine nakledilen olduğu karşılıklı nakli, gerçekleştirilebilir. Transplantasyon sık Xenopus'ta kullanılan ve civciv ⁶ inceler. Örneğin, Ksenopus nakli homogenetic nöral indüksiyon, lens ve nöral yetkinlik ve nöral krest göç ^7-10 ele almıştır. Bıldırcın-civciv kimerik aşılama anterior nöral plaka, anterior nöral sırt, nöral ve kafatası kemikleri ^11-14 gelişimini analiz etti. Bu Xenopus kraniofasiyal geliştirme çalışması için ilk nakil tekniktir. Bu teknik olası ağız ⁵ bazal membran oluşumunu düzenleyen Wnt önleyicileri Frzb1 ve Crescent için yeni bir rolü olduğunu göstermiştir. Xenopus laevis kraniofasiyal geliştirme çalışması için ideal bir model embriyo büyük olarak, harici bir geliştirmend yüz sağlayan, kolayca görülebilir mikromanipülasyon ve gelişim görüntüleme. Yüz gelişimini yatan mekanizmalar kurbağa yapılan bulgular, insan gelişiminin ^4,15-16 içgörü sağlamak olduğunu belirten, korunmuş görünür.

Protokol

1.. Hazırlanması Reaktifler

1. 10x MBS: Barth Salin (MBS) solüsyonu ¹⁷ Modifiye 10x 1 L hazırlayın. Tablo 1, Kimyasalları, malzemeler ve talimatlarına bakın. Tüm çözümler için distile su kullanın. Tam çözünme gerçekleşene kadar, bir karıştırma çubuğu kullanılarak, bir cam kapta karıştırılır. Bütün çözeltiler, oda sıcaklığında yapılmalıdır.
2. 1x MBS: 1x MBS 1 L için damıtılmış su içinde 900 ml 10x MBS çözeltisi 100 ml seyreltin. 1 M _CaCl2 çözeltisi 0.7 ml ilave edilir.
3. 0.1x MBS: İnceltilmiş 1x MBS 0.5x MBS çözeltisi 1 L ve 0.1x MBS çözeltisi 2 L hazırlamak. 0.1x MBS çözelti 1 L için, 10 mg / ml gentamisin solüsyonun 1 ml. Gentamisin ile 0.1x MBS çözelti, uzun süreli embriyo kültürü için kullanılacaktır.
4. Ficoll / MBS: 0.5x MBS çözeltisi 500 ml Ficoll 400 15 gram ekleyin. Kuvvetlice karıştırın. Bir karıştırma çubuğu ilave edin ve tam olarak Ficoll (birkaç saat) eriyene kadar karıştırılır.
5. % 70 etanol:% 70 etanol kullanılarak% 100 etanol ile seyreltilirdistile su.

2. Cam Çalışma Araçlar hazırlanması

1. İğne hazırlama: Bir iğne çektirmenin yükleyin kılcal boru.
   1. İğne çektirmesi ayarları: Tablo 2'de gösterilen ayarlara göre iğne çekin. Özel reaktifler ve ekipman Tablo açıklandığı gibi ayarları bir Sutter Instrument Co Model P-80/PC mikropipet çektirmesi ve kılcal borulama için vardır. Ancak, bu ayarlar Sutter iğne çektirmenin özgüdür ve diğer makineler için ayarlanması gerekir. Makinenin üretici tarafından belirtildiği gibi ayarlar, bir rampa testi kullanılarak belirlenebilir.
   2. Prosedür için hazırlık 4-6 iğneler çekin. İğneler, tipik olarak 2-3 mm uzunluğunda olan, cam ucunun esnek, saç benzeri kısım tamamen çıkarılır şekilde kesilmesi gerekmektedir. Ucu, nispeten sert, ancak bir kesme aracı olarak kullanılmak üzere hala yeterince dar olmalıdır. Şekil 1A ideal iğne fotoğrafa bakın.
   3. Merkezine doğru bir kil şeritli bir Petri kabındaki iğneler saklayın. , Kil içine her iğne mili basın yerde tutmak ve uzak alt ve yanlardan kırılgan keskin ucunu tutmak için.
2. Ek araçlar için, uzun standart desen forseps, bir Bunsen beki, ve 3-4 cam Pasteur pipetler (Boyut 5 ¾) bir çift cam kapak fişleri edinin.
3. Pipet aracı: Bir pipet aracı yapmak için, Bunsen beki ışık ve ucu erir ve delik tamamen mühürler, kapalı, yuvarlak ucunu oluşturan, öyle ki, onu dönerken alev mavi parçası haline bir cam Pasteur pipet ucu yerleştirin . Yuvarlak, kapalı uç, daha sonra işlem sırasında embriyolar tutan kil çanak depresyonlar yapmak için kullanılır. Şekil 1B bakınız.
4. Cam köprüler:, cam köprüler yapmak dikkatlice kapak kayma cam 3 mm parçalar 3 mm kopmak uzun standart desen forseps kullanın. T kapak kayma parçasını tutarkenDört kenarlar aşağıya yumuşatmak ve eğri kadar weezers, küçük bir cam kubbe oluşturan, alev içinde cam yerleştirin. Kenarları artık keskin olmalıdır. Şekil 1C bakın.
5. Onları takarak cam kapak kayma köprüleri depolamak, bir Petri kabı alt astar, modelleme kil, aşağı kenarları. Köprünün üst toprak yüzeyi üzerinde kalacak şekilde köprüler yerleştirin. Çıkarmak zor olabilir, çünkü köprü sonları ve tamamen kil köprü embed yok bu çok zor gibi itmeyin. Bir alev veya% 70 etanol ile Sterilizasyon sonrasında, köprüler deneme deney tekrar edilebilir.

3. Embriyo Operasyon için hazırlık

1. Modelleme kil ile küçük 60 mm plastik Petri hattı. Kullanımlar arasında, bulaşık ve kil yüzey damıtılmış su ile iyice yıkandı ve daha sonra% 70 etanol ile edilmektedir.
   NOT: kullan, kırmızı, beyaz ya da sarı, yerel bir satın alınabilir Van Aken Plastalina kil modelleme,y ya da sanat mağaza. Bir bültenleri kalıntısı nedeniyle siyah kil tavsiye edilmez.
2. % 3 Ficoll 0.5x MBS çözeltisi ile çanak doldurun. Daha yüksek tuz konsantrasyonu, doku ayrışmayı önler, ve polisakarit Ficoll pozisyonda yüz tutan yardımcı çözelti, kalınlaştırmak için yardımcı olur.
3. Bir sahne 20 embriyo vücudunun derinliği hakkında, kil sığ, 2-3 mm depresyonlar yapmak için yakılmış Pasteur pipet aracını (bkz. Şekil 1) kullanın. Çanak her iki tarafında, yanı sıra 20-30 depresyon, 1-2 mm olun, yani 40-60 çöküntü toplam vardır. Forseps ile kilin içine harfleri oyarak, bir tarafı LOF / GOF, ve diğer yan yabani tip etiketleyin.

4. Hastaların ameliyattan Embriyo Hazırlık

1. Elde ve kültür Ksenopus standart yöntemler kullanılarak ¹⁷ embriyolar laevis'den. Kurbağa yetiştiriciliği ayrıntılı bir açıklaması için, Sive vd. ^{17'ye bakınız} lütfen
   1. Önce deneme obta için kırk sekiz saatdişi kurbağa yumurta ve in vitro fertilizasyon gerçekleştirin.
   2. Bir hücre aşamasında veya 2 hücreli aşamada 2 hücrelerine 0,5-1 başlıklı membran GFP mRNA'nın ng, ayrıca istenen herhangi bir mRNA veya anti-sens morfolino-tadil edilmiş antisens oligonükleotidler ("morpholinos") enjekte edilir. Bir hücre aşamasında, yaklaşık 70-90 dakika sürer. 1-3 nl bir toplam hacim enjekte edilir. (Örneğin GFP veya RFP RNA gibi) bir flüoresan protein için RNA kodlama bölgesinin yerine, bir FITC etiketli morfolino veya floresan ile etiketlenmiş dekstran enjekte edebilir. Floresan doku nakli iyileşir ve baş kalır olup olmadığını belirlemek için çok önemlidir.
   3. Kapaklı bir mRNA mMessage mMachine SP6 ya da T7 kiti kullanılarak bir doğrusallaştırılmış plasmid hazırlanabilir. Morpholinos tasarlanmış ve Gen Araçlar LLC aracılığıyla sipariş edilebilir. Arzu edilen etki için gerekli morfolino miktarı, her gen için ¹⁸ tespit edilmelidir.
   4. Bu aşamaya gelene kadar, 19-20, 48 saat boyunca 15 ° C 'de enjekte edilen embriyolar saklayın. (Fya da sonraki tüm adımlar, sahne embriyolar Nieuwkoop ve Faber ¹⁹ Xenopus Laevis'den olan Normal tabloya göre.)
      NOT: Ameliyat gününde, her ikisi de bir alıcı ve verici embriyolar nakli en iyi şekilde çalışması için, diğer bir aşamada içinde olmalıdır. Bununla birlikte, morpholinos ("morphants"), enjekte edilmiş embriyolar, bazen daha yavaş yabani tür daha geliştirmek veya kontrol morphant embriyolar, bu morphant ve yabani tip embriyolar her ikisi de aynı aşamada gerekli deneyler koordine etmek adrestir. Morphants önce edilen prosedüre, 12-24 saat boyunca daha yüksek bir sıcaklıkta muhafaza edilmesi gerekebilir. Embriyolar eşleşen aşamalarında bulunabilir olasılığını arttırmak için, embriyolar çeşitli sıcaklıklarda muhafaza edilebilir. Deneyden önceki yirmi dört saat, bir 15-18 ° C'de 18-20 ° C ve yabani tip embriyoların bir kaç yemekler, yer ve morphants içine embriyolar bölmek gerekir
2. Transplantasyon deney, REM gününde15'ten ° C inkübatör embriyolar ove ve Nieuwkoop ve Faber ¹⁹ göre onları sahneye. Onlar geç neurula (evre 19) daha genç iseler aşamasına 19 gelinceye kadar, 1-2 saat oda sıcaklığında bekletin.
3. Bir flüoresan mikroskop altında enjekte edilen embriyolar Screen. Deney için üniforma, parlak floresan göstermek embriyolar seçin.
4. Çalışma alanının yakınında yığılmayı ve olası kirleri çıkarmak. % 70 etanol ile çalışma yüzeyi, Stereomikroskopta ve tüm araçlar aşağı silin.
5. Embriyolar aşamada 19 indiğinizde, bir stereo mikroskop altında # 5/45 Dumont forseps kullanarak vitellin membran kaldırmak.
   1. Donör ve alıcı embriyoların her birinin 20-30 vitellin membran çıkarın.
   2. İlk birkaç yüz nakli deneyleri için, tek bir, her durum için bir kaç embriyo ile uygulama gerekir. Yöntem, zor ve hızlı ve başarılı bir şekilde, daha büyük bir ölçekte kullanılabilecek önce dikkatli bir uygulama gerektirir. Bir u çalışabilir/ deneme 20 nakli yapıyor p.
6. Bir plastik kullanarak işletim çanak içine host embriyolar hareket açıklığı bir embriyo (en azından birkaç milimetre) daha geniş olacak şekilde kesilmiş ucu ile transfer pipet mezun oldu. Embriyolar yüzey gerilim patlayacak gibi, kabarcıklar veya su yüzeyine embriyolar dokunmamak için dikkatli olun.
7. Kil embriyonun posterior, kil çöküntü içine embriyolar eklemek için # 5/45 forseps kullanın. Yavaşça depresyon çıkıntılı, embriyonun üst çeyrek, kafa bırakarak forseps kullanılarak embriyonun bazlar etrafında kil kapatın.
8. Tüm ana embriyoların çöküntüler içinde sabitlendikten sonra, plakanın diğer tarafına taşımak ve girintiler içine verici embriyolar eklemek başlar. Kendi kuyularda embriyolar güvence işlemi tekrarlayın.

5. Yüz Nakli Cerrahisi Sahne

1. Bıçak Kesme: kaldırılması için bir kesme bıçağı olarakdonör EAD doku, uygun bir şekilde kırık cam kılcal iğne (adım 2.3 ve bkz. Şekil 1) kullanın.
   NOT: Bir doğrudan parmakları arasında kılcal (bu küçük elleri olan insanlar için iyi çalışır) ya da bir bir böcek pim tutucu iğne monte edebilirsiniz tutabilir. Bir iğne tutucu içine yüklenen Electrosharpened tungsten iğneler ¹⁷ yerine bir kılcal tüp iğnenin kullanılabilmektedir. Belirli Reaktifler ve Ekipmanları Tablo önerilen pin sahipleri ve tungsten iğneler bakın.
2. Bir stereomikroskop altında, çimento bezinin solundaki embriyonun kafası içine iğne takın. Bu kafa ile, embriyo dışından geçer ve ön bağırsağa böylece iğne, derin olarak yerleştirilen olmalıdır. Tüm EAD nakli için, kesik foregut için embriyonun dışarıdan uzanmalıdır. Ektoderm sadece nakli için, kesikler sığ olmalı ve sadece ektoderm boyunca uzanır.
   1. Sağ tarafına soldan iğne Flickçimento bezinin tüm genişliği boyunca, baş. Hareket temiz bir kesim verir gibi vuruşunu önemlidir. Kesim bir gösteri için teknik ve Şekil 2B bir özeti için Şekil 2A bakın. Çimento bezi ve gözleri kesimler için önemli yerler vardır. Kesim sırası sonucu etkilemez ve kullanıcının tercihine veya ellilik bağlı olarak değişebilir.
3. Çimento bezinin sol sınırında, bir önceki kesme başında iğne yerleştirin ve sol gözün alt ulaşana kadar yukarıya doğru iğneyi fiske. Bu, sol gözün alt çimento bezinin sol sınır dikey parçasını oluşturur.
4. Çimento bezinin sağ sınırında iğne yerleştirin ve sağ gözün alt ulaşana kadar yukarıya doğru iğneyi fiske. Bu, sağ göz altına çimento bezinin sağ sınır dikey parçasını oluşturur.
5. Tam olarak doku, Flic tüketim içindoku serbest bir yatay kesim oluşturarak, sağ göz alt sol gözün tabanından iğne k. Keser EAD eksplant olarak ektoderm ve endoderm dahil olmak üzere, foregut için embriyonun dışarıdan uzanabilir. Alternatif olarak, sığ kesik ektoderm okunur EAD nakli için de kullanılabilir. EAD doku çıkarıldığında, çimento bezinden uzanan, ön bağırsağa embriyonun dışarıdan dikdörtgen bir delik olmalıdır için sadece bir gözde (yukarıdan aşağıya) altında. Delik sağ göz (yan yana) iç sınırına sol gözünün iç sınırına kadar uzanmalıdır. Şekil 2BB bakın.
6. Nazikçe iğnenin ucunda kesilmiş doku itin ve host embriyolar içeren çanak kısmına tampon aracılığıyla kaldırın. Yüzey havaya doku maruz bırakmayın ya da hasar görecektir.
7. Donör için olduğu gibi, ev sahibi embriyo aynı doku tüketim. Konak EAD eksplant atın veya yerleştirilmek kaydedinkarşılıklı nakli için, donör yüzüne t.
8. # 5/45 forseps kullanılarak elde edilen konak deliğe donör eksplant yerleştirin.
9. Donör doku doğru yerleştirildiğinden ve tam olarak takıldığında, dikkatle yerine nakli tutmak için embriyonun yüzünde (Şekil 1 ve Şekil 2BC bakınız) bir cam köprü yerleştirin. Köprünün uçları yerde tutarak, kil içine girmelisiniz. Köprü hafifçe nakli o kafası dışarı yapışmasını veya derin başının içinde yatan olmadan, ev sahibi kafası ile aynı hizada olacak şekilde nakledilen doku, basınç uygulamak gerekir. Baş hafifçe kapak kayma tarafından basık, ama çok fazla baskı ile embriyonun zarar vermemek için dikkatli olmak olabilir. Nakli 5 dakika içinde yapılmalıdır.
   NOT: Deneyimli bir araştırmacı, 2-3 saat boyunca, deney başına yaklaşık yirmi nakli gerçekleştirebilmektedir. Bu dönemde embriyolar aşamada 20-22 ilerleme olacaktır. Yüz nakli Tamamlanıyoraşamada 21 veya 22 s at sonuçlarını etkilemez. (Aşamalarında 22-26 at) sonradan nakli yapılan ancak kret-serbest EAD orta hat bölge yüzüne kranial nöral krest hamle olarak daralmış gibi daha zor olabilir. Nakilleri genelinde tutarlılık önemlidir.

6. Yüz Nakli Sonrası operasyon Kurtarma

1. Şifa genellikle 2-3 saat sürer. Cam köprü yerinde tutan verici doku ile kil çöküntüler içinde rahatsız oda sıcaklığında embriyolar bırakın.
2. Nakli iyileşmiş sonra, dikkatli, cam köprüleri kaldırmak forseps kullanarak embriyoların tabanı etrafında kil çıkarın ve bir plastik nazikçe depresyonların dışında embriyoların vakum transfer pipet mezun kullanın.
3. Yarım gentamisin temiz 0.1x MBS ile dolu etiketli uygun bir Petri kabı içine embriyolar koydu.
4. Bu w, aşama aşama 40 larva besleme gelene kadar, birkaç gün boyunca 15 ° C ya da 18 ° C 'de embriyolar büyümektavuk yüz fenotipleri attı olabilir.
   1. Gentamisin 0.1x MBS Çözelti günlük değiştirilmesi gerektiğini ve herhangi bir ölü embriyolar diğer embriyoları kirlenmesini ve ölümü önlemek için derhal kaldırılmalıdır.
   2. Ağız aşamada 40 açılır. Aşamada 40-41 anda, biri nakledilen doku flüoresanını görüntüleyerek yerinde iyileşmiş kalmasını kontrol etmelisiniz. Nakilleri bazen düşebilir, bu yüzden bir bütün attı embriyolar yerine donör doku emin olmalısınız.

Sonuçlar

Şekil 2BC gösterildiği gibi nakledilen doku tamamen, Şekil 3A'da gösterildiği gibi, nakil sonrası ana kafa içine sokulur ve uygun bir embriyonun yüzüne yerleştirilen bir cam köprü sahip olmalıdır. Nakli başarılı olmak için nakledilen donör dokusu düzgün, ev sahibi açılması için ölçekli gerekir. Şekil 3B ve 3C'de görüldüğü gibi, EAD doku, herhangi bir şekilde, baş kısmından itibaren çıkıntı olmamalıdır....

Tartışmalar

Kritik Adımlar ve Sınırlamalar: EAD yüz nakli işlem süresi ve yoğun çalışır. Bu mükemmel uygulama, sürekli elleri ve maharet gerektirir. Yüz nakli protokol verimli kaldırmak ve nakli doku için araştırmacının becerisine dayanır. Bir konağın yüzüne nakli eklemek için çok uzun sürerse, konak yüz sözleşme ve iyileştirmeye başlayacak. Forseps ince yüz bölgesini genişletmek için kullanılabilir. Önemli yara daralma oluştu Ancak, nakli de iyileşme olmaz ve konağın yüz deliğe s...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pasteur pipette	VWR	14672-400	Lime Glass
Size 5 3/4 in	Cotton Plugged
Graduated Transfer Pipette	VWR	16001-180	Disposable
#5/45 forceps	Fine Science Tools by Dupont medical	11251-35	Angled 45°
Standard Pattern Forceps	Fine Science Tools	11000-20	Straight; serrated tip; stainless steel
Capillary Tubing (for needles)	FHC	30-30-1	Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID/Fiber
Cover slip	VWR	48393 252	24 x 60 mm micro cover glass;
Ficoll 400	Sigma-Aldrich	F9378
Needle Puller	Sutter Instrument Co	Needle Puller: discontinued Filament: FB300B	The most similar, currently available  needle puller is the P-97. For filaments, use Sutter 3.00 mm square box filaments, 3.0 mm wide.
Model P-80	Flaming / Brown micropipette puller
Stereomicroscope	Zeiss
Stereomicroscope Lighting by Fostec	Fostec		Use a light box with 2 fiberoptic arms.
Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26018-17	Jaw Opening Diameter: 0-1 mm
Moria Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26016-12	Jaw opening Diameter: 0-1 mm
Tungsten Needles	Fine Science Tools	10130-05	0.125 mm Rod diameter
Van Aken Plastalina	Blick	#33268-2981
Modeling Clay- white, red, or yellow
mMessage mMashine SP6 or T7 Kit	Ambion	AM1340