의 얼굴 이식<em&gt;는 Xenopus laevis의</em&gt; 태아

요약

Xenopus의 사이에 얼굴 조직을 "극단적 인 전방 도메인"이식에 대한 기술은 배아가 개발 한 laevis의. 조직은 두개 안면 개발 및 얼굴 영역 사이의 상호 작용을 신호에 대한 지역의 요구 사항의 연구를 허용, 또 다른 한개로 1 유전자 발현 배경에서 이동할 수 있습니다.

초록

두개 안면 출생 결함은 1 700 매 중 출산에 발생하지만 원인은 거의 때문에 두개 안면 개발의 제한된 이해를 알 수 없습니다. 신호 전달 경로와 조직이 개발 얼굴의 패턴 중 ACT 위치를 식별하기 위해, '얼굴 이식'기술은 개구리 Xenopus의 laevis의의 배아에서 개발되었다. 추정 화장지 ( "극단적 전방 도메인"(EAD))의 영역은 tailbud 단계에서 도너 배아로부터 제거하고, 상응하는 영역이 제거 된 동일한 스테이지의 호스트 배아에 이식된다. 이는 호스트 또는 공여 조직 유전자의 손실 또는 이득의 기능을 가지고, 그리고 / 또는 계보 라벨을 포함 키메라 얼굴을 생성하는데 사용될 수있다. 얼굴 영역이 용이하게 큰 상태로 치유 후에 개발의 결과를 모니터링하고, 도너 또는 주변 호스트 조직 내 신호 전달 경로의 역할을 나타낸다. Xenopus의 얼굴, 개발을위한 귀중한 모델미세 조작에 ccessible. 전개가 급속히 발생하기 때문에 많은 배아는 짧은 시간 동안, 정량 할 수있다. 두개 안면 프로세스가 Xenopus의 포유류 사이에 보존 나타부터 개구리의 연구 결과는 인간의 개발에 적합하다.

서문

두개 안면 개발 중에 두개 안면 기형아 출산 ^1-2, 중요한 조직과 자신의 신호 기여를 기본 메커니즘을 이해하는 것은 확인해야합니다. 개구리 Xenopus의 laevis의, 외배엽과 내배엽 직접 ^{3 ~ 4를} 나란히하는 "극단적 인 전방 도메인"(EAD)의 입과 콧 구멍의 형태를 포함하여 얼굴의 부분에서. EAD도 턱 등 얼굴 영역 ^5를 형성하는 두개골 신경 능선을 포함한 주변 조직을, 영향을주는 신호의 중심 역할을합니다. 조직이 해당 호스트 영역을 제거한 후, 호스트 배아에 기증자로부터 이식되는 경우 EAD 기능에 기여하는 유전자를 확인하기 위해, '얼굴 이식'기술이 개발되었다. 이식 후, 얼굴의 개발 결과는 평가한다. 따라서, 기능의 손실 (LOF) 또는 EAD있는 특정 유전자에 대한 기능 (GOF)의 이득 효과는 로컬 분석 여기서 H의 나머지EAD와 몸은 야생 형 조직으로 구성되어있다. 야생형 조직이 특정 유전자의 글로벌 LOF 또는 GOF와 배아에 이식되는 경우 상호 이식, 수행 할 수 있습니다. 이식은 자주 제노에서 사용되었으며 병아리 ^{6 연구.} 예를 들어, Xenopus의 이식은 homogenetic 신경 유도, 렌즈와 신경 능력, 그리고 신경 능선 마이그레이션 ^7-10를 해결하고있다. 메추라기 - 여자 키메라 이식은 전방 신경 플레이트, 전방 신경 능선, 신경 능선, 그리고 두개골 뼈 ^{11 ~ 14의} 개발을 분석하고있다. 이 Xenopus의에서 두개 안면 개발의 연구에 대한 첫 번째 이식 기술이다.이 기술은 추정 입 ⁵ 기저막 형성 조절에로 Wnt 억제 Frzb1 크레센트에 대한 새로운 역할을 보여 주었다.는 Xenopus laevis의는 두개 안면 개발 연구를위한 이상적인 모델입니다 배아가 큰만큼, 외부 개발ND 얼굴 있도록 쉽게 볼 수 있습니다 미세 조작 및 개발의 영상. 얼굴의 개발을 기본 메커니즘은 개구리에서 만든 연구 결과는 인간 개발 ^4,15-16에 대한 통찰력을 제공하는 것을 나타내는, 보존 나타납니다.

프로토콜

1. 준비 시약

1. 배 MBS : 바르트의 생리 식염수 (MBS) 솔루션 ¹⁷ 수정 10 배 1 L를 준비합니다. 표 1, 시약, 재료 및 지침을 참조하십시오. 모든 솔루션을 증류수를 사용합니다. 완전 용해 될 때까지 교반 막대를 사용하여, 비커에 섞는다. 모든 솔루션은 실온에서해야한다.
2. 1X MBS : 1X MBS의 한 L을 증류수 900 ml 중 10X MBS 용액 100 mL로 희석한다. 1 M _염화칼슘 용액의 0.7 ML을 추가합니다.
3. 0.1X MBS : 희석 1X MBS 0.5 배 MBS 용액 1 L와 0.1X MBS 용액 2 L를 준비. 0.1X MBS 용액 1 L에, 10 ㎎ / ㎖ 겐타 마이신 용액 1 ㎖를 추가합니다. 겐타 마이신 0.1X의 MBS 솔루션은 장기 배아 배양에 사용됩니다.
4. 피콜 / MBS는 : 0.5 배 MBS 용액을 500 ml의 피콜 400 15g을 추가합니다. 적극적으로 섞는다. 교반 막대를 추가하고 피콜가 완전히 (몇 시간) 녹을 때까지 섞는다.
5. 70 % 에탄올 : 사용하여 70 % 에탄올 100 % 에탄올을 희석증류수.

2. 유리 작동 도구 준비

1. 바늘 준비 : 바늘 풀러에로드 모세관 튜브.
   1. 바늘 풀러 설정 : 표 2에 나타낸 설정에 따라 바늘을 당긴다. 특정 시약 및 장비의 표에 설명 된대로 설정, 셔터 악기 유한 모델 P-80/PC의 마이크로 피펫 풀러와 모세관 호스를위한 것입니다. 그러나 이러한 설정은 셔터 바늘 풀러 특정하고, 다른 컴퓨터에 맞게 조정해야합니다. 기기의 제조자에 의해 지정된 설정, 램프 테스트를 사용하여 결정될 수있다.
   2. 절차에 대비 4-6 바늘을 빼냅니다. 바늘은 일반적으로 긴 2-3mm, 이는 유리 팁의가요 성, 모발 형 부분이 완전히 제거되도록 세분화되어야한다. 팁은 비교적 강성이지만 절삭 공구로서 사용하기에 충분히 좁지 있어야한다. 그림 1A에 이상적인 바늘의 사진을 참조하십시오.
   3. 중앙 아래로 점토의 스트립 페트리 접시에 바늘을 저장합니다. 점토로 각 바늘의 샤프트를 눌러 제자리에 고정하고 멀리 바닥과 측면에서 깨지기 쉬운 날카로운 끝을 유지합니다.
2. 추가 도구를 들어, 긴 표준 패턴 집게, 분젠 버너, 3-4 유리 파스퇴르 피펫 (크기 5 ¾) 한 쌍의 유리 커버 전표를 얻을 수 있습니다.
3. 피펫 도구 : 피펫 도구를 만들려면, 분젠 버너를 점화하고 끝이 녹아 구멍이 완전히 밀봉 폐쇄, 둥근 끝을 형성하도록, 그것을 회전하면서 불꽃의 푸른 부분으로 유리 파스퇴르 피펫의 끝을 배치 . 둥근, 밀봉 팁은 나중에 작업하는 동안 배아를 보유하고 점토 접시에 우울증을 만드는 데 사용됩니다. 그림 1B를 참조하십시오.
4. 유리 다리 : 유리 교량을주의 깊게 커버 슬립 유리 3mm 덩어리에 3mm을 해소하기 위해 긴 표준 패턴 집게를 사용합니다. T로 커버 슬립의 조각을 누른 채네 가장자리가 아래로 부드럽게 곡선까지 weezers, 작은 유리 돔을 형성, 불꽃에 유리를 배치합니다. 가장자리는 더 이상 날카로운 없어야합니다. 그림 1C를 참조하십시오.
5. 삽입하여 유리 커버 슬립 교량을 저장, 배양 접시의 바닥을 일렬로 세우는, 점토로, 아래 가장자리. 다리의 상단이 흙 표면 위에 남아 있도록 다리를 넣습니다. 그것을 제거하기 어려울 수 있기 때문에, 다리 나누기, 완전히 점토로 다리를 포함하지 않는 것이 너무 하드 등을 밀어하지 마십시오. 화염 또는 70 % 에탄올로 소독 한 후, 교량 실험 실험에서 재사용 할 수 있습니다.

3. 배아의 조작을위한 준비

1. 점토와 작은 60mm 플라스틱 페트리 접시 라인. 사용하는 사이에, 요리와 점토 표면은 충분히 증류수로 세척 한 후 70 % 에탄올로한다.
   참고 : 사용, 빨강, 흰색 또는 노란색에 현지에서 구입하실 수 있습니다 반 AKEN Plastalina 모델링 점토,Y 또는 예술 상점. 이 잔류 물을 발표하기 때문에 검은 색 점토는 사용하지 않는 것이 좋습니다.
2. 3 % 피콜 0.5 배 MBS 용액으로 접시를 채우십시오. 높은 소금 농도는 조직의 분리를 방지하고, 다당류 피콜은 위치에 얼굴을 들고 도움 솔루션을 두껍게하는 데 도움이됩니다.
3. 스테이지 (20) 배아 체의 깊이에 대해, 점토 얕은 2 ~ 3 밀리미터 우울증을 할 수있는 골조 파스퇴르 피펫 도구 (그림 1 참조)를 사용합니다. 접시의 양쪽에 떨어져 20-30 우울증 1-2 mm의, 그래서 40 ~ 60 우울증의 총이있다. 집게로 점토로 글자를 조각으로, 한면 LOF / GOF, 다른 쪽 야생형 레이블을 지정합니다.

4. 술 전 배아 준비

1. 확보와 문화 Xenopus의 표준 방법 ^17을 사용하여 배아를 laevis의. 개구리 사육에 대한 자세한 설명은, 시브 등. ^17를 참조하십시오
   1. 이전 실험 obta에 48 시간여성 개구리에서 계란과 체외 수정에 수행합니다.
   2. 하나의 세포 단계 또는 2 세포 단계에서 2 세포로 0.5 덮인 막 GFP의 mRNA의 NG 플러스 원하는 mRNA의 또는 안티센스 모르 폴리 노 - 수정 안티센스 올리고 뉴클레오티드 ( "morpholinos와")를 주입. 하나의 세포 단계는 약 70 ~ 90 분 동안 지속됩니다. 1-3 NL의 총 부피를 주입. (예 : GFP 또는 RFP RNA 등) 형광 단백질 RNA 코딩 대신에, 한 FITC 표지 된 모르 폴리 노 또는 형광 표지 덱스 트란을 주입 할 수있다. 형광은 조직의 치유를 이식하고 머리에 남아 있는지 여부를 결정하는 것이 중요합니다.
   3. 덮인의 mRNA는 mMessage mMachine의 T7 또는 SP6 키트를 사용하여 선형화 된 플라스미드로부터 제조 할 수있다. morpholinos와 설계 및 유전자 도구 LLC를 통해 주문할 수 있습니다. 원하는 효과를 위해 필요한 모르의 양은 각각의 유전자 ^(18)에 대해 결정해야한다.
   4. 그들은 19 ~ 20 단계에 도달 할 때까지 48 시간 동안 15 ° C에서 주입 된 배아를 보관합니다. (F또는 이후의 모든 단계, 단계의 배아 Nieuwkoop와 페이버 ^19으로는 Xenopus laevis의의 표준 표에 따라.)
      주 : 수술 당일, 두받는 사람과 기증자의 배아 이식이 최적으로 작동하려면 서로 한 단계 내에 있어야합니다. 그러나 morpholinos와 ( "morphants")를 주입 배아는 때로는 천천히 야생형보다 개발하거나 morphant 배아를 제어, 그래서 morphant 야생 형 배아가 같은 단계에 필요한 실험을 조정 할 수있다. Morphants 이전 절차에 12-24 시간 동안 높은 온도로 유지 될 필요가있다. 배아가 일치 단계에서 찾을 수있는 가능성을 높이기 위해 배아는 여러 온도에서 유지 될 수있다. 실험 전에 스물 네 시간 하나는 15 ~ 18 ℃에서 18 ~ 20 ° C와 야생형 배아에서 여러 요리 및 장소 morphants에 배아를 분할한다
2. 이식 실험, REM 당일the15 ° C의 배양기에서 배아를 비켜 및 Nieuwkoop와 페이버 ^(19)에 따라 그 무대. 그들은 늦게 neurula (단계 19)보다 어린 경우가 스테이지 (19)에 도달 할 때까지 1 ~ 2 시간 동안 실온에서 그들을두고.
3. 형광 현미경으로 주입 된 배아를 화면. 실험 유니폼, 밝은 형광을 보여 배아를 선택합니다.
4. 운영 근처 혼란 가능한 오염 물질을 제거합니다. 70 % 에탄올로 운영면, 입체 및 모든 도구를 닦습니다.
5. 배아 단계 19에서 일단, 실체 현미경 # 45분의 5 뒤몽의 집게를 사용하여 난황 막 제거합니다.
   1. 기증자와 호스트 배아의 각 20 ~ 30의 난황 막 제거합니다.
   2. 처음 몇 얼굴 이식 실험을 위해, 하나는 각 조건에 대한 몇 가지 배아 연습해야합니다. 방법은 도전이고 빠르고 성공적으로 큰 규모에 사용되기 전에주의 연습이 필요하다. 하나는 u에게 작업 할 수 있습니다/ 실험 20 이식을하고 피.
6. 플라스틱을 사용하여 운영 접시에 호스트 배아를 이동 오프닝은 배아 (적어도 몇 밀리미터)보다 훨씬 넓은되도록 잘라 끝으로 전송 피펫을 졸업했다. 배아는 표면 장력의 폭발로, 거품 또는 물 표면에 배아에 손이 닿지 않도록주의하십시오.
7. 점토 배아의 후부에, 점토 우울증으로 배아를 삽입 # 45분의 5 집게를 사용합니다. 조심스럽게 우울증 돌출, 배아의 상단 분기 머리를두고, 집게를 사용하여 태아의 기지 주변에 점토를 닫습니다.
8. 모든 호스트 배아 그들의 오목 부에 고정되면, 플레이트의 다른 측면으로 이동하고 그 오목 부에 상기 도너 배아를 삽입하기 시작한다. 자신의 우물에서 배아를 확보하는 과정을 반복합니다.

5. 얼굴 이식 수술을 수행

1. 절단 칼 : 제거를위한 절단 칼으로기증자 EAD의 조직으로, 적절하게 깨진 유리 모세관 바늘 (단계 2.3 및 그림 1 참조)를 사용합니다.
   참고 : 하나는 직접 손가락 사이에 모세관 (이 작은 손을 가진 사람들을 위해 잘 작동) 또는 하나가 곤충 핀 홀더에 바늘을 장착 할 수 있습니다 보유 할 수 있습니다. 핀 홀더로로드 Electrosharpened 텅스텐 바늘 ^{(17) 대신} 모세관 바늘을 사용할 수있다. 특정 시약 및 장비의 표에서 제시 핀 홀더 및 텅스텐 바늘을 참조하십시오.
2. 실체 현미경, 시멘트 선 (腺)의 왼쪽에있는 태아의 머리에 바늘을 삽입합니다. 이 헤드를 통해, 배아 외부로부터 전달하고 foregut로되도록 바늘이 깊게 삽입되어야한다. 전체 EAD를 이식하기 위해 인하 foregut에 태아의 외부에서 확장해야합니다. 외배엽 전용 이식, 상처가 얕은해야 만 외배엽을 통해 확장 할 수 있습니다.
   1. 오른쪽에 왼쪽에서 바늘 톡시멘트 선 (腺)의 전체 폭에 걸쳐, 머리. 모션이 깨끗한 컷을 제공으로 긋기가 중요합니다. 인하의 데모에 대한 기술과도 2b에 대한 요약도 2a를 참조하십시오. 시멘트 선 눈은 상처에 중요한 랜드 마크입니다. 커트의 순서는 결과에 영향을 미치지 않으며, 사용자의 취향이나 왼손잡이에 근거 될 수있다.
3. 시멘트 동맥의 왼쪽 경계에서, 이전 컷의 시작에서 바늘을 배치하고,이 좌안의 바닥에 도달 할 때까지 상방으로 바늘을 쓸어. 이것은 왼쪽 눈의 바닥에 시멘트 선 (腺)의 왼쪽 경계에서 수직 컷을 생성합니다.
4. 시멘트 선 (腺)의 오른쪽 테두리에 바늘을 배치하고, 오른쪽 눈의 바닥에 도달 할 때까지 위로 바늘을 가볍게. 이 오른쪽 눈 아래에 시멘트 선 (腺)의 오른쪽 테두리에서 수직 컷을 생성합니다.
5. 완전히 조직, 플릭을 절제하는 방법조직을 확보하는 가로 컷을 만들어, 오른쪽 눈의 아래에 왼쪽 눈의 바닥에서 바늘을 K. 커트 EAD 이식편에 외배엽과 내배엽 둘 다를 포함 foregut에 배아의 외측으로부터 연장 할 수있다. 또는, 얕은 상처는 외배엽 전용 EAD 이식에 사용할 수 있습니다. EAD 조직이 제거되면, 시멘트 선에서 스트레칭, foregut에 태아의 외부로부터의 사각형 구멍이 있어야합니다 그냥 눈 (위에서 아래로) 아래. 구멍은 오른쪽 눈 (좌우)의 내부 경계에 왼쪽 눈의 안쪽 경계에서 확장해야합니다. 그림 2BB를 참조하십시오.
6. 조심스럽게 바늘의 끝 부분에 절제 조직을 밀어 호스트 배아를 포함하는 요리의 부분에 버퍼를 통해 들어 올립니다. 표면 공기에 조직을 노출하지 마십시오 그것은 손상 될 것입니다.
7. 기증자로, 호스트 배아에서 같은 조직을 절제. 호스트 EAD 이식편을 폐기 또는 inser에 저장상호 이식을위한 기증자의 얼굴에 t.
8. # 45분의 5 집게를 사용하여 생성 된 호스트 구멍에 공여 이식편을 삽입합니다.
9. 기증자의 조직이 올바른 위치에 완전히 삽입되면, 조심스럽게 자리에 이식을 보유하는 태아의 얼굴 (그림 1 및 그림 2BC 참조) 유리 다리를 놓습니다. 다리의 끝은 장소에 들고, 점토에 삽입해야합니다. 다리는 가볍게 이식은 머리에서 튀어 나와 또는 깊은 머리에서 거짓말하지 않고, 호스트의 머리와 같은 높이 자리 잡고 있도록 이식 된 조직에 압력을 적용해야합니다. 머리는 약간 커버 슬립으로 평평하지만, 너무 많은 압력과 배아를 손상하지 않도록주의 할 수있다. 이식 5 분 이내에 수행해야합니다.
   참고 : 경험이 풍부한 수사관 2 ~ 3 시간에 걸쳐 실험 당 약 이십 이식을 수행 할 수 있습니다. 이 기간 동안 태아는 20 ~ 22 단계에서 진행됩니다. 얼굴 이식 완료단계 21 또는 22에서의이 결과에 영향을주지 않습니다. (단 22 ~ 26시) 이후 이식은 수행하지만 문장이없는 EAD의 중간 선 영역이 얼굴에 두개골 신경 능선 이동으로 좁혀으로 더 어렵습니다 수 있습니다. 이식에 걸쳐 일관성이 중요합니다.

6. 얼굴 이식 수술 후 복구

1. 치료는 일반적으로 2 ~ 3 시간이 걸립니다. 유리 다리가 제자리에 기증자의 조직을 들고 자신의 점토 우울증에 방해받지 실온에서 배아를 남겨주세요.
2. 이식이 치유되면, 조심스럽게, 유리 다리를 제거 집게를 사용하여 배아의 기지 주변에서 흙을 제거하고 플라스틱을 부드럽게 자신의 우울증 밖으로 배아를 진공 전송 피펫을 졸업 사용합니다.
3. 반 겐타 마이신 깨끗한 0.1X의 MBS 가득 적절하게 레이블이 지정된 페트리 접시에 배아를 놓습니다.
4. 그들은 승, 단계 40에서 올챙이 단계를 먹이에 도달 할 때까지 몇 일 동안 15 ° C, 18 ° C에서 배아를 성장암탉 얼굴 표현형은 득점 할 수있다.
   1. 겐타 마이신 0.1X의 MBS 솔루션은 매일 변경해야하고, 죽은 태아가 다른 태아의 오염과 사망을 방지하기 위해 즉시 제거해야합니다.
   2. 입 단계 40에서 열립니다. 단계 40 ​​~ 41에서, 하나는 이식 된 조직의 형광을 확인하여 장소에 치유 남아 있는지 확인해야합니다. 이식 가끔 빠지기 때문에, 하나는 모든 득점 배아 자리에 기증자의 조직이 있는지 확인해야합니다.

결과

도 2BC 같이 이식 된 조직이 완전히,도 3a에 도시 된 바와 같이 이식 후 숙주 헤드에 삽입하고, 적절 태아의 얼굴에 배치 된 유리 다리가되어야한다. 이식이 성공하려면 이식 기증자의 조직이 제대로 호스트 개방 크기가되어야합니다. 도 3B 및 3C에 도시 된 바와 같이 EAD 조직은, 어떤 방식으로, 헤드 돌출 안된다. 그림 3D에서와 같이 또?...

토론

중요한 단계 및 제한 사항 : EAD 얼굴 이식 절차는 시간과 집중적 인 작업. 그것은 완벽하게 연습, 꾸준한 손과 손재주를 필요로한다. 얼굴 이식 프로토콜을 효율적으로 제거하고 이식 조직하는 연구자의 능력에 의존합니다. 하나는 호스트의 얼굴에 이식을 삽입하는 데 시간이 너무 오래 걸리는 경우, 호스트 얼굴 계약을 치유하기 시작합니다. 겸자 미묘 얼굴 영역을 확장하는데 사용될 수있?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pasteur pipette	VWR	14672-400	Lime Glass
Size 5 3/4 in	Cotton Plugged
Graduated Transfer Pipette	VWR	16001-180	Disposable
#5/45 forceps	Fine Science Tools by Dupont medical	11251-35	Angled 45°
Standard Pattern Forceps	Fine Science Tools	11000-20	Straight; serrated tip; stainless steel
Capillary Tubing (for needles)	FHC	30-30-1	Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID/Fiber
Cover slip	VWR	48393 252	24 x 60 mm micro cover glass;
Ficoll 400	Sigma-Aldrich	F9378
Needle Puller	Sutter Instrument Co	Needle Puller: discontinued Filament: FB300B	The most similar, currently available  needle puller is the P-97. For filaments, use Sutter 3.00 mm square box filaments, 3.0 mm wide.
Model P-80	Flaming / Brown micropipette puller
Stereomicroscope	Zeiss
Stereomicroscope Lighting by Fostec	Fostec		Use a light box with 2 fiberoptic arms.
Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26018-17	Jaw Opening Diameter: 0-1 mm
Moria Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26016-12	Jaw opening Diameter: 0-1 mm
Tungsten Needles	Fine Science Tools	10130-05	0.125 mm Rod diameter
Van Aken Plastalina	Blick	#33268-2981
Modeling Clay- white, red, or yellow
mMessage mMashine SP6 or T7 Kit	Ambion	AM1340