Transplantes faciais em<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Os embriões

Resumo

Uma técnica para o transplante "Extreme Anterior Domain" tecido facial entre embriões de Xenopus laevis foi desenvolvido. Tecidos podem ser movidos de um gene de expressão fundo em outra, permitindo o estudo das necessidades locais para o desenvolvimento craniofacial e sinalização para as interações entre as regiões faciais.

Resumo

Defeitos congênitos craniofaciais ocorrer em 1 em cada 700 nascidos vivos, mas etiologia raramente é conhecido devido à compreensão limitada do desenvolvimento craniofacial. Para identificar onde vias de sinalização e tecidos agir durante padronização do rosto em desenvolvimento, a técnica "transplante de face" foi desenvolvido em embriões de rã Xenopus laevis. Uma região de tecido facial presuntivo (o "extremo anterior Domain" (EAD)) é removido a partir de um embrião dador na fase tailbud, e transplantado para um embrião hospedeiro da mesma fase, a partir do qual a região equivalente foi removido. Isto pode ser usado para gerar uma cara quimérico onde o tecido do hospedeiro ou de doadores tem uma perda ou ganho de função no gene, e / ou inclui um rótulo linhagem. Após a cura, o resultado do desenvolvimento é monitorizada, e indica os papéis da via de sinalização dentro do doador ou tecidos hospedeiros circundantes. Xenopus é um modelo útil para o desenvolvimento de cara, tal como a região facial é grande e prontamente umccessible para micromanipulação. Muitos embriões podem ser analisadas, durante um curto período de tempo já que o desenvolvimento ocorre rapidamente. Constatações do sapo são relevantes para o desenvolvimento humano, uma vez que os processos craniofaciais aparecer conservadas entre Xenopus e mamíferos.

Introdução

Para entender os mecanismos subjacentes defeitos craniofaciais congênitos ^1-2, tecidos importantes e suas contribuições de sinalização durante o desenvolvimento craniofacial devem ser identificados. No sapo Xenopus laevis, parte do rosto, incluindo a boca e as narinas forma do "Extreme Anterior Domain" (EAD), onde ectoderma e endoderma estão diretamente justapostas ^3-4. A EAD também actua como um centro de sinalização para influenciar os tecidos circundantes, incluindo a crista neural craniano, que forma as mandíbulas e outras regiões da face ^5. Para identificar genes que contribuem para a função de EAD, uma técnica de "transplante de face 'foi desenvolvido, em que o tecido transplantado de um dador para um embrião hospedeiro, após a remoção da região do hospedeiro correspondente. Seguindo o transplante, resultando desenvolvimento facial é avaliada. Assim, os efeitos da perda de função (LOF) ou ganho de função (GOF) de um gene específico em EAD são analisadas localmente, onde o restante do head e corpo é formado por um tecido do tipo selvagem. O transplante recíproco pode ser realizado, em que o tecido do tipo selvagem é transplantado em embriões com LOF mundial ou GOF em genes específicos. Transplante tem sido frequentemente usado em Xenopus e pintainho estuda ^6. Por exemplo, o transplante de Xenopus abordou indução homogenetic neural, lente e competência neural, e migração da crista neural ^7-10. Quail-chick enxerto quimérico analisou o desenvolvimento da placa neural anterior, cume neural anterior, crista neural, e os ossos cranianos ^11-14. Esta é a primeira técnica de transplante para o estudo do desenvolvimento craniofacial em Xenopus. Esta técnica tem demonstrado um novo papel para os inibidores de Wnt Frzb1 e crescentes na regulação da formação de membrana basal na boca presuntivo ^5. Xenopus laevis é um modelo ideal para o estudo do desenvolvimento craniofacial como embriões são grandes, desenvolver externamente, umand o rosto é facilmente visível, permitindo micromanipulação e imagem do desenvolvimento. Mecanismos subjacentes ao desenvolvimento facial aparecem conservado, indicando que as descobertas feitas no sapo fornecer uma visão sobre o desenvolvimento humano ^4,15-16.

Protocolo

1. Reagentes Preparar

1. 10x MBS: Preparar 1 L de 10x Modificado solução ¹⁷ de Barth Saline (MBS). Consulte a Tabela 1, Reagentes, ingredientes e instruções. Use água destilada para todas as soluções. Misture em uma proveta, utilizando uma barra de agitação, até a dissolução completa. Todas as soluções devem ser feitas à temperatura ambiente.
2. 1x MBS: Diluir 100 ml da solução de MBS 10x em 900 ml de água destilada para fazer 1 L de 1x MBS. Adicionar 0,7 ml de 1 M de solução de CaCl _2.
3. 0.1x MBS: diluir 1x MBS para preparar 1 L de solução 0,5 x MBS e 2 L de 0,1 x MBS solução. Para 1 L de 0,1 x MBS solução, adicionar 1 ml de 10 mg / ml solução de gentamicina. A solução de MBS 0,1 x com gentamicina será utilizado para a cultura de embriões de longo prazo.
4. Ficoll / MBS: Adicione 15 gramas de Ficoll 400 a 500 ml de solução de 0,5 x MBS. Misture vigorosamente. Adicionar uma barra de agitação e misturar até estar completamente dissolvido de Ficoll (várias horas).
5. Etanol a 70%: Diluir 100% de etanol para 70% de etanol usandoágua destilada.

2. Preparando vidro Ferramentas Operacionais

1. Preparação da agulha: Carga tubos capilares em um extrator de agulha.
   1. Puxe as agulhas de acordo com as configurações mostradas na Tabela 2: Configurações do extrator de agulhas. As definições são para um extractor de micropipeta Sutter Instrument Co. Modelo P-80/PC e tubos capilares, como descrito na Tabela de reagentes e equipamentos específicos. No entanto, essas configurações são específicas para a agulha extrator Sutter, e terá de ser ajustado para outras máquinas. As configurações podem ser determinados utilizando um teste de rampa, conforme especificado pelo fabricante da máquina.
   2. Puxe 4-6 agulhas em preparação para o procedimento. As agulhas devem ser quebradas de tal modo que a porção de cabelo como flexível da ponta de vidro é completamente removido, o que é tipicamente de 2-3 mm de comprimento. A ponta tem de ser relativamente rígido, mas ainda suficientemente estreita para ser utilizado como uma ferramenta de corte. Veja a foto de uma agulha ideal na Figura 1A.
   3. Armazenar as agulhas numa placa de Petri com uma tira de barro para baixo do centro. Pressione o eixo de cada agulha na argila, para segurá-la no lugar e manter a ponta afiada frágil longe do fundo e os lados.
2. Para ferramentas adicionais, obter lamínulas de vidro, um par de pinças longas padrão teste padrão, um bico de Bunsen, e 3-4 pipetas Pasteur de vidro (tamanho 5 ¾ in).
3. Ferramenta Pipeta: Para fazer uma ferramenta de pipeta, acender o queimador de Bunsen e colocar a ponta de uma pipeta de Pasteur de vidro para a parte azul da chama durante a rotação dele, de tal modo que a ponta se derrete e o furo completamente vedações, formando uma, extremidade arredondada fechada . A ponta arredondada está selado posteriormente usada para fazer depressões na louça de barro que detém os embriões durante a operação. Ver Figura 1B.
4. Pontes de vidro: fazer pontes de vidro, utilize uma pinça de padrão longo padrão de quebrar cuidadosamente off 3 mm x 3 milímetros pedaços de vidro tampa de deslizamento. Com o pedaço de lamínula com tweezers, coloque o vidro da chama até que todas as quatro bordas amaciar e curva descendente, formando uma pequena cúpula de vidro. As bordas não devem mais ser afiada. Ver Figura 1C.
5. Guarde as pontes deslizamento tampa de vidro, inserindo-os, bordas para baixo, em massa de modelar, que reveste a parte inferior de uma placa de Petri. Inserir as pontes de tal modo que a parte superior da ponte permanece acima da superfície da argila. Não muito difícil empurrar de tal modo que os intervalos de ponte, e não incorporar completamente a ponte para a argila, uma vez que pode ser difícil de remover. Após a esterilização com uma chama ou etanol a 70%, as pontes podem ser reutilizados de experiência para experiência.

3. Preparação para a Operação Embryo

1. Forre uma pequena 60 milímetros de plástico placa de Petri com massa de modelar. Entre as utilizações, a superfície do prato e argila é cuidadosamente lavado com água destilada e em seguida com etanol a 70%.
   NOTA: Use vermelho, branco ou amarelo, Van Aken Plastalina massa de modelar, que podem ser comprados em um local paray ou loja de arte. Barro preto não é recomendado porque ele libera um resíduo.
2. Encha o prato com 3% de solução Ficoll 0.5x MBS. A concentração mais elevada de sal previne a dissociao de tecido, e o polissacárido de Ficoll ajuda a engrossar a solução, o que ajuda a segurar o rosto em posição.
3. Use a ferramenta pipeta Pasteur inflamado (ver Figura 1) para fazer rasas, 2-3 mm depressões na argila, sobre a profundidade de um corpo embrião estágio 20. Faça 20-30 depressões, 1-2 mm, de cada lado do prato, para que haja um total de 40-60 depressões. Rotular um lado LOF / GOF, eo outro tipo selvagem lado, pela escultura iniciais no barro com uma pinça.

4. Preparação pré-operação Embryo

1. Obtenha e cultura de Xenopus laevis embriões usando métodos padrão ^17. Para uma descrição detalhada da criação de sapo, consulte Sive et al. ¹⁷
   1. Quarenta e oito horas antes do ensaio obtaem ovos de rãs fêmeas e realizar a fertilização in vitro.
   2. Injetar 0,5-1 ng de membrana tampado GFP mRNA, além de qualquer mRNA desejado ou anti-senso oligonucleotídeos antisense modificados por morpholino ("morpholinos") na fase de uma célula ou em duas células na fase 2 celular. A certa altura da célula dura aproximadamente 70-90 min. Injetar um volume total de 1-3 nl. Em lugar de codificação de RNA para uma proteína fluorescente (GFP, tal como ARN ou RFP), pode-se injectar com FITC etiquetado morfolino ou dextrano marcado por fluorescência. A fluorescência é importante para determinar se a cura do tecido transplantado e permanece na cabeça.
   3. Tampado ARNm pode ser preparado a partir de um plasmídeo linearizado usando uma SP6 mMessage mMachine ou kit T7. Morpholinos pode ser projetado e encomendado através Gene Ferramentas LLC. A quantidade de morfolino necessária para um efeito desejado deve ser determinada para cada gene ^18.
   4. Armazenar os embriões injectados a 15 ° C durante 48 horas, até que atinjam a fase de 19-20. (Fou todas as etapas subseqüentes, embriões em estágio de acordo com a tabela normal de Xenopus laevis por Nieuwkoop and Faber ^19.)
      NOTA: No dia da cirurgia, os dois embriões receptores e doadores devem estar dentro de um estágio de cada um para os transplantes de trabalhar de forma otimizada. No entanto, os embriões injetados com morpholinos ("morphants"), por vezes, desenvolver mais lentamente do que o tipo selvagem ou controlar embriões morphant, tornando-se necessário coordenar as experiências para que ambos morphant e embriões tipo selvagem estão no mesmo estágio. Morphants pode necessitar de ser mantido a uma temperatura mais elevada durante 12-24 horas antes do procedimento. Para aumentar a probabilidade de que os embriões podem ser encontrados nas fases correspondentes, os embriões podem ser mantido a várias temperaturas. Vinte e quatro horas antes do ensaio, deve-se dividir os embriões em um vários pratos e coloque morphants a 18-20 ° C e embriões tipo selvagem em 15-18 ° C.
2. No dia da experiência transplante, remove os embriões de the15 ° C incubadora e encenar los de acordo com Nieuwkoop and Faber ^19. Se eles são mais jovens do que neurula tarde (fase 19), deixá-los em temperatura ambiente por 1-2 horas, até atingirem o estágio 19.
3. Peneirar os embriões injectados sob um microscópio fluorescente. Selecione embriões que mostram uniforme, fluorescência brilhante para o experimento.
4. Remover a desordem e possíveis contaminantes perto da área de operação. Limpe a superfície de operação, microscópio estereoscópico e todas as ferramentas com etanol 70%.
5. Uma vez que os embriões estão em fase 19, retire a membrana vitelina usando # 5/45 fórceps Dumont sob microscópio estereoscópico.
   1. Retirar a membrana vitelina de 20-30 de cada um dos dadores e embriões hospedeiros.
   2. Para os primeiros experimentos de transplante de face, deve-se praticar com alguns embriões para cada condição. O método é difícil e requer a prática cuidadoso antes que ele possa ser utilizado numa escala maior, mais rapidamente e com sucesso. Pode-se trabalhar up para fazer 20 transplantes / experimentais.
6. Mover embriões hospedeiros para o prato de funcionamento utilizando uma pipeta de transferência de plástico graduado com a ponta cortada de tal forma que a abertura é muito mais ampla do que um embrião (pelo menos alguns milímetros). Tenha cuidado para evitar tocar embriões de bolhas ou a superfície da água, como embriões vai explodir na tensão superficial.
7. Use # 5/45 fórceps para inserir os embriões para as depressões de argila, com a posterior do embrião na argila. Feche a argila em torno das bases do embrião utilizando a pinça, deixando o quarto superior do embrião, a cabeça, que se projeta da depressão.
8. Uma vez que todos os embriões hospedeiros são fixadas nas suas depressões, mover-se para o outro lado da placa e começa a inserir os embriões de dadores nas suas depressões. Repita o processo de obtenção de embriões em seus poços.

5. Realização de Transplante Cirurgia Crânio-Facial

1. Faca de corte: Como uma faca de corte para remoçãode tecido de doador de EAD, usar uma agulha capilar de vidro apropriadamente dividido (ver passo 2.3 e Figura 1).
   NOTA: Pode-se realizar diretamente o capilar entre os dedos (isso funciona bem para as pessoas com mãos pequenas) ou pode-se montar a agulha em um suporte inseto pin. Agulhas de tungsténio Electrosharpened ¹⁷ carregados num suporte de pino pode ser utilizado em vez de uma agulha do tubo capilar. Por favor, veja retentores de pinos sugeridas e agulhas de tungstênio na Tabela de reagentes específicos e Equipamentos.
2. Sob um microscópio estereoscópico, inserir a agulha na cabeça do embrião à esquerda da glândula de cimento. A agulha deve ser inserida profundamente, de modo que passa a partir do lado de fora do embrião, através da cabeça, e para o intestino anterior. Para transplante de toda a EAD, cortes deve estender-se desde o exterior do embrião para o intestino anterior. Para transplantes somente ectoderma, os cortes devem ser mais raso e estender apenas através do ectoderma.
   1. Flick a agulha da esquerda para o lado direito dacabeça, ao longo de toda a largura da glândula cimento. O movimento súbito é importante, pois o movimento dá um corte limpo. Consulte a Figura 2A para um resumo da técnica e figura 2B para uma demonstração dos cortes. A glândula de cimento e os olhos são marcos importantes para os cortes. A ordem dos cortes não afetam o resultado e pode variar de acordo com a preferência do usuário ou lateralidade.
3. Coloque a agulha no início do corte anterior, na margem esquerda da glândula de cimento, e agite a agulha para cima, até atingir o fundo do olho esquerdo. Isto irá criar um corte vertical da margem esquerda da glândula de cimento para o fundo do olho esquerdo.
4. Coloque a agulha na borda direita da glândula de cimento, e agite a agulha para cima até que ele atinja o fundo do olho direito. Isto irá criar um corte vertical da margem direita da glândula de cimento para a parte inferior do olho direito.
5. A ressecção total do tecido, flick a agulha a partir da parte inferior do olho esquerdo para o fundo do olho direito, a criação de um corte horizontal que vai libertar o tecido. Os cortes podem estender-se desde o exterior do embrião para o intestino anterior, incluindo tanto ectoderme e endoderme no explante EAD. Como alternativa, cortes superficiais pode ser usado para ectoderma somente transplantes EAD. Uma vez que o tecido é removido EAD, deve haver um furo rectangular, a partir do exterior do embrião dentro do intestino anterior, estendendo-se a partir da glândula cimento até um pouco abaixo dos olhos (de cima para baixo). O buraco deve se estender a partir da fronteira para dentro do olho esquerdo até a fronteira interior do olho direito (lado a lado). Veja a figura 2bb.
6. Com cuidado, empurre o tecido retirado na ponta da agulha, e levantá-lo através do buffer para a parte do prato contendo embriões de acolhimento. Não exponha o tecido ao ar na superfície ou ele vai ficar danificado.
7. Excisar o mesmo tecido a partir do embrião hospedeiro, como para o dador. Descarte o explante EAD host ou salvá-lo para insert para o rosto do doador, para transplantes recíprocos.
8. Insira o explante doador para o buraco anfitrião resultante usando # 5/45 fórceps.
9. Uma vez que o tecido do doador está corretamente posicionado e totalmente inserido, coloque cuidadosamente uma ponte de vidro (veja a Figura 1 e Figura 2BC) sobre o rosto do embrião para realizar o transplante no lugar. As extremidades da ponte deve inserir no barro, segurando-o no lugar. A ponte deve aplicar uma pressão suave para o tecido transplantado, de tal forma que o transplante se encontra alinhada com a cabeça de acolhimento, sem que saindo da cabeça ou deitado no fundo da cabeça. A cabeça pode ser ligeiramente achatado pela lamínula, mas tenha cuidado para não danificar o embrião com muita pressão. Transplantes deve ser realizada no prazo de 5 minutos.
   NOTA: Um investigador experiente pode realizar cerca de vinte transplantes por experiência, mais de 2-3 horas. Durante este período, os embriões vai avançar a partir da fase 20-22. Completando o transplante de rostos na fase 21 ou 22 não afeta os resultados. Transplantes posteriores (em estágios 22-26) pode ser feito, mas são mais difíceis como a região da linha média EAD o livre-crista é estreitada como movimentos da crista neural cranial para o rosto. Consistência entre os transplantes é crítica.

6. Transplante de rosto recuperação pós-operação

1. Cura normalmente leva 2-3 horas. Deixe os embriões em temperatura ambiente sem ser perturbado em suas depressões de argila com as pontes de vidro segurando o tecido do doador no lugar.
2. Uma vez que os transplantes de ter curado, retire cuidadosamente as pontes de vidro, remova o barro em torno da base dos embriões, usando uma pinça, e use um plástico formado transferência pipeta para aspirar suavemente os embriões de suas depressões.
3. Coloque os embriões em uma placa de Petri devidamente rotulados, metade cheia de MBS 0,1 x limpas com gentamicina.
4. Crescer os embriões a 15 ° C ou 18 ° C durante vários dias, até alcançarem a alimentação fase de girino na fase 40, wgalinha fenótipos faciais podem ser pontuadas.
   1. A solução MBS 0,1 x com gentamicina deve ser trocada diariamente, e quaisquer embriões mortos devem ser removidos imediatamente para evitar a contaminação e morte de outros embriões.
   2. A boca abre na fase 40. Na fase 40-41, deve-se verificar se o tecido transplantado permanece curada no lugar, visualizando sua fluorescência. Transplantes ocasionalmente cair, por isso é preciso garantir que todos os embriões marcados têm o tecido do doador no lugar.

Resultados

Tecido transplantado deve ser totalmente inserida na cabeça hospedeiro após o transplante, conforme mostrado na Figura 3A, e tem uma ponte de vidro apropriadamente colocado na face do embrião, como mostrado na Figura 2bc. O tecido do doador transplantadas devem ser corretamente dimensionado para a abertura de acolhimento, para o transplante seja bem sucedido. O tecido EAD não devem sobressair a partir da cabeça, de forma alguma, como pode ser visto nas Figuras 3B e...

Discussão

Etapas críticas e limitações: O procedimento de transplante de rosto EAD é tempo e trabalho intensivo. Requer prática, mãos firmes, e destreza para aperfeiçoar. O protocolo de transplante de rosto depende da capacidade do pesquisador para remover de forma eficiente e tecidos para transplante. Se alguém leva muito tempo para inserir o transplante no rosto do anfitrião, o rosto de acolhimento começará a se contrair e curar. Pinça pode ser utilizado para expandir delicadamente a região facial. No entant...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pasteur pipette	VWR	14672-400	Lime Glass
Size 5 3/4 in	Cotton Plugged
Graduated Transfer Pipette	VWR	16001-180	Disposable
#5/45 forceps	Fine Science Tools by Dupont medical	11251-35	Angled 45°
Standard Pattern Forceps	Fine Science Tools	11000-20	Straight; serrated tip; stainless steel
Capillary Tubing (for needles)	FHC	30-30-1	Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID/Fiber
Cover slip	VWR	48393 252	24 x 60 mm micro cover glass;
Ficoll 400	Sigma-Aldrich	F9378
Needle Puller	Sutter Instrument Co	Needle Puller: discontinued Filament: FB300B	The most similar, currently available  needle puller is the P-97. For filaments, use Sutter 3.00 mm square box filaments, 3.0 mm wide.
Model P-80	Flaming / Brown micropipette puller
Stereomicroscope	Zeiss
Stereomicroscope Lighting by Fostec	Fostec		Use a light box with 2 fiberoptic arms.
Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26018-17	Jaw Opening Diameter: 0-1 mm
Moria Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26016-12	Jaw opening Diameter: 0-1 mm
Tungsten Needles	Fine Science Tools	10130-05	0.125 mm Rod diameter
Van Aken Plastalina	Blick	#33268-2981
Modeling Clay- white, red, or yellow
mMessage mMashine SP6 or T7 Kit	Ambion	AM1340