Трансплантация лица в<em&gt; Xenopus Laevis</em&gt; Эмбрионы

Резюме

Методика пересадки "Экстремальный Передней домен" лицевой ткани между Xenopus Laevis эмбрионы была разработана. Ткань может быть перемещен из одного гена фоне выражения в другую, что позволяет изучение местных требований к черепно-лицевого развития и для взаимодействия между регионами лица сигнализации.

Аннотация

Черепно-лицевые врожденные дефекты встречаются в 1 из каждых 700 родившихся живыми, но этиология редко известны в связи с ограниченным пониманием черепно-лицевого развития. Чтобы определить, где сигнальные пути и тканей действовать во паттерна развивающихся лице, методика "пересадка лица" была разработана в зародышах лягушки Xenopus Laevis. Область предполагаемого лицевой ткани («Экстрим Передняя Domain" (ЕАД)) удаляется из донорской эмбриона на стадии хвостовой почки, и пересадить к хост эмбриона одной сцене, из которого эквивалентна область была удалена. Это может быть использовано, чтобы генерировать химерный лицо, где хозяин или донор ткани имеет потерю или усиление функции в гене, и / или включает метку линии. После заживления, исход развития контролируется, и указывает роли сигнального пути в донора или окружающих тканях хозяина. Xenopus является ценным образцом для развития лица, так как регион лица большой и легкоccessible для микроманипуляций. Многие эмбрионы могут быть проанализированы, в течение короткого периода времени, так как развитие происходит быстро. В ходе проверки этой лягушки актуальны для развития человека, так как черепно-лицевые процессы появляются сохраняется между Xenopus и млекопитающих.

Введение

Чтобы понять механизмы, лежащие черепно-лицевые врожденные дефекты ^1-2, важные ткани и их сигнальные взносов в течение черепно-лицевого развития должны быть определены. В лягушка Xenopus Laevis, части лица, в том числе полости рта и ноздрей форме от "Extreme Передняя Domain" (EAD), где эктодерма и энтодерма непосредственно примыкающего ^3-4. EAD также действует как центр сигнализации влиять окружающие ткани, в том числе черепа нервного гребня, который образует челюсти и другие области лица ^5. Чтобы идентифицировать гены, которые способствуют функции EAD, методика «пересадка лица" был разработан, где ткань пересаживается от донора в хозяйскую эмбриона, после удаления соответствующего хоста регион. После пересадки, в результате развития лица оценивается. Таким образом, эффекты потери функции (LOF) или усиления функции (GOF) для конкретного гена в EAD проанализированы на месте, где остальная часть чEAD и тело состоит из дикого типа ткани. Взаимное пересадка может быть выполнена, где дикого типа ткани пересаживается в эмбрионов с глобальной LOF или GOF в специфических генов. Трансплантация была часто используется в Xenopus и цыпленок изучает ^6. Например, трансплантация Xenopus обратился homogenetic нейронной индукции, объектив и нейронной компетентность, и нервного гребня миграции ^7-10. Перепела-цыпленок химерные прививки проанализировал развитие передней части нервной пластинки, передней части нервной хребта, нервного гребня и костей черепа ^11-14. Это первый метод пересадки для изучения черепно-лицевого развития в Xenopus. Эта техника продемонстрировала новую роль ингибиторов Wnt Frzb1 и Полумесяца в регулировании образование базальной мембраны в презумптивной рта ^5. Xenopus Laevis является идеальной моделью для изучения черепно-лицевого развития как эмбрионы большие, развивать внешне,й лицо хорошо видна, позволяя микроманипуляция и визуализации развития. Механизмы, лежащие в основе развития лица появляются сохраняется, указывая, что выводы, сделанные в лягушку обеспечить понимание человеческого развития ^4,15-16.

протокол

1. Подготовка Реагенты

1. 10x MBS: Подготовка 1 л 10x Modified Соленая Барта (MBS) решение ^17. См. Таблицу 1, Реагенты, ингредиентов и инструкциями. Используйте дистиллированную воду для всех решений. Смешайте в стакане, используя мешалку, до полного растворения. Все растворы должны быть сделаны при комнатной температуре.
2. 1x MBS: Развести 100 мл 10x MBS решения в 900 мл дистиллированной воды, чтобы сделать 1 л 1x MBS. Добавить 0,7 мл 1 М раствора CaCl _2.
3. 0.1x MBS: Разбавьте 1x MBS по подготовке 1 л 0.5x MBS решения и 2 л 0,1 × MBS решения. К 1 л раствора 0,1 × MBS, добавляют 1 мл 10 мг / мл гентамицина раствора. 0.1x MBS решение с гентамицин будет использоваться для долгосрочного культуры эмбриона.
4. Ficoll / МБС: Добавить 15 г Ficoll 400 к 500 мл раствора 0,5 x MBS. Смешайте энергично. Добавить мешалку и перемешивают до фиколл полного растворения (несколько часов).
5. 70% этанол: Разбавить 100% этанола в 70% этаноле с использованиемдистиллированная вода.

2. Подготовка стекло Рабочий Инструменты

1. Подготовка Игла: Нагрузка капиллярные трубки в иглы съемник.
   1. Потяните иглы в соответствии с настройками, показанными в таблице 2: параметры съемник игл. Настройки для Sutter Инструмент Ко Модель P-80/PC микропипетки съемник и капиллярных трубок, как описано в таблице конкретных реагентов и оборудования. Тем не менее, эти параметры являются специфическими для иглы съемник Саттер, и должны быть скорректированы для других машин. Настройки можно определить с помощью теста рампы, как указано производителем машины.
   2. Потяните 4-6 иглы в рамках подготовки к процедуре. Иглы должны быть разбиты таким образом, что гибкий, волосы, как часть кончика стеклянной полностью удалены, который, как правило, 2-3 мм длиной. Наконечник должен быть относительно жестким, но все еще достаточно узким, чтобы использовать в качестве режущего инструмента. См. фото идеального иголку в рисунке 1а.
   3. Хранить иглы в чашке Петри с полоской глины по центру. Нажмите вал каждой иглы в глину, чтобы удерживать его на месте и сохранить хрупкий острый кончик от дна и стенок.
2. Для дополнительных инструментов, получить стеклянные покровные стекла, пара длинных стандартных шаблонов щипцы, горелкой Бунзена и 3-4 стекло пипетки Пастера (размер 5 ¾ дюйма).
3. Внесите инструмент: Чтобы инструмент пипетки, зажечь горелку и поместить кончик стеклянной пипетки Пастера в синей части пламени, вращая ее, так, что конец плавится и отверстие вполне уплотнения, образуя замкнутый, закругленным концом . Округлая, герметичный наконечник позже использоваться, чтобы сделать углубления в глинистой блюдо, которое держит эмбрионов во время операции. См. рисунок 1В.
4. Стеклянные мосты: сделать стеклянные мосты, использовать длинные установленного образца щипцов тщательно разорвать 3 мм на 3 мм кусками скольжения крышка стекла. Удерживая кусок крышки скольжения с тweezers, поместите стекло в пламени, пока все четыре края не смягчают и кривая вниз, образуя крошечные стеклянный купол. Края не должны больше быть острым. См. рисунок 1С.
5. Храните стекло крышки скольжения мосты, вставляя их, края вниз, в пластилина, подкладка дно чашки Петри. Вставка мосты таким образом, что верхняя часть моста остается над поверхностью глины. Не нажимайте слишком сильно, так что мост ломается, и не в полной мере внедрить мост в глину, потому что это может быть трудно удалить. После стерилизации с пламенем или 70% этанола, мосты могут быть повторно использованы от эксперимента к эксперименту.

3. Подготовка к эмбрионов работы

1. Линия малого 60 мм пластиковый чашку Петри с пластилином. Между использования, блюдо и глина поверхность тщательно промывают дистиллированной водой, а затем 70%-ным этанолом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте красный, белый или желтый, Ван Aken Plastalina пластилин, который можно купить на местном, чтобыу или искусство магазин. Черная глина не рекомендуется, поскольку он освобождает остаток.
2. Заполните блюдо с 3%-ным раствором фиколл 0.5x MBS. Чем выше концентрация соли предотвращает ткани диссоциации, а полисахарид фиколл помогает сгустить решение, которое помогает в проведении лицо в положении.
3. Используйте пылали пипетки Пастера инструмент (см. Рисунок 1), чтобы сделать неглубокие, 2-3 мм депрессии в глине, о глубине эмбриона тела этап 20. Сделать 20-30 депрессии, 1-2 мм друг от друга, по обе стороны от тарелки, так что в общей сложности 40-60 депрессий. Этикетка одна сторона LOF / GOF, а другая сторона дикого типа, инициалы резьбой в глину щипцами.

4. Предоперационной эмбрионов Подготовка

1. Получите и культура Xenopus Laevis эмбрионов, используя стандартные методы ^17. Для более подробного описания лягушки хозяйства, см. Sive др. ^17.
   1. Сорок восемь часов до эксперимента obtaв яйцах из женских лягушек и выполнять искусственное оплодотворение.
   2. Введите 0,5-1 нг ограничен мембраны GFP мРНК, плюс любую желаемую мРНК или антисмысловые морфолинодоксорубицин изменение антисмысловых олигонуклеотидов ("Morpholinos") на стадии одного элемента или в 2-х ячеек на стадии 2 клеток. Одноэтапный клеток длится примерно 70-90 мин. Введите общий объем 1-3 NL. На месте РНК, кодирующей флуоресцентного белка (например, GFP или РНК RFP), можно вводить меченное ФИТЦ морфолино или флуоресцентно меченого декстрана. Флуоресценции имеет важное значение для определения, является ли пересадить ткани лечит и остается в голове.
   3. Сборную мРНК могут быть получены из линеаризованной плазмиды с использованием SP6 mMessage mMachine или Т7 комплект. Morpholinos могут быть разработаны и заказать через Джин Сервис LLC. Количество морфолино, необходимого для желаемого эффекта должны быть определены для каждого гена ^18.
   4. Храните инъекционные эмбрионов при 15 ° С в течение 48 ч, пока они не достигнут стадии 19-20. (Fили все последующие шаги, эмбрионов на стадии в соответствии с нормальной таблице Xenopus Laevis по Nieuwkoop и Faber ^19.)
      ПРИМЕЧАНИЕ: В день операции, как реципиента и донора эмбрионы должны быть в пределах одной стадии друг с другом за трансплантаты для оптимальной работы. Однако эмбрионы вводили Morpholinos ("морфантов") иногда развиваются медленнее, чем дикого типа или контролировать morphant эмбрионов, что приводит к необходимости координации эксперименты так как morphant и эмбрионы дикого типа находятся на той же стадии. Морфантов может необходимо поддерживать при более высокой температуре в течение 12-24 часов до процедуры. Чтобы увеличить вероятность того, что эмбрионы могут быть найдены в соответствующих стадиях, эмбрионы можно поддерживать при нескольких температурах. Двадцать четыре часа до эксперимента, следует разделить эмбрионов в нескольких блюд, и место морфантов при 18-20 ° С и эмбрионов дикого типа при 15-18 ° С.
2. На день трансплантация эксперимента, бэрОве эмбрионов от the15 ° C инкубатора и поставить их в соответствии с Nieuwkoop и Faber ^19. Если они моложе конце нейрулы (стадия 19), оставить их при комнатной температуре в течение 1-2 ч, пока они не достигнут стадии 19.
3. Экран закачиваемой эмбрионов под флуоресцентным микроскопом. Выберите эмбрионов, которые показывают равномерное, яркое свечение для эксперимента.
4. Удалить беспорядок и возможные загрязняющие вещества вблизи рабочей зоны. Протрите рабочую поверхность, стереомикроскоп и все инструменты с 70% этанола.
5. Как только эмбрионы на стадии 19, удалить желточной оболочки, используя # 5/45 Дюмон щипцы под стереомикроскопом.
   1. Удалить желточной мембрану 20-30 каждого из доноров и эмбрионов хозяев.
   2. В течение первых нескольких лица экспериментов по трансплантации, мы должны практиковать с несколькими эмбрионов для каждого условия. Метод является сложным и требует тщательного практике, прежде чем он может быть использован в более крупном масштабе, быстро и успешно. Можно работать Uр делать 20 трансплантаций / эксперимента.
6. Перемещение эмбрионов хостов в операционной блюдо с использованием пластика окончил пипетки передачи с наконечником отрезать, так что отверстие гораздо шире, чем эмбриона (по крайней мере несколько миллиметров). Будьте осторожны, чтобы не касаться эмбрионов пузырьков или водной поверхности, как эмбрионы взорвется поверхностного натяжения.
7. Используйте # 5/45 щипцов вставить эмбрионов в глиняных депрессий, с задней эмбриона в глине. Аккуратно закройте глину вокруг баз эмбриона с помощью пинцета, оставляя верхнюю четверть эмбриона, руководитель, выступающий от депрессии.
8. После того как все эмбрионы хост закреплены в своих депрессий, перейти на другую сторону пластины и начинают вставить эмбрионов доноров в их депрессий. Повторите процесс обеспечения эмбрионов в своих скважин.

5. Выполнение лица трансплантационной хирургии

1. Резка нож: В качестве режущего ножа для удалениядонорской EAD ткани, использовать надлежащим битого стекла капилляров иглу (см. шаг 2.3 и рисунок 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Можно напрямую провести капилляр между пальцами (это хорошо работает для людей с маленькими руками), или можно установить иглу в держатель насекомых контактный. Electrosharpened вольфрама иглы ^17, загруженные в держатель штифта может быть использован вместо иглы капиллярной трубки. Пожалуйста, смотрите, предложенные держатели кеглей и вольфрама иглы в Таблице специфических реагентов и оборудования.
2. Под стереомикроскопом, вставить иглу в голову эмбриона слева от цементной железы. Игла должна быть вставлена ​​глубоко, так, что он проходит за пределами эмбриона, через голову, и в передней кишки. Чтобы пересадить весь EAD, сокращения должны расширить извне эмбриона к передней кишки. Для эктодермы только трансплантации, сокращения должны быть мельче и распространяются только через эктодермы.
   1. Флик иглу из левой в правую сторонуголовы, по всей ширине цементного железы. Стряхивая важно, так как движение дает чистый срез. Обратитесь к рисунку 2А для резюме техники и фиг.2В для демонстрации сокращений. Цемент железы и глаза важными вехами для сокращений. Порядок сокращений не влияет на результат и может меняться в зависимости от предпочтений пользователя или беспристрастности.
3. Поместите иглу в начале предыдущего разреза, на левой границе цементной железы, и вылить иглу вверх, пока не достигнет нижней части левого глаза. Это создаст вертикальный разрез от левой границы цементной железы в нижней части левого глаза.
4. Поместите иглу на правой границы цементного железы, и вылить иглу вверх, пока не достигнет дна правого глаза. Это создаст вертикальный разрез от правой границы цементной железы в нижней части правого глаза.
5. Чтобы полностью иссечь ткани, ФликК иглу из нижней части левого глаза до нижней части правого глаза, создавая горизонтальный разрез, который будет освободить ткани. Отрезки может проходить от внешней стороне эмбриона к передней кишки, включая как эктодермы и энтодермы в эксплантов EAD. С другой стороны, мелкие разрезы могут быть использованы для эктодерма только для EAD трансплантации. После того, как ЕАД ткань удаляется, не должно быть прямоугольное отверстие со стороны эмбриона в передней кишки, простирающейся от цементной железы чуть ниже глаз (сверху вниз). Отверстие должно проходить от внутренней границы левого глаза к внутреннему краю правого глаза (со стороны в сторону). См. рисунок 2BB.
6. Осторожно вставьте вырезали ткани на кончике иглы, и поднять его через буфер в части чашку, содержащую эмбрионы хостов. Не подвергайте ткани в приземном слое воздуха, или это может быть поврежден.
7. Акцизный той же ткани от принимающей эмбриона, как для донора. Откажитесь от хозяина EAD эксплантов или сохранить его на INSERт в донорской лица, для взаимных трансплантации.
8. Вставьте доноров эксплантов в результате принимающей отверстие с помощью # 5/45 щипцы.
9. После того, как донорская ткань расположена правильно и полностью вставлен, осторожно поместите стеклянную мост (см. рисунок 1 и рисунок 2bc) на лицо эмбриона провести пересадку на месте. Концы моста должны вставить в глину, удерживая его на месте. Мост должен мягко надавливайте на пересаженной ткани, например, что пересадка лежит на одном уровне с принимающей голове, без него торчит из головы или лежа глубоко в голове. Голова может быть слегка распрямить покровного стекла, но будьте осторожны, чтобы не повредить эмбрион со слишком большим давлением. Трансплантация должна быть выполнена в течение 5 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: опытный следователь может выполнять около двадцати пересадке на эксперимент, над 2-3 часа. В этот период эмбрионы будут прогрессировать от стадии 20-22. Завершение пересадку лицас при стадии 21 или 22 не влияют на результаты. Более поздние пересадки (на этапах 22-26) может быть сделано, но сложнее, так как гребень без ЕАД средней линии регион будет сужено, как черепных нервного гребня перемещается в лицо. Консистенция по трансплантации имеет решающее значение.

6. Лицо Пересадка После операции восстановления

1. Исцеление обычно занимает 2-3 час. Оставьте эмбрионов при комнатной температуре не нарушенной в своих глиняных депрессий с стеклянные мосты проведения донорской ткани на месте.
2. После того, как трансплантаты зажили, осторожно снимите стеклянные мосты, удалить глину из вокруг основания эмбрионов с помощью щипцов, и использовать пластиковые окончил пипетки передачи мягко вакуум эмбрионов из своих депрессий.
3. Положите эмбрионов в соответствующей маркировкой чашку Петри, половина заполнены с чистыми 0.1x MBS с гентамицин.
4. Расти эмбрионов при 15 ° С или 18 ° С в течение нескольких дней, пока они не достигнут кормления стадии головастика на стадии 40, шкурица фенотипы лица может быть засчитан.
   1. 0.1x MBS решение с гентамицин следует менять ежедневно, а также любые мертвые эмбрионы должны быть удалены немедленно, чтобы предотвратить загрязнение и гибель других эмбрионов.
   2. Рот открывается в стадии 40. На первом этапе 40-41, надо проверить, что пересаженные ткани остается лечиться в месте, просмотрев его флуоресценции. Трансплантация иногда выпадают, поэтому необходимо убедиться, что все набранные эмбрионы имеют донорской ткани на месте.

Результаты

Пересаживают ткань должна быть полностью вставлена ​​в принимающей головы после трансплантации, как показано на рисунке 3А, и есть стеклянная мост надлежащим размещены на лице эмбриона, как показано на рисунке 2bc. Пересадить донорскую ткань должна быть правильно ра?...

Обсуждение

Критические шаги и ограничения: Процедура трансплантации лица ЕАД время и работать интенсивно. Это требует практики, устойчивые руки, и ловкость, чтобы усовершенствовать. Протокол пересадка лица зависит от способности исследователя эффективного удаления и пересадки тканей. Если ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pasteur pipette	VWR	14672-400	Lime Glass
Size 5 3/4 in	Cotton Plugged
Graduated Transfer Pipette	VWR	16001-180	Disposable
#5/45 forceps	Fine Science Tools by Dupont medical	11251-35	Angled 45°
Standard Pattern Forceps	Fine Science Tools	11000-20	Straight; serrated tip; stainless steel
Capillary Tubing (for needles)	FHC	30-30-1	Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID/Fiber
Cover slip	VWR	48393 252	24 x 60 mm micro cover glass;
Ficoll 400	Sigma-Aldrich	F9378
Needle Puller	Sutter Instrument Co	Needle Puller: discontinued Filament: FB300B	The most similar, currently available  needle puller is the P-97. For filaments, use Sutter 3.00 mm square box filaments, 3.0 mm wide.
Model P-80	Flaming / Brown micropipette puller
Stereomicroscope	Zeiss
Stereomicroscope Lighting by Fostec	Fostec		Use a light box with 2 fiberoptic arms.
Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26018-17	Jaw Opening Diameter: 0-1 mm
Moria Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26016-12	Jaw opening Diameter: 0-1 mm
Tungsten Needles	Fine Science Tools	10130-05	0.125 mm Rod diameter
Van Aken Plastalina	Blick	#33268-2981
Modeling Clay- white, red, or yellow
mMessage mMashine SP6 or T7 Kit	Ambion	AM1340