Transplantations faciales<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryons

Résumé

Une technique de transplantation de "Extreme antérieur domaine" mouchoirs entre les embryons de Xenopus laevis a été développé. Tissu peut être déplacé d'un gène expression fond dans un autre, ce qui permet l'étude des besoins locaux pour le développement cranio-facial et d'interactions entre les régions du visage de signalisation.

Résumé

Malformations congénitales cranio-faciales se produisent dans 1 sur chaque 700 naissances vivantes, mais l'étiologie est rarement connus en raison de la compréhension limitée de développement cranio-facial. Pour déterminer où les voies de signalisation et les tissus agissent pendant la structuration de la face en développement, une technique «visage de transplantation» a été développé dans les embryons de la grenouille Xenopus laevis. Une région de tissu facial présomptif (le «extrême antérieure de domaine" (EAD)) est retiré d'un embryon donneur à l'étape du bourgeon caudal, et transplanté dans un embryon hôte de la même scène, à partir de laquelle la région équivalente a été éliminée. Ceci peut être utilisé pour générer une face chimérique où le tissu de l'hôte ou d'un donneur a subi une perte ou gain de fonction dans un gène, et / ou comprend une étiquette de lignage. Après la guérison, le résultat du développement est surveillé, et indique les rôles de la voie de signalisation dans le donateur ou tissus de l'hôte environnantes. Xenopus est un modèle précieux pour le développement de visage, comme la région du visage est large et facilement unccessible pour la micromanipulation. De nombreux embryons peuvent être analysés, sur une courte période de temps puisque le développement se fait rapidement. Les conclusions de la grenouille sont pertinents pour le développement humain, car les processus cranio-faciales semblent conservés entre Xenopus et les mammifères.

Introduction

Pour comprendre les mécanismes sous-jacents des défauts cranio-faciales congénitales ^1-2, tissus importants et leurs contributions de signalisation au cours du développement cranio-facial doit être identifié. Dans la grenouille Xenopus laevis, une partie du visage, y compris la bouche et les narines forme de la "Extreme antérieure de domaine" (EAD), où l'ectoderme et l'endoderme sont directement juxtaposés ^3-4. L'EAD agit également comme un centre de signalisation pour influencer les tissus environnants, y compris la crête neurale crânienne, qui forme des mâchoires et d'autres régions du visage ^5. Pour identifier les gènes qui contribuent à la fonction de l'EAD, une technique «visage de transplantation» a été développé, où le tissu est transplanté d'un donneur dans un embryon hôte, après le retrait de la région d'hôte correspondant. Après la greffe, ce qui entraîne le développement du visage est évaluée. Ainsi, les effets de la perte de fonction (LOF) ou gain de fonction (GOF) pour un gène spécifique dans la EAD sont analysées localement, où le reste de l'hLire et corps est composé de tissus de type sauvage. La transplantation réciproque peut être effectuée, où le type sauvage tissu est transplanté dans des embryons avec LOF mondiale ou GOF dans les gènes spécifiques. Transplantation a été fréquemment utilisé dans Xenopus et étudie poussin ^6. Par exemple, la transplantation de Xenopus a traité homogenetic induction neurale, la lentille et de la compétence de neurones, et la migration de la crête neurale ^7-10. Caille-poulet greffe chimère a analysé le développement de la plaque neurale antérieure, crête neurale antérieure, la crête neurale, et les os crâniens ^11-14. C'est la première technique de greffe pour l'étude du développement cranio-facial chez Xenopus. Cette technique a démontré un nouveau rôle pour les inhibiteurs de Wnt Frzb1 et du Croissant dans la régulation de la formation de la membrane basale dans la bouche présomptif ^5. Xenopus laevis est un modèle idéal pour l'étude du développement cranio-facial que les embryons sont grandes, développer l'extérieur, une le visage est bien visible, ce qui permet la micromanipulation et de l'imagerie de développement. Mécanismes sous-jacents du développement du visage semblent conservés, ce qui indique que les constatations faites dans la grenouille permettent de mieux comprendre le développement humain ^4,15-16.

Protocole

Une. Réactifs Préparation

1. 10x MBS: Préparer 1 L de 10x modification Saline de Barth (MBS) de la solution ^17. Reportez-vous au tableau 1, les réactifs, les ingrédients et les instructions. Utilisez de l'eau distillée pour toutes les solutions. Mélanger dans un bol, à l'aide d'une barre d'agitation, jusqu'à complète dissolution. Toutes les solutions doivent être effectuées à température ambiante.
2. 1x MBS: Diluer 100 ml de solution 10x MBS dans 900 ml d'eau distillée pour obtenir 1 L de 1x MBS. Ajouter 0,7 ml de solution M CaCl ₂ 1.
3. 0,1 x MBS: Diluer 1x MBS pour préparer 1 L de solution 0.5x MBS et 2 L de 0,1 x MBS solution. Pour 1 L de 0,1 x MBS solution, ajouter 1 ml de 10 mg / ml solution de gentamicine. La solution de MBS de 0,1 x la gentamicine sera utilisé pour la culture d'embryons à long terme.
4. Ficoll / MBS: Ajouter 15 g de Ficoll 400 à 500 ml d'une solution 0,5 x MBS. Mélanger vigoureusement. Ajouter une barre d'agitation et mélanger jusqu'à dissolution complète du Ficoll (plusieurs heures).
5. 70% d'éthanol: Diluer à 100% d'éthanol à 70% d'éthanol à l'aidede l'eau distillée.

2. Préparation de verre Outils d'exploitation

1. préparation de l'aiguille: Charge tube capillaire dans un extracteur d'aiguilles.
   1. Tirez les aiguilles selon les paramètres indiqués dans le tableau 2: les paramètres de traction aiguilles. Les réglages sont pour une micropipette extracteur Sutter Instrument Co. Modèle P-80/PC et tubes capillaires, comme décrit dans le tableau de réactifs et d'équipements spécifiques. Cependant, ces paramètres sont spécifiques à l'aiguille extracteur Sutter, et devront être ajustés pour les autres machines. Les paramètres peuvent être déterminées en utilisant un test de rampe, comme spécifié par le fabricant de la machine.
   2. Tirer 4-6 aiguilles en vue de la procédure. Les aiguilles doivent être répartis de telle sorte que la partie flexible, les cheveux en forme de l'embout de verre est complètement retiré, ce qui est typiquement de 2 à 3 mm de long. La pointe doit être relativement rigide, mais tout de même suffisamment étroit pour être utilisé comme un outil de coupe. Voir photo d'une aiguille idéal à la figure 1A.
   3. Stocker les aiguilles dans une boîte de Pétri avec une bande de terre le long du centre. Appuyez sur l'arbre de chaque aiguille dans l'argile, pour le maintenir en place et de tenir le bout pointu fragile loin du fond et les côtés.
2. Pour les outils supplémentaires, obtenir une couverture lames de verre, une paire de longues pinces standards de modèle, d'un bec Bunsen, et 3-4 pipettes Pasteur en verre (taille 5 ¾ po).
3. outil Pipette: Pour faire un outil de pipette, allumer le brûleur Bunsen et placer la pointe d'une pipette Pasteur en verre dans la partie bleue de la flamme tout en le tournant, de telle sorte que la pointe fond et complètement le trou joints, formant une, extrémité fermée arrondie . Le arrondie, pointe scellée est ensuite utilisé pour faire des dépressions dans le plat en argile qui contient les embryons pendant l'opération. Voir la figure 1B.
4. ponts en verre: Pour faire des ponts en verre, utiliser des pinces de modèle à long standard pour rompre avec précaution 3 mm par 3 mm des morceaux de verre lamelle. Tout en maintenant le morceau de lamelle avec tweezers, placer le verre dans la flamme jusqu'à ce que tous les quatre bords et adoucir la courbe vers le bas, formant un dôme de verre minuscule. Les bords ne doivent plus être pointu. Voir la figure 1C.
5. Conserver les ponts de glissement de couverture de verre en les insérant, bords vers le bas, en pâte à modeler, recouvrant le fond d'une boîte de Pétri. Insérer les ponts de telle sorte que la partie supérieure du pont reste au-dessus de la surface de l'argile. Ne poussez pas trop dur de sorte que les ruptures de pont, et ne pas intégrer totalement le pont dans l'argile, parce qu'il peut être difficile à enlever. Après la stérilisation à la flamme ou à l'éthanol 70%, les ponts peuvent être réutilisées d'une expérience à.

3. Préparation de l'opération d'embryons

1. Tapisser un petit 60 mm boîte de Petri en plastique de pâte à modeler. Entre deux utilisations, la surface de la boîte et de l'argile est soigneusement lavé avec de l'eau distillée, puis avec 70% d'éthanol.
   REMARQUE: Utilisez le rouge, blanc ou jaune, Van Aken Plastalina pâte à modeler, qui peut être acheté à un localy ou magasin d'art. Argile noire n'est pas recommandé, car il libère un résidu.
2. Remplissez le plat avec 3% de solution de Ficoll 0.5x MBS. La concentration en sel plus élevée empêche la dissociation du tissu, et le Ficoll polysaccharide permet d'épaissir la solution, ce qui contribue à la face de fixation en position.
3. Utilisez l'outil de pipette Pasteur flambé (voir la figure 1) de faire peu profondes, 2-3 mm dépressions dans l'argile, de la profondeur d'un corps stade 20 de l'embryon. Assurez 20-30 dépressions, 1-2 mm, de chaque côté de la boîte, il ya donc un total de 40-60 dépressions. Étiqueter un côté LOF / GOF, et l'autre de type sauvage de côté, par la sculpture initiales dans l'argile avec une pince.

4. Préparation Preoperation d'embryons

1. Obtenir et de la culture de Xenopus laevis embryons utilisant des méthodes standards ^17. Pour une description détaillée de la grenouille élevage, s'il vous plaît voir Sive et al. ¹⁷
   1. Quarante-huit heures avant l'expérimentation bénéficier du droit d'dans les œufs de grenouilles femelles et effectuer la fécondation in vitro.
   2. Injecter 0,5-1 ng de membrane coiffé GFP ARNm, ainsi que toute l'ARNm désiré ou anti-sens oligonucléotides antisens morpholino modifié ("Morpholinos») au stade d'une cellule ou dans deux cellules au stade 2 cellules. L'un stade cellulaire dure environ 70-90 min. Injecter un volume total de 1-3 nl. A la place de l'ARN codant pour une protéine fluorescente (GFP tel que l'ARN ou DP), on peut injecter FITC dextran marqué ou morpholino marqué par fluorescence. La fluorescence est important pour déterminer si la transplantation de tissus et guérit reste dans la tête.
   3. Plafonné de l'ARNm peut être préparé à partir d'un plasmide linéarisé à l'aide d'un SP6 mMessage mMachine ou kit T7. Morpholinos peut être conçu et commandé par Gene Tools LLC. La quantité de morpholino requise pour un effet désiré doit être déterminée pour chaque gène ^18.
   4. Stocker les embryons injectés à 15 ° C pendant 48 heures, jusqu'à ce qu'ils atteignent le stade 19-20. (Fou toutes les étapes ultérieures, des embryons de stade selon la table normale de Xenopus laevis par Nieuwkoop et Faber ^19.)
      NOTE: Le jour de la chirurgie, les deux embryons donateurs et bénéficiaires doivent être dans un stade de l'autre pour les greffes de travailler de manière optimale. Cependant, les embryons injectés avec morpholinos ("morphants») développent parfois plus lentement que le type sauvage ou contrôlent embryons morphant, ce qui rend nécessaire de coordonner les expériences afin que les deux morphant et embryons de type sauvage sont au même stade. Peuvent avoir besoin d'être maintenue à une température plus élevée pendant 12 à 24 heures avant la procédure morphants. Pour augmenter la probabilité que les embryons peuvent être trouvés à des stades correspondants, les embryons peuvent être maintenus à différentes températures. Vingt-quatre heures avant l'expérience, il faut diviser les embryons dans une plusieurs plats, et placer morphants à 18-20 ° C et les embryons de type sauvage à 15-18 ° C.
2. Le jour de l'expérience de transplantation, remOve les embryons de the15 ° C incubateur et organiser eux selon Nieuwkoop et Faber ^19. Si elles sont plus jeunes que la fin neurula (étape 19), les laisser à température ambiante pendant 1-2 heures, jusqu'à ce qu'ils atteignent le stade 19.
3. Tamiser les embryons injectés sous un microscope à fluorescence. Sélectionner des embryons qui montrent uniforme, vive fluorescence pour l'expérience.
4. Supprimer l'encombrement et les contaminants possibles à proximité de la zone d'exploitation. Essuyez la surface d'exploitation, stéréoscopique et tous les outils avec 70% d'éthanol.
5. Une fois que les embryons sont au stade 19, retirer la membrane vitelline utilisant # 5/45 pince Dumont sous un stéréomicroscope.
   1. Retirer la membrane vitelline de 20 à 30 de chacun des donneurs et des embryons hôtes.
   2. Pour les premières expériences de transplantation de visage, il faut pratiquer avec quelques embryons pour chaque condition. La méthode est difficile et exige de la pratique prudent avant il peut être utilisé sur une plus grande échelle, rapidement et avec succès. On peut u travailp pour faire 20 greffes / expérience.
6. Déplacer embryons hôtes dans le plat de fonctionnement en utilisant une pipette de transfert en plastique gradué avec l'extrémité coupée de telle sorte que l'ouverture est bien plus large que l'embryon (au moins quelques millimètres). Soyez prudent pour éviter de toucher les embryons de bulles ou de la surface de l'eau, comme les embryons vont exploser dans la tension de surface.
7. Utilisation # 5/45 une pince pour insérer les embryons dans les creux en argile, avec la partie postérieure de l'embryon dans l'argile. Fermez doucement l'argile autour des bases de l'embryon à l'aide des pinces, laissant le quart supérieur de l'embryon, la tête, dépassant de la dépression.
8. Une fois que tous les embryons hôtes sont fixées dans leurs renfoncements, se déplacer vers l'autre côté de la plaque et commence à insérer les embryons donneurs dans leurs cavités. Répétez le processus de fixation des embryons dans leurs puits.

5. Exécution de la chirurgie de greffe de visage

1. Couteau de coupe: En tant que lame de coupe pour l'enlèvementdu tissu EAD donateurs, utiliser une aiguille capillaire de verre brisé de manière appropriée (voir l'étape 2.3 et la figure 1).
   NOTE: On peut détenir directement le capillaire entre les doigts (ce qui fonctionne bien pour les personnes ayant de petites mains) ou l'on peut monter l'aiguille dans un porte-broche insecte. Des aiguilles de tungstène Electrosharpened ¹⁷ chargés dans un support de broche peuvent être utilisés à la place d'une aiguille de tube capillaire. S'il vous plaît voir supports de quilles proposées et les aiguilles de tungstène dans le tableau des réactifs et des équipements spécifiques.
2. Sous un microscope stéréoscopique, insérer l'aiguille dans la tête de l'embryon à la gauche de la glande de ciment. L'aiguille doit être insérée en profondeur, de sorte qu'il passe à l'extérieur à partir de l'embryon, à travers la tête, et dans l'intestin antérieur. Pour transplanter l'ensemble EAD, coupes devraient s'étendre à l'extérieur de l'embryon à l'intestin antérieur. Pour les transplantations de l'ectoderme seule, coupes devraient être moins profonde et étendre seulement par l'ectoderme.
   1. Flick l'aiguille à partir de la gauche à la droite de l'diriger, sur toute la largeur de la glande de ciment. La pichenette est important que le mouvement donne une coupe nette. Reportez-vous à la figure 2A pour un résumé de la technique et la figure 2B pour une démonstration des réductions. La glande de ciment et les yeux sont des repères importants pour les coupes. L'ordre des coupes n'affecte pas le résultat et peut varier en fonction de la préférence ou l'impartialité de l'utilisateur.
3. Placer l'aiguille au début de la coupe précédente, à la frontière gauche de la glande de ciment, et actionner le pointeau vers le haut jusqu'à ce qu'il atteigne le fond de l'oeil gauche. Ceci créera une coupe verticale de la bordure gauche de la glande de ciment vers le bas de l'oeil gauche.
4. Placer l'aiguille à la frontière droite de la glande de ciment, et actionner le pointeau vers le haut jusqu'à ce qu'il atteigne le fond de l'oeil droit. Ceci créera une coupe verticale de la bordure droite de la glande de ciment vers le bas de l'oeil droit.
5. Pour exciser complètement le tissu, flick l'aiguille à partir du fond de l'oeil gauche de la partie inférieure de l'oeil droit, la création d'une coupure horizontale qui va libérer le tissu. Coupes peuvent s'étendre à l'extérieur de l'embryon à l'intestin antérieur, y compris à la fois l'ectoderme et l'endoderme dans l'expiant EAD. Sinon, des coupes peu profondes peuvent être utilisés pour ectoderme uniquement greffes EAD. Une fois que le tissu est enlevé EAD, il devrait y avoir un trou rectangulaire de l'extérieur de l'embryon dans l'intestin antérieur, qui s'étend à partir de la glande de ciment à juste au-dessous des yeux (de haut en bas). Le trou devrait s'étendre de la frontière à l'intérieur de l'œil gauche à la frontière à l'intérieur de l'œil droit (côté à l'autre). Voir la figure 2Bb.
6. Poussez délicatement le tissu excisé à la pointe de l'aiguille, et soulever à travers le tampon de la partie de la boîte contenant les embryons d'accueil. Ne pas exposer le tissu à l'air à la surface ou il sera endommagé.
7. Exciser le même tissu à partir de l'embryon hôte, comme pour le donneur. Jeter l'expiant EAD hôte ou l'enregistrer sur insertiont dans la face des bailleurs de fonds, pour les transplantations réciproques.
8. Insérez le explantation des bailleurs de fonds dans le trou de l'hôte résultant en utilisant # 5/45 forceps.
9. Une fois le tissu du donneur est correctement positionné et bien insérée, placer soigneusement un pont de verre (voir la figure 1 et la figure 2bc) sur le visage de l'embryon de tenir la greffe en place. Les extrémités du pont doivent insérer dans l'argile, le maintenant en place. Le pont devrait appliquer doucement pression sur le tissu transplanté, tels que la greffe se trouve au ras de la tête de l'hôte, sans coller sur la tête ou se trouvant au fond de la tête. La tête peut être légèrement aplatie par la lamelle, mais attention de ne pas endommager l'embryon avec trop de pression. Greffes doivent être effectués dans les 5 minutes.
   REMARQUE: Un enquêteur expérimenté peut effectuer une vingtaine de greffes par expérience, plus de 2-3 heures. Pendant cette période, les embryons vont progresser du stade 20-22. Fin de la greffe du visages à l'étape 21 ou 22 n'affecte pas les résultats. Greffes plus tard (aux stades 22-26) peuvent être faites mais sont plus difficiles que la région médiane EAD libre-crête est restreinte comme mouvements de la crête neurale crânienne dans le visage. Cohérence entre les greffes est critique.

6. Greffe du visage de récupération post-opération

1. La guérison prend généralement 2-3 heures. Laissez les embryons à la température ambiante sans être dérangés dans leurs dépressions d'argile avec les ponts de verre tenant le tissu du donneur en place.
2. Une fois les greffes ont guéri, retirer soigneusement les ponts en verre, enlever l'argile autour de la base des embryons aide de pinces, et d'utiliser un plastique diplômé pipette de transfert pour aspirer délicatement les embryons de leurs dépressions.
3. Mettez les embryons dans une boîte de Petri étiquetés de manière appropriée, à moitié rempli d'MBS 0.1x propres gentamicine.
4. Cultiver les embryons à 15 ° C ou 18 ° C pendant plusieurs jours jusqu'à ce qu'ils atteignent l'alimentation stade de têtard à l'étape 40, wpoule phénotypes faciaux peuvent être marqués.
   1. La solution de MBS de 0,1 x la gentamicine doit être changé tous les jours, et les embryons morts doivent être retirés rapidement pour éviter la contamination et de la mort d'autres embryons.
   2. La bouche s'ouvre à l'étape 40. Au stade 40-41, il faut vérifier que le tissu transplanté reste guérie à la place en regardant sa fluorescence. Greffes de temps en temps tomber, donc il faut veiller à ce que tous les embryons marqués ont le tissu du donneur en place.

Résultats

Tissu transplanté doit être complètement insérée dans la tête de l'hôte après transplantation, comme indiqué sur la figure 3A, et avoir un pont de verre placée de façon appropriée sur le visage de l'embryon, comme le montre la Figure 2bc. Le tissu du donneur transplanté doit être correctement dimensionné pour l'ouverture de l'hôte, pour la transplantation, pour réussir. Le tissu EAD ne doit pas dépasser de la tête, en aucune façon, comme on le voit su...

Discussion

Étapes critiques et les limites: La procédure de greffe du visage EAD est temps et un travail intensif. Il exige de la pratique, les mains stables, et la dextérité pour se perfectionner. Le protocole de greffe de la face repose sur la capacité des chercheurs à éliminer efficacement et le tissu de greffe. Si l'on prend trop de temps pour insérer la greffe dans le visage de l'hôte, le visage de l'hôte va commencer à se contracter et à guérir. Pinces peuvent être utilisés pour étendre dé...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pasteur pipette	VWR	14672-400	Lime Glass
Size 5 3/4 in	Cotton Plugged
Graduated Transfer Pipette	VWR	16001-180	Disposable
#5/45 forceps	Fine Science Tools by Dupont medical	11251-35	Angled 45°
Standard Pattern Forceps	Fine Science Tools	11000-20	Straight; serrated tip; stainless steel
Capillary Tubing (for needles)	FHC	30-30-1	Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID/Fiber
Cover slip	VWR	48393 252	24 x 60 mm micro cover glass;
Ficoll 400	Sigma-Aldrich	F9378
Needle Puller	Sutter Instrument Co	Needle Puller: discontinued Filament: FB300B	The most similar, currently available  needle puller is the P-97. For filaments, use Sutter 3.00 mm square box filaments, 3.0 mm wide.
Model P-80	Flaming / Brown micropipette puller
Stereomicroscope	Zeiss
Stereomicroscope Lighting by Fostec	Fostec		Use a light box with 2 fiberoptic arms.
Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26018-17	Jaw Opening Diameter: 0-1 mm
Moria Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26016-12	Jaw opening Diameter: 0-1 mm
Tungsten Needles	Fine Science Tools	10130-05	0.125 mm Rod diameter
Van Aken Plastalina	Blick	#33268-2981
Modeling Clay- white, red, or yellow
mMessage mMashine SP6 or T7 Kit	Ambion	AM1340