השתלת פנים ב<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; עוברים

Summary

טכניקה להשתלה "אקסטרים Anterior דומיין" רקמות פנים בין Xenopus laevis עובר כבר מפותחת. רקמה ניתן להעביר מהרקע ביטוי גנים אחת לאחרת, ומאפשרת הלימוד של דרישות מקומיות לפיתוח craniofacial ולאיתות אינטראקציות בין אזורי פנים.

Abstract

מומים מולדים Craniofacial להתרחש ב1 מתוך כל 700 לידה חיות, אבל אטיולוגיה ידועה לעתים רחוקות בגלל הבנה מוגבלת של פיתוח craniofacial. כדי לזהות היכן מסלולים ורקמות איתות לפעול בדפוסים של הפנים פיתוח, טכניקה 'השתלת הפנים' פותחה בעוברים של צפרדע Xenopus laevis. אזור של רקמות פנים משוערות ("אקסטרים Anterior דומיין" (EAD)) מוסר מעובר תורם בשלב tailbud, ולהשתיל לעובר מארח של אותו השלב, שממנו האזור שווה הערך הוסר. זה יכול לשמש כדי ליצור פנים chimeric בי הרקמה המארחת או תורם יש הפסד או רווח של תפקוד בגן, ו / או כוללת תווית שושלת. לאחר ריפוי, התוצאה של פיתוח היא בפיקוח, ומצביעה על תפקידים של מסלול האיתות תוך התורם או רקמות מארח שמסביב. Xenopus הוא מודל יקר ערך לפיתוח פנים, כמו אזור הפנים הוא גדול וקלותccessible להמיקרומניפולציה. ניתן assayed עוברים רבים, על פני פרק זמן קצר מאז פיתוח מתרחש במהירות. ממצאים בצפרדע רלוונטיים להתפתחות אנושית, שכן תהליכי craniofacial מופיעים נשמרים בין Xenopus ויונקים.

Introduction

כדי להבין את המנגנונים העומדים בבסיס ליקויי craniofacial לידת ^1-2, רקמות חשובות ותרומות האיתות שלהם במהלך התפתחות craniofacial חייב להיות מזוהה. בצפרדע Xenopus laevis, חלק מהפנים, כוללים את הפה וצורת נחיריים מ" אקסטרים Anterior דומיין "(EAD), שבו האאקטודרם והאנדודרם ישירות לצד זה ^3-4. EAD פועל גם כמרכז איתות להשפיע על רקמות הסובבות, כוללים הרכס העצבי גולגולתי, המהווה את הלסתות ואזורי פנים אחרים ^5. כדי לזהות את הגנים שתורמים לתפקוד EAD, טכניקה 'השתלת הפנים' פותחה, שבו רקמה מושתלת מתורם לעובר מארח, לאחר הסרת אזור המארח המתאים. בעקבות ההשתלה, וכתוצאה מפיתוח פנים הוא העריך. לכן, ההשפעות של אובדן התפקוד (LOF) או רווח של פונקציה (GOF) לגן מסוים בEAD מנותחים באופן מקומי, שבו שאר שעותEAD והגוף מורכב מרקמות מסוג בר. השתלת הגומלין יכולה להתבצע, שבו רקמה מסוג בר שהושתלה עוברים עם LOF הגלובלי או GOF בגנים ספציפיים. השתלה כבר בשימוש תכוף בXenopus וחומוס לומד ^6. לדוגמא, השתלת Xenopus התייחסה אינדוקציה homogenetic עצבית, עדשה ויכולת עצבית, והגירה רכס עצבית ^7-10. השתלת chimeric שליו חומוס נתחה פיתוח של הצלחת הקדמית העצבית, רכס עצבי קדמי, רכס עצבי, ועצמות גולגולת ^11-14. זוהי טכניקת ההשתלה הראשונה למחקר של התפתחות craniofacial Xenopus. טכניקה זו הוכיחה תפקיד רומן למעכבי Wnt Frzb1 וסהר בויסות היווצרות קרום במרתף בפה המשוער ^5. Laevis Xenopus הוא מודל אידיאלי למחקר של התפתחות craniofacial כעוברים גדולים, לפתח כלפי חוץ,nd הפנים גלויים ונגיש, המאפשרים המיקרומניפולציה והדמיה של פיתוח. מופיעים מנגנוני פיתוח פנים נשמרו, מה שמעיד כי ממצאים שנעשו בצפרדע לספק תובנות לגבי ההתפתחות אנושית ^4,15-16.

Protocol

1. ריאגנטים הכנה

1. MBS 10x: הכן 1 ליטר של 10x השתנה מלוח של ארת' (MBS) פתרון ^17. עיין בטבלת 1, ריאגנטים, חומרים, והוראות. השתמש במים מזוקקים לכל הפתרונות. מערבבים בכוס, תוך שימוש בבר ומערבב, עד לפירוק מלא. כל הפתרונות צריכים להיעשות בטמפרטורת חדר.
2. MBS 1x: לדלל של פתרון 10x MBS 100 מיליליטר ב900 מיליליטר של מים מזוקקים כדי להפוך 1 ליטר של MBS 1x. הוספת 0.7 מיליליטר של M CaCl פתרון ₂ 1.
3. 0.1x MBS: MBS 1x לדלל כדי להכין 1 ליטר של פתרון 0.5x MBS ו -2 ליטר של פתרון MBS 0.1x. ל1 ליטר של פתרון MBS 0.1x, להוסיף 1 מיליליטר של 10 מ"ג פתרון gentamycin / מיליליטר. MBS 0.1x הפתרון עם gentamycin ישמש לתרבות עובר לטווח ארוך.
4. Ficoll / MBS: הוסף 15 גרם Ficoll 400-500 מיליליטר של תמיסת 0.5x MBS. מערבבים במרץ. להוסיף סרגל מערבבים ומערבבים עד Ficoll נמס לגמרי (כמה שעות).
5. 70% אתנול: לדלל 100% אתנול 70% אתנול באמצעותמים מזוקקים.

2. הכנת כלים תפעוליים זכוכית

1. הכנת מחט: צינור נימים טען לחולץ מחט.
   1. משוך את המחטים על פי ההגדרות שמוצגים בטבלה 2: הגדרות חולץ מחט. ההגדרות הן לחולץ micropipette סאטר Instrument ושות הדגם P-80/PC וצינור נימים, כפי שמתוארים בטבלה של חומרים כימיים וציוד ספציפיים. עם זאת, הגדרות אלה הן ספציפיות לחולץ מחט סאטר, ותצטרכנה להיות מותאמים למכונות אחרות. הגדרות ניתן לקבוע באמצעות בדיקת רמפה, כפי שצוינו על ידי היצרן של המכשיר.
   2. משוך 4-6 מחטים בהכנה להליך. המחטים צריכה להיות שבורות כך שהחלק מהקצה של הכוס גמיש, דמוי שיער יוסר במלואו, שהוא בדרך כלל 2-3 מ"מ ארוך. טיפ חייב להיות קשיח יחסית, אבל עדיין צר מספיק כדי לשמש ככלי חיתוך. ראה תמונה של מחט אידיאלית באיור 1 א.
   3. אחסן את המחטים בצלחת פטרי עם פס של חימר למטה במרכז. לחץ על הפיר של כל מחט לתוך החימר, כדי להחזיקו במקום וכדי לשמור על הקצה החד השביר הרחק מהתחתית ודפנות.
2. לכלים נוספים, לקבל תלושי כיסוי זכוכית, זוג מלקחיים ארוכים סטנדרטיים דפוס, מבער בונזן, ו3-4 טפטפות פסטר זכוכית (גודל 5 ¾ ב).
3. כלי פיפטה: כדי להפוך את כלי פיפטה, להדליק את המבער בונזן ומניח את קצה הזכוכית פיפטה פסטר לחלק הכחול של הלהבה בזמן סיבובו, כך שהקצה נמס והחור לחלוטין חותמות, ויצר סוף סגור, מעוגל . הקצה המעוגל, אטום מאוחר יותר המשמש לייצור שקעים בצלחת החימר שמחזיקה את העוברים במהלך המבצע. ראה איור 1 ב.
4. גשרי זכוכית: כדי להפוך את גשרי זכוכית, להשתמש במלקחי דפוס סטנדרטיים ארוכה לנתק בזהירות 3 מ"מ על 3 מ"מ גושי זכוכית לכסות להחליק. בעוד מחזיק את פיסת להחליק לכסות עם tweezers, הנח את הזכוכית בלהבה עד שכל ארבעת הקצוות לרכך ועקומה כלפי מטה, ויוצר כיפת זכוכית זעירה. הקצוות צריכים כבר לא יהיו חדים. ראה איור 1 ג.
5. אחסנו את הגשרים להחליק את מכסה זכוכית על ידי החדרתם, קצוות למטה, לתוך פלסטלינה, המצפה את החלק התחתון של צלחת פטרי. הכנס את הגשרים כך שהחלק העליון של הגשר נשאר מעל משטח החימר. אל תלחצו חזק מדי כך שהפסקות הגשר, ולא להטביע את הגשר במלואו לתוך החומר, כי זה יכול להיות קשה להסיר. לאחר עיקור עם להבה או 70% אתנול, ניתן לעשות שימוש חוזר מניסוי הגשרים להתנסות.

3. הכנות לקראת מבצע העובר

1. בשורה צלחת קטנה 60 מ"מ פלסטיק פטרי עם פלסטלינה. בין שימושים, משטח הצלחת וחימר הוא שטף ביסודיות עם מים מזוקקים ולאחר מכן עם 70% אתנול.
   הערה: השתמש באדום, לבן או צהוב, פלסטלינה ואן Aken Plastalina, שניתן לקנות במקומיy או חנות אמנות. חימר שחור אינו מומלץ משום שהוא משחרר שאריות.
2. מלא את הצלחת עם 3% פתרון Ficoll 0.5x MBS. ריכוז מלח גבוה יותר מונע ניתוק רקמות, וFicoll פוליסכריד עוזרת לעבות את הפתרון, המסייע במחזיק את פניו בעמדה.
3. השתמש בכלי בערת פסטר פיפטה (ראה איור 1) כדי להפוך 2-3 שקעים רדודים, מ"מ בחימר, על העומק של גוף עובר שלב 20. הפוך 20-30 דיכאונות, 1-2 מ"מ זה מזה, בכל צד של הצלחת, ולכן יש בסך הכל 40-60 שקעים. תווית צד אחד LOF / GOF, והסוג בר הצד השני, על ידי גילוף ראשי תיבות לחימר עם מלקחיים.

4. הכנת עובר Preoperation

1. השג ותרבות Xenopus laevis עוברים תוך שימוש בשיטות סטנדרטיות ^17. לתיאור מפורט של בעלי הצפרדע, אנא ראה סייב et al. ¹⁷
   1. ארבעים ושמונה שעות לפני obta הניסויבביצים מצפרדעי נקבה ולבצע הפריה חוץ גופית.
   2. הזרק 0.5-1 ננוגרם של הקרום הכתיר ה-GFP-mRNA, בתוספת כל mRNA רצוי או oligonucleotides אנטי תחושה-הותאם morpholino antisense ("morpholinos") בשלב תא אחד או ל 2 תאים בשלב 2 תא. שלב התא אחד נמשך כ 70-90 דקות. הזרק בהיקף כולל של 1-3 NL. במקומו של קידוד רנ"א לחלבון פלואורסצנטי (כגון GFP או RFP-RNA), אפשר להזריק morpholino FITC שכותרתו או dextran שכותרתו fluorescently. הקרינה היא חשובה לקביעה אם מושתל מרפא רקמות ונשאר בראש.
   3. ניתן להכין כתרים mRNA מפלסמיד לינארית באמצעות SP6 mMessage mMachine או ערכת T7. Morpholinos יכול להיות מתוכנן ולהזמין באמצעות LLC כלים ג'ין. כמות morpholino הנדרש לאפקט הרצוי צריכה להיקבע עבור כל גן ^18.
   4. אחסן את העוברים הוחדרו ב15 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות, עד שהם מגיעים שלב 19-20. (Fאו את כל שלבים שלאחר מכן, עובר שלב בהתאם לטבלה רגילה של Xenopus laevis ידי Nieuwkoop ופייבר ^19.)
      הערה: ביום של הניתוח, שני עוברי הנמען והתורם חייבים להיות בתוך שלב אחד מכל אחד אחר להשתלות לעבוד בצורה אופטימלית. עם זאת, עובר מוזרק עם morpholinos ("morphants") לפעמים לפתח לאט יותר מסוג בר או לשלוט עוברי morphant, מה שהופך את צורך לתאם את ניסויים ולכן הן morphant ועוברי סוג בר נמצאים באותו השלב. Morphants ייתכן שיהיה הצורך לשמור על טמפרטורה גבוהה יותר עבור 12-24 שעות לפני ההליך. כדי להגדיל את הסיכוי שניתן למצוא עוברים בשלבי התאמה, יכול להישמר עובר בכמה טמפרטורות. עשרים וארבע שעות שקדמו לניסוי, יש לחלק את העוברים לכמה מנות, וmorphants המקום ב18-20 מעלות צלזיוס ועוברי סוג בר ב15-18 ° C.
2. ביום של ניסוי השתלה, remove עובר מן חממת C ° the15 ולביים אותם על פי Nieuwkoop ופייבר ^19. אם הם צעירים יותר מneurula המאוחר (שלב 19), להשאיר אותם בטמפרטורת חדר למשך 1-2 שעות, עד שהם מגיעים שלב 19.
3. מסך עובר המוזרק תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בחר עוברים שמראים הקרינה אחידה, בהירה לצורך הניסוי.
4. להסיר את העומס ומזהמים אפשריים בסמוך לאזור התפעולי. נגב את פני השטח ההפעלה, סטראו ואת כל כלים עם 70% אתנול.
5. ברגע שהם עובר בשלב 19, להסיר את קרום vitelline באמצעות # 5/45 מלקחיים דומון תחת סטראו.
   1. להסיר את קרום vitelline של 20-30 של כל אחד מתורמים ועוברי מארח.
   2. לכמה ניסויי השתלת פנים הראשונים, צריך להתאמן עם כמה עוברים לכל מצב. השיטה היא מאתגרת ודורשת תרגול זהיר לפני שהוא יכול לשמש בקנה מידה גדולה יותר, במהירות ובהצלחה. אחד יכול לעבוד up לעושה 20 השתלות / ניסוי.
6. הזז עוברי מארח לתוך צלחת ההפעלה באמצעות פלסטיק סיים טפטפת העברה עם הקצה מנותק כך שהפתיחה היא הרבה יותר רחבה מעובר (לפחות כמה מילימטרים). להיות זהיר כדי להימנע מלגעת בעוברים לבועות או המשטח של המים, כעוברים יתפוצצו במתח הפנים.
7. השתמש # 5/45 מלקחיים כדי להכניס את העוברים לתוך שקעי החימר, עם האחורי של העובר בחימר. בעדינות לסגור את החימר מסביב לבסיסים של העובר באמצעות המלקחיים, והשאיר את הרבע העליון של העובר, הראש, בולט מהדיכאון.
8. ברגע שכל עוברי המארח מובטחים בשקעים שלהם, לעבור לצד השני של הצלחת האחר ולהתחיל להכניס את עוברי תורם לשקעים שלהם. חזור על התהליך של הבטחת העוברים בבארות שלהם.

5. ביצוע ניתוח השתלת פן

1. חיתוך סכין: כסכין חיתוך להסרתשל רקמת EAD תורם, השתמש במחט שבורה כראוי זכוכית נימים (ראה שלב 2.3 ואיור 1).
   הערה: אפשר ישירות להחזיק את הנימים בין אצבעות (זה עובד גם לאנשים עם ידיים קטנות) או אחד יכול לרכב את המחט בבעל סיכת חרק. מחטי טונגסטן Electrosharpened ¹⁷ נטענות לתוך בעל סיכה יכולות לשמש במקום מחט צינור נימים. אנא ראה מחזיקי סיכה הציעו ומחטים טונגסטן בטבלה של חומרים כימיים וציוד ספציפיים.
2. תחת סטראו, הכנס את המחט לתוך ראשו של העובר בצד השמאל של בלוטת המלט. המחט צריכה להיות מוכנסת לעומק, כך שהוא עובר מחוץ לעובר, בראשו, ולתוך המעי הקדמי. להשתיל כל EAD, קיצוצים צריכים להאריך מהחלק החיצוני של העובר למעי הקדמי. להשתלות האאקטודרם בלבד, הקיצוץ צריך להיות רדוד יותר ולהאריך רק דרך האאקטודרם.
   1. פליק המחט מהשמאל לצד ימין שלבראש, לכל הרוחב של בלוטת המלט. המצליף חשוב כמו התנועה נותנת חתך נקי. עיין באיור 2 א לסיכום של הטכניקה ואיור 2 ב להפגנה של הקיצוצים. בלוטת המלט והעיניים הן ציוני דרך חשובה לקיצוצים. סדר הקיצוצים אינו משפיע על התוצאה ויכול להשתנות בהתאם להעדפה של המשתמש או handedness.
3. מניחים את המחט בתחילת הקיצוץ הקודם, בגבול השמאלי של בלוטת המלט, וקפיץ המחט כלפי מעלה עד שהוא מגיע לחלק התחתון של עין השמאל. הפעולה זו תיצור חתך אנכי מהגבול השמאלי של בלוטת המלט לחלק התחתון של עין השמאל.
4. מניחים את המחט בגבול תקין של בלוטת המלט, וקפיץ המחט כלפי מעלה עד שהוא מגיע לחלק התחתון של עין ימין. הפעולה זו תיצור חתך אנכי מהגבול הימני של בלוטת המלט לחלק התחתון של עין ימין.
5. כדי להסיר את הריקמה, Flic מלאk את המחט מהחלק התחתון של העין השמאלית לחלק התחתון של עין ימין, יצירת חתך אופקי שישחרר את הרקמות. חתכים יכולים להאריך מהחלק החיצוני של העובר למעי הקדמי, כוללים שני האאקטודרם והאנדודרם בexplant EAD. לחלופין, חתכים רדודים יכולים לשמש להאאקטודרם בלבד השתלות EAD. לאחר רקמת EAD מוסרת, לא אמור להיות חור מלבני מהחלק החיצוני של העובר לתוך המעי הקדמי, המשתרע מבלוטת המלט ממש מתחת לעיניים (מלמעלה למטה). החור צריך להאריך מהגבול הפנימי של עין השמאל לגבול הפנימי של העין הימנית (צד לצד). ראה איור 2Bb.
6. דחף בעדינות את הרקמה נכרתה בקצה המחט, והרם אותו באמצעות המאגר לחלק מהמנה המכילה עוברי מארח. אל תחשוף את הרקמות לאוויר לפני השטח או שזה יהיה להיות פגום.
7. בלו אותה רקמה מעובר המארח, כמו לתורם. מחק את explant EAD המארח או לשמור אותו לinsert אל הפנים התורמים, להשתלת גומלין.
8. הכנס את explant התורם לתוך חור מארח וכתוצאה מכך באמצעות # 5/45 מלקחיים.
9. ברגע שהרקמות התורמות ממוקמת כראוי ובאופן מלא מוכנס, זהירות במקום גשר זכוכית (ראה איור 1 ואיור 2Bc) על פניו של העובר כדי להחזיק את ההשתלה במקום. הקצוות של הגשר צריכים להכניס לתוך החימר, מחזיקים אותו במקום. הגשר צריך בעדינות יפעיל לחץ על הרקמה המושתלת, כך שההשתלה טמונה סומק עם הראש המארח, בלעדיו מבצבץ מתוך הראש או שכיבה עמוקה בתוך הראש. הראש יכול להיות שטוח במקצת על ידי להחליק את המכסה, אבל להיזהר שלא לגרום נזק לעובר עם יותר מדי לחץ. השתלות צריכה להתבצע תוך 5 דקות.
   הערה: חוקר מנוסה יכול לבצע כעשרים השתלות לכל ניסוי, על 2-3 שעות. במהלך תקופה זו את העוברים יהיו התקדמות מהשלב 20-22. השלמת השתלת הפניםים בשלב 21 או 22 אינו משפיע על תוצאות. השתלות בהמשך (בשלבי 22-26) יכולות להיעשות אך קשות יותר כמו אזור קו האמצע EAD ללא פסגה הוא הצטמצם כמהלכי רכס עצביים גולגולתי בפרצוף. עקביות לאורך השתלות היא קריטית.

6. התאוששות לאחר ניתוח השתלת הפנים

1. ריפוי בדרך כלל לוקח 2-3 שעות. השאר את העוברים בטמפרטורת חדר ללא הפרעה בשקעי החימר שלהם עם גשרי הזכוכית מחזיקים את הרקמות התורמות במקום.
2. לאחר ההשתלות הגלידו, להסיר בזהירות את גשרי הזכוכית, להסיר את החומר מסביב הבסיס את העוברים באמצעות מלקחיים, ולהשתמש בפלסטיק סיים טפטפת העברת ואקום בעדינות את העוברים מהשקעים שלהם.
3. שים את העוברים לתוך צלחת פטרי שכותרתו כראוי, מלא למחצה בMBS 0.1x הנקי עם gentamycin.
4. לגדל את העוברים ב15 ° C או 18 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים עד שהם מגיעים להאכיל את שלב ראשן בשלב 40, Wיכולים להיות הבקיע פנוטיפים פנים תרנגולת.
   1. MBS 0.1x הפתרון עם gentamycin צריך להיות שונה מדי יום, וכל עוברים מתים יש להסיר ללא דיחוי על מנת למנוע זיהום ומוות של עוברים אחרים.
   2. הפה נפתח בשלב 40. בשלב 40-41, יש לבדוק כי הרקמה המושתלת נשארת נרפאה במקום על ידי הצפייה בקרינה שלה. השתלות מדי פעם ליפול החוצה, ולכן יש להבטיח שלכל העוברים הבקיעו את הרקמות התורמות במקום.

תוצאות

רקמות המושתלות צריכים להיות מוכנסות במלואו לתוך ראש המארח לאחר ההשתלה כפי שמוצגות באיור 3 א, ויש לי גשר זכוכית להציב כראוי על פניו של העובר, כפי שמוצגים באיור 2Bc. הרקמות המושתלות התורמות חייבים להיות בגודל נכון לפתיחה המארחת, להשתלה כדי להצליח. רקמת E...

Discussion

צעדים ומגבלות קריטיים: הליך השתלת הפנים EAD הוא זמן ועבודה אינטנסיבי. זה דורש תרגול, ידיים יציבים, ומיומנות מושלמת. פרוטוקול השתלת פנים מסתמך על יכולתו של החוקר כדי להסיר ביעילות וברקמות להשתלה. אם אחד לוקח יותר מדי זמן להכניס את ההשתלה בפרצופו של המארח, את פני המאר?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pasteur pipette	VWR	14672-400	Lime Glass
Size 5 3/4 in	Cotton Plugged
Graduated Transfer Pipette	VWR	16001-180	Disposable
#5/45 forceps	Fine Science Tools by Dupont medical	11251-35	Angled 45°
Standard Pattern Forceps	Fine Science Tools	11000-20	Straight; serrated tip; stainless steel
Capillary Tubing (for needles)	FHC	30-30-1	Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID/Fiber
Cover slip	VWR	48393 252	24 x 60 mm micro cover glass;
Ficoll 400	Sigma-Aldrich	F9378
Needle Puller	Sutter Instrument Co	Needle Puller: discontinued Filament: FB300B	The most similar, currently available  needle puller is the P-97. For filaments, use Sutter 3.00 mm square box filaments, 3.0 mm wide.
Model P-80	Flaming / Brown micropipette puller
Stereomicroscope	Zeiss
Stereomicroscope Lighting by Fostec	Fostec		Use a light box with 2 fiberoptic arms.
Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26018-17	Jaw Opening Diameter: 0-1 mm
Moria Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26016-12	Jaw opening Diameter: 0-1 mm
Tungsten Needles	Fine Science Tools	10130-05	0.125 mm Rod diameter
Van Aken Plastalina	Blick	#33268-2981
Modeling Clay- white, red, or yellow
mMessage mMashine SP6 or T7 Kit	Ambion	AM1340