顔面移植<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚

要約

アフリカツメガエル胚の間の顔の組織が ​​開発された「エクストリーム前部ドメイン」移植する技術。組織は、頭蓋顔面および開発のための顔領域間の相互作用をシグナリングするための地域の要件の研究を可能にする、別に1つの遺伝子発現のバックグラウンドを移動させることができる。

要約

頭蓋顔面の先天性欠損症は、すべて700出生のうち1つで発生したが、病因はほとんどのため、頭蓋顔面の開発の限られた理解に知られていない。シグナル伝達経路や組織が ​​発達顔のパターン形成中に行動する場所を特定するには、「顔面移植」技術はカエルアフリカツメガエルの胚で開発された。推定ティッシュ（「エクストリーム前方ドメイン」（EAD））の領域は、尾芽段階でドナー胚から除去され、同等の領域が除去された同じステージの宿主胚に移植する。これは、ホストまたはドナー組織は遺伝子機能の損失又は利得を有し、および/または系統標識を含むキメラ面を生成するために使用することができる。顔領域を容易に大規模であり、次のように治癒した後、現像の結果を監視し、ドナー又は周囲の宿主組織内シグナル伝達経路の役割を示している。 アフリカツメガエルは 、顔の開発のための貴重なモデルであるマイクロマニピュレーション用ccessible。多くの胚は、開発が急速に起こるため、短い期間にわたって、アッセイすることができる。頭蓋顔面のプロセスは、アフリカツメガエルと哺乳類の間で保存現れるので、カエルでの調査結果は、人間開発に関連している。

概要

頭蓋顔面の先天性欠損症^1〜2のメカニズムを理解するために、頭蓋顔面の開発における重要な組織とそのシグナル伝達の寄与が特定されなければならない。カエルアフリカツメガエル、外胚葉と内胚葉、直接^3-4並置されている「エクストリーム前歯ドメイン」（EAD）、から口や鼻の穴の形を含む顔の一部では、。 EADはまた、顎や他の顔領域^5を形成^し 、頭蓋神経堤など、周囲の組織に影響を与えるために、シグナリング·センターとして機能します。組織が対応するホスト領域を除去した後に、ホスト胚にドナーから移植されている場合、EADの機能に寄与する遺伝子を同定するために、「顔面移植」技術は、開発されました。移植後、顔の発達を生じることは評価される。このように、機能の喪失（LOF）またはEAD内の特定の遺伝子のための機能（GOF）の利得の効果は、局部的に分析したところ、Hの残りの部分EADと体は、野生型組織から構成されている。野生型組織特異的遺伝子のグローバルLOFまたはGOFを有する胚に移植される移植逆数を行うことができる。移植は、しばしば、アフリカツメガエルおよびニワトリの試験⁶で用いられてきた。例えば、 アフリカツメガエルの移植が単純発生の神経誘導、レンズや神経の能力、および神経堤の移行^7月10日に対処しています。ウズラ、ひよこキメラ移植は、前神経板、前方神経尾根、神経堤、および頭蓋骨^11月14日の開発を分析しました。これは、この技術は、推定口⁵に基底膜形成の調節におけるWnt阻害剤Frzb1、クレセントための新たな役割を実証してきました。アフリカツメガエルにおける頭蓋顔面の開発研究のための最初の移植技術です。 アフリカツメガエル頭蓋顔面の開発の研究のための理想的なモデルです。胚が大きいように、外部の開発ND顔は、開発のマイクロマニピュレーションとイメージングを可能に容易に見ることができる。顔の開発の基礎となるメカニズムはカエルで行われた調査結果は、人間開発^4,15-16への洞察を提供することを示し、保存され表示されます。

プロトコル

1。試薬の調製

1. 10倍のMBS：バース生理食塩水（MBS）溶液¹⁷修正10倍の1リットルを準備します。 表1、試薬、成分、および手順を参照してください。すべてのソリューションのために、蒸留水を使用してください。完全に溶解するまで、撹拌棒を使用して、ビーカーに混ぜる。すべての溶液は室温でなされるべきである。
2. 1X MBS：1X MBS 1リットルを作るために蒸留水900ミリリットルに100ミリリットル10倍のMBS溶液を希釈。 1 M CaCl ₂溶液の0.7ミリリットルを追加します。
3. 0.1×MBS：希釈1×MBS 0.5×MBS溶液および0.1×MBS溶液の2 LのL 1を調製する。 0.1×MBS溶液1リットルに、10 mg / mlのゲンタマイシン溶液1mlを加える。ゲンタマイシンと0.1×MBS溶液は、長期間の胚の培養に使用される。
4. フィコール/ MBSは：0.5×MBS溶液500mlにフィコール400の15グラムを追加します。積極的に混ぜる。攪拌棒を追加し、フィコールが完全に（数時間）に溶解するまで混合する。
5. 70％エタノール：70％エタノール、100％エタノールを用いて希釈する蒸留水。

2。ガラス営業ツールの準備

1. 針の準備：ニードルプラーにキャピラリーチューブをロードします。
   1. ニードルプラー設定： 表2に示されている設定に応じて針を引っ張る。特定の試薬や機器の表で説明するように設定は、サターInstrument社モデルP-80/PCマイクロピペットプラーとキャピラリーチューブのためのものです。しかし、これらの設定はサター針プラーに固有であり、他のマシンのために調整する必要があります。マシンの製造業者によって指定された設定は、ランプ試験を用いて決定することができる。
   2. 手続きの準備のために4〜6針を引っ張る。針は通常、長い2〜3ミリメートルである、ガラスチップの柔軟な、髪の毛のような部分が完全に除去されるように分割する必要があります。先端部は比較的硬質であるが、切削工具として使用するのに十分に狭い静止しなければならない。 図1Aに理想的な針の写真を参照してください。
   3. 中央下に粘土のストリップとペトリ皿に針を保管してください。所定の位置に保持するようにして離れて底部及び側部からの脆弱な鋭い先端を保つために、粘土に各針のシャフトを押してください。
2. 追加ツールの場合は、長い標準パターン鉗子、ブンゼンバーナー、および3-4ガラスパスツールピペット（サイズは5¾）のペアガラスカバースリップを得る。
3. ピペットツール：ピペットツールを作成するには、ブンゼンバーナーを点灯し、先端が溶けて穴が完全にシール、閉じられた、丸い端部を形成するように、それを回転させながら炎の青い部分にガラスパスツールピペットの先端を配置。丸みを帯びた、密封されたチップは、後で動作中に胚を保持する粘土皿にくぼみを作るために使用される。 図1Bを参照してください。
4. ガラスの橋：ガラスの橋を作るためには、慎重にカバースリップガラスの3ミリメートルの塊で3ミリメートルを解消するために長い標準パターン鉗子を使用しています。 Tでカバースリップの一部を保持しながら、すべての4つのエッジが下方向に柔らかく曲線までweezers、小さなガラスのドームを形成する、炎でガラスを配置します。エッジはもはや鋭くないはず。 図1Cを参照してください。
5. それらを挿入することにより、ガラスカバースリップ橋を保存する、ペトリ皿の底の内側を覆う、粘土に、ダウンエッジ。橋の上に粘土表面上に残るように、ブリッジを挿入します。このような橋が壊れていることをあまりにもハードにプッシュしないでください、それは除去が困難な場合がありますので、完全に、粘土に橋を埋め込まない。火炎又は70％エタノールで殺菌した後、ブリッジは実験毎に再利用することができる。

3。胚操作の​​準備

1. 粘土の小さな60ミリメートルのプラスチック製ペトリ皿を並べる。使用の間、皿および粘土表面は十分に70％エタノールで、次いで蒸留水で洗浄する。
   注：にローカルで購入することができますを使用し、赤、白や黄色、バンAken Plastalinaモデリング粘土、Yまたは美術店。それが残留を解放するため、黒色の粘土はお勧めできません。
2. 3％のFicoll 0.5X MBS溶液で、皿を埋める。より高い塩濃度は、組織解離を防止し、多糖フィコール位置に顔を保持するのを補助する溶液を増粘するのに役立つ。
3. 燃え上がったパスツールピペットツールを使用して、ステージ20胚本体の深さ約粘土の浅い、2〜3mmの窪みを作 ​​るために（ 図1を参照）。お皿の両側に、離れて20から30の凹部1-2 mmで作るので、40〜60の凹部の合計があります。ピンセットで粘土にイニシャルを彫刻することにより、1辺LOF / GOF、反対側の野生型にラベルを付けます。

4。術前の胚の準備

1. 入手して、文化、アフリカツメガエルは、標準的な方法^17を使用して胚ツメガエル 。カエルの飼育の詳細については、SIVE らを参照してください^。17
   1. 48時間の実験obta前にメスのカエルからの卵と体外受精で行う。
   2. 1細胞期または2細胞期の2細胞に0.5〜1キャップ膜のGFP mRNAのNGに加え、任意のmRNAまたはアンチセンスモルフォリノで修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（「モルフォリノ」）を注入する。 1細胞期には約70〜90分持続します。 1-3 NLの総容量を注入する。 （例えば、GFPまたはRFP RNAのような）蛍光タンパク質をコードするRNAの代わりに、一方がFITC標識モルホリノ又は蛍光標識デキストランを注入することができる。蛍光は、組織の治癒を移植し、ヘッドに残っているか否かを判定するために重要である。
   3. キャップされたmRNAは、mMessage mMachine T7またはSP6のキットを用いて線状化プラスミドから調製することができる。モルホリノは、遺伝子ツールLLCを通じて設計し、注文することができます。所望の効果のために必要モルホリノの量は、各遺伝子¹⁸のために決定されなければならない。
   4. 彼らは、ステージ19〜20に到達するまで、48時間15℃で注入した胚を保存する。 （Fまたはそれ以降のすべてのステップを、段階の胚Nieuwkoopとフェーバー¹⁹によるアフリカツメガエルの通常のテーブルによる。）
      注：移植が最適に機能するためには、手術当日に、両方の受信者とドナー胚は、互いに1ステージ内でなければなりません。しかし、モルフォリノ（「モルファント」）を注入した胚は、時々、よりゆっくりと野生型よりも開発したり、モルファント胚を制御するので、モルファントと野生型の胚の両方が同じ段階にあることが必要で、実験を調整すること。モルファントは、従来の手順と12〜24時間、より高い温度に維持される必要があり得る。胚が一致する段階で見つけることができる可能性を高めるために、胚は、いくつかの温度で維持することができる。実験前に二十四時間、1は15〜18℃で18〜20℃、野生型の胚で、いくつかの皿、および場所モルファントに胚を分割しなければならない
2. 移植実験の日に、レムthe15℃のインキュベーターから胚オベとNieuwkoopとフェーバー¹⁹に応じてそれらを上演。彼らは後半神経胚（ステージ19）よりも若いしている場合、彼らはステージ19に到達するまで、1〜2時間室温でそれらを残す。
3. 蛍光顕微鏡下で注入した胚を選別。実験のための統一、明るい蛍光を示す胚を選択します。
4. 動作領域に近いクラッター、可能な汚染物質を除去する。 70％エタノールで操作面、実体顕微鏡およびすべてのツールを拭う。
5. 胚はステージ19になったら、実体顕微鏡下で＃45分の5デュモンの鉗子を使用して、卵黄膜を除去します。
   1. ドナーとホスト胚の各20〜30の卵黄膜を除去します。
   2. 最初のいくつかの顔面移植実験のために、1は、各条件のためのいくつかの胚で練習してください。この方法は、困難であり、それは、迅速かつ首尾よく、より大規模に使用する前に慎重に練習を必要とする。一つは、Uを働かせることができる20移植/実験をすることをP。
6. プラスチックを使用して、オペレーティング皿にホスト胚を移動し開口部が胚（少なくとも数ミリ）よりもはるかに広いなるようthatカットオフチップでトランスファーピペットを卒業した。胚は表面張力に爆発するように、気泡や水面に胚に触れないように注意してください。
7. 粘土中の胚の後部に、粘土凹部に胚を挿入するために＃45分の5ピンセットを使用してください。優しくうつ病から突出、胚の上四半期、頭を残して、ピンセットを用いて胚のベースの周りに粘土を閉じます。
8. すべてのホストの胚は、それらの凹部内に固定されると、プレートの反対側に移動し、その凹部にドナー胚を挿入し始める。そのウェル中の胚を確保するプロセスを繰り返します。

5。顔面移植手術を行う

1. ナイフをカット：除去するための切断ナイフなどのドナーEAD組織の適切割れたガラスキャピラリーニードル（ステップ2.3および図1参照 ）を使用します。
   注：一つは、直接指の間の毛管を保持することができます（これは小さな手を持つ人々に適しています）、または1は、昆虫のピンホルダーに針を取り付けることができます。ピンホルダーに装填Electrosharpenedタングステン針¹⁷の代わり^に毛細管針を用いてもよい。具体的な試薬および器具の表で示唆ピンホルダー、タングステン針を参照してください。
2. 実体顕微鏡下では、セメント腺の左にある胚の頭の中に針を挿入します。それは胚の外側から、頭部を通って、腸に通過するように針が深く挿入する必要があります。全体EADを移植するために、カットは前腸に胚の外側から拡張する必要があります。外胚葉のみの移植のため、カットが浅くあるべきであり、唯一の外胚葉を貫通している。
   1. 左から右側に針をフリックセメント腺の幅全体にわたって、頭。動きがきれいにカットを与えるようにフリックが重要です。カットのデモンストレーションのための技術と、図2Bの概要については、 図2Aを参照してください。セメント腺と目がカットのための重要なランドマークです。カットの順番は結果に影響しませんし、ユーザーの好みや利き手によって異なる場合があります。
3. セメント腺の左の境界で、前のカットの開始時に針を置き、それは、左眼の下に到達するまで上方向に針をフリック。これは、左眼の下にセメント腺の左の境界からの垂直カットを作成します。
4. セメント腺の右側の境界線に針を置き、それが右目の底部に到達するまで、上方向に針をフリック。これは、右眼の下にセメント腺の右側の境界線からの垂直カットを作成します。
5. 完全に組織、警察官を切除組織を解放する水平カットの作成、右目の下へ、左眼の下から針をk個。カットはEAD外植片における外胚葉と内胚葉の両方を含む、前腸に胚の外側から拡張することができます。代わりに、浅いカットは外胚葉のみのEAD移植のために使用することができます。 EAD組織が除去されると、ちょうど目（上から下）は、以下にセメント腺からストレッチ、前腸への胚の外側から長方形の穴があるはずです。穴は、右眼（左右に）の内側の境界線に、左眼の内側の境界から拡張する必要があります。 図2Bbはを参照してください。
6. そっと針の先端の切除組織を押して、ホスト胚を含む皿の部分にバッファを介して持ち上げます。表面の空気に組織をさらさないでください、またはそれが破損します。
7. ドナーに関しては、宿主胚と同じ組織を切除する。ホストEAD外植片を廃棄するか、inserに保存相互の移植のために、ドナーの顔をトン。
8. ＃45分の5ピンセットを用いて結果の上位穴にドナー外植片を挿入します。
9. ドナー組織が ​​正しい位置に完全に挿入されると、慎重に所定の位置に移植を保持するために、胚の顔の上に（ 図1と図2BCを参照）は、ガラスの橋を置く。橋の両端が所定の位置に保持している、粘土に挿入する必要があります。ブリッジは優しく移植は、それが頭から突き出またはディープヘッド内にあることなく、ホストヘッドと面一に位置するように移植された組織に圧力を適用する必要があります。頭が少しカバースリップにより平坦ますが、あまりにも多くの圧力で胚を傷つけないように注意してくださいすることができます。移植は5分以内に行われるべきである。
   注：経験のある研究者は2〜3時間かけて、実験あたり約20の移植を行うことができます。この期間中の胚は、ステージ20〜22から進行する。顔面移植を完了ステージ21または22のSは、アウトカムに影響を与えません。 （ステージ22〜26時）以降の移植が行われますが、クレスト·フリーEADの正中領域が顔に頭蓋神経堤移動するときに狭くなるようにより困難であることができます。移植間の一貫性が重要です。

6。顔面移植手術後の回復

1. 治癒は一般的に2〜3時間かかります。ガラスの橋が所定の位置に、ドナー組織を保持しているとの粘土凹部に邪魔されずに、室温での胚のままにしておきます。
2. 移植が治癒した後、慎重に、ガラスの橋を削除ピンセットを用いて胚のベース付近から粘土を削除し、プラスチックを使用して静かに彼らのくぼみから胚を真空トランスファーピペットを卒業した。
3. 半分ゲンタマイシンをクリーン0.1×MBSで満たされた適切に標識されたペトリ皿の中に胚を置く。
4. 彼らはステージ40に供給するオタマジャクシ段階に到達するまで、15℃または18℃での胚は、W、数日間成長鶏の顔の表現型を採点することができる。
   1. ゲンタマイシンを0.1×MBS液を毎日交換する必要があり、デッド胚は、他の胚の汚染と死を防ぐために、速やかに削除する必要があります。
   2. 口の中には、ステージ40に開口している。段階40〜41で、1が移植された組織は、その蛍光を表示して、所定の位置に癒さままであることを確認する必要があります。移植が時折落ちるので、1は、すべての得点の胚が所定の位置に、ドナー組織を持っていることを確認する必要があります。

結果

図3Aに示すように、移植された組織は、完全に移植後に宿主ヘッド内に挿入されるべきであり、 図2BCに示すように、ガラスブリッジは、適宜、胚の顔の上に配置されている。移植を成功させるために移植されたドナー組織が正しく、ホストオープニングサイズにする必要があります。 図3B及び3Cに見られるようにEAD組織は、どのような方法?...

ディスカッション

重要なステップと制限：EADの顔面移植の手順は時間であり、集中して作業。それは完璧に練習、着実に手や器用さを必要とします。顔面移植プロトコルは、効率的に組織を除去し、移植する研究者の能力に依存しています。 1ホストの顔を移植を挿入するためには長すぎるがかかる場合は、ホストの顔は収縮し、癒すために開始されます。鉗子は、微妙に顔領域を拡張するために使用す...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pasteur pipette	VWR	14672-400	Lime Glass
Size 5 3/4 in	Cotton Plugged
Graduated Transfer Pipette	VWR	16001-180	Disposable
#5/45 forceps	Fine Science Tools by Dupont medical	11251-35	Angled 45°
Standard Pattern Forceps	Fine Science Tools	11000-20	Straight; serrated tip; stainless steel
Capillary Tubing (for needles)	FHC	30-30-1	Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID/Fiber
Cover slip	VWR	48393 252	24 x 60 mm micro cover glass;
Ficoll 400	Sigma-Aldrich	F9378
Needle Puller	Sutter Instrument Co	Needle Puller: discontinued Filament: FB300B	The most similar, currently available  needle puller is the P-97. For filaments, use Sutter 3.00 mm square box filaments, 3.0 mm wide.
Model P-80	Flaming / Brown micropipette puller
Stereomicroscope	Zeiss
Stereomicroscope Lighting by Fostec	Fostec		Use a light box with 2 fiberoptic arms.
Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26018-17	Jaw Opening Diameter: 0-1 mm
Moria Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26016-12	Jaw opening Diameter: 0-1 mm
Tungsten Needles	Fine Science Tools	10130-05	0.125 mm Rod diameter
Van Aken Plastalina	Blick	#33268-2981
Modeling Clay- white, red, or yellow
mMessage mMashine SP6 or T7 Kit	Ambion	AM1340