Los trasplantes faciales en<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Los embriones

Resumen

Una técnica para el trasplante "Extreme anterior Dominio" tejido facial entre Xenopus laevis embriones se ha desarrollado. Los tejidos pueden moverse de un fondo de la expresión génica en otro, lo que permite el estudio de las necesidades locales para el desarrollo craneofacial y de señalización interacciones entre las regiones faciales.

Resumen

Defectos congénitos craneofaciales presentan en 1 de cada 700 nacidos vivos, pero la etiología rara vez se conoce debido a la limitada comprensión del desarrollo craneofacial. Identificar donde las vías de señalización y tejidos actúan durante modelado de la cara en desarrollo, una técnica de 'trasplante de cara' ha sido desarrollado en embriones de la rana Xenopus laevis. Una región de tejido facial presuntiva (el "extremo anterior de dominio" (EAD)) se retira de un embrión en la etapa de donantes tailbud, y se trasplanta a un embrión de acogida de la misma fase, de la que la región equivalente se ha eliminado. Esto puede ser usado para generar una cara quimérico donde el tejido del huésped o de un donante tiene una pérdida o ganancia de función en un gen, y / o incluye una etiqueta de linaje. Después de la curación, el resultado del desarrollo se controla, y indica funciones de la vía de señalización dentro de la donante o tejidos del huésped circundantes. Xenopus es un modelo valioso para el desarrollo de la cara, como la región facial es grande y fácilmente unccessible de micromanipulación. Muchos embriones se pueden ensayar, durante un período de tiempo corto ya que el desarrollo se produce rápidamente. Los hallazgos en la rana son relevantes para el desarrollo humano, ya que los procesos craneofaciales aparecen conservadas entre Xenopus y mamíferos.

Introducción

Para comprender los mecanismos subyacentes defectos craneofaciales congénitos ^1-2, tejidos importantes y sus contribuciones de señalización durante el desarrollo craneofacial debe identificarse. En la rana Xenopus laevis, parte de la cara, incluyendo la boca y nariz de la forma "Extreme Anterior Domain" (EAD), donde ectodermo y endodermo se yuxtaponen directamente ^3-4. El EAD también actúa como un centro de señalización para influir en los tejidos circundantes, incluyendo la cresta neural craneal, que forma las mandíbulas y otras regiones faciales ^5. Para identificar los genes que contribuyen a la función de EAD, una técnica 'trasplante de cara' fue desarrollado, donde el tejido es trasplantado de un donante en un embrión de acogida, después de la eliminación de la región de host correspondiente. Tras el trasplante, dando como resultado el desarrollo facial se evaluó. Por lo tanto, los efectos de la pérdida de la función (LOF) o ganancia de función (GOF) para un gen específico en el EAD se analizaron localmente, donde el resto de la head y el cuerpo está compuesto de tejido de tipo salvaje. El trasplante de reciprocidad se puede realizar, donde el tejido de tipo salvaje se trasplanta en embriones con LOF global o GOF en genes específicos. El trasplante se ha utilizado con frecuencia en Xenopus y pollo estudia ^6. Por ejemplo, el trasplante de Xenopus se ha ocupado de la inducción homogenetic neural, la lente y la competencia de los nervios, y la migración de la cresta neural ^7-10. Quail-chick injerto quimérico ha analizado el desarrollo de la placa neural anterior, cresta neural anterior, la cresta neural, y los huesos craneales ^11-14. Esta es la primera técnica de trasplante para el estudio del desarrollo craneofacial en Xenopus. Esta técnica ha demostrado un nuevo papel para los inhibidores de Wnt Frzb1 y la Media Luna en la regulación de la formación de la membrana basal en la boca de presunción ^5. Xenopus laevis es un modelo ideal para el estudio del desarrollo craneofacial como embriones son grandes, desarrollar externamente, unnd la cara es fácilmente visible, lo que permite la micromanipulación y la imagen del desarrollo. Mecanismos que subyacen el desarrollo facial aparecen conservada, lo que indica que los hallazgos realizados en la rana dar una idea de desarrollo humano ^4,15-16.

Protocolo

1. Reactivos Preparación

1. 10x MBS: Preparar 1 L de 10x Modificado Saline (MBS) de Barth solución ^17. Consulte la Tabla 1, los reactivos, los ingredientes y las instrucciones. Use agua destilada para todas las soluciones. Mezclar en un vaso de precipitados, con una barra de agitación, hasta completa disolución. Todas las soluciones se deben hacer a temperatura ambiente.
2. 1x MBS: Diluir 100 ml de solución 10x MBS en 900 ml de agua destilada para preparar 1 l de 1x MBS. Añadir 0,7 ml de solución de CaCl M 1 _2.
3. 0,1 X. MBS: Diluir 1x MBS para preparar 1 litro de solución de 0.5x MBS y 2 L de 0,1 x solución MBS. Para 1 L de 0,1 x solución MBS, añadir 1 ml de solución de 10 mg de gentamicina / ml. La solución de MBS de 0,1 X. con gentamicina se utiliza para el cultivo de embriones a largo plazo.
4. Ficoll / MBS: Añadir 15 gramos de Ficoll 400 a 500 ml de solución 0,5 x MBS. Mezcle vigorosamente. Añadir una barra de agitación y mezcla hasta Ficoll se haya disuelto completamente (varias horas).
5. Etanol 70%: Diluir etanol al 100% a etanol al 70% utilizandoagua destilada.

2. Preparación de vidrio Herramientas de funcionamiento

1. Preparación de la aguja: Load tubo capilar en un extractor de aguja.
   1. Tire las agujas de acuerdo con los valores que se muestran en la Tabla 2: Ajustes del extractor de agujas. Los ajustes son para un extractor de micropipeta Sutter Instrument Co. Modelo P-80/PC y tubos capilares, como se describe en la Tabla de reactivos y equipos específicos. Sin embargo, estos ajustes son específicos de la aguja extractor Sutter, y tendrá que ser ajustado para otras máquinas. Los ajustes se pueden determinar mediante una prueba de rampa, según lo especificado por el fabricante de la máquina.
   2. Tire 4-6 agujas en preparación para el procedimiento. Las agujas se deben romper de modo que la parte flexible,-cabello como de la punta de vidrio se elimina totalmente, que es típicamente de 2-3 mm de largo. La punta debe ser relativamente rígido, pero todavía lo suficientemente estrecho para ser utilizado como una herramienta de corte. Ver la foto de una aguja de ideales en la figura 1A.
   3. Almacenar las agujas en una placa de Petri con una tira de arcilla en el centro. Presione el eje de cada aguja en el barro, para mantenerlo en su lugar y para mantener la punta afilada frágil de la parte inferior y los lados.
2. Para herramientas adicionales, obtener cubreobjetos de cristal, un par de pinzas largas estándar patrón, un mechero Bunsen, y 3-4 pipetas Pasteur de vidrio (tamaño 5 ¾ pulgadas).
3. Herramienta Pipeta: Para presentar una herramienta de pipeta, encender el quemador Bunsen y coloque la punta de una pipeta Pasteur de vidrio en la parte azul de la llama mientras la gira, de manera que la punta se derrite y el agujero completamente juntas, formando un extremo redondeado cerrado . El, punta redondeada sellado más tarde se utiliza para hacer las depresiones en el plato de arcilla que contiene los embriones durante la operación. Vea la Figura 1B.
4. Puentes de vidrio: Para hacer puentes de cristal, utilizar pinzas patrón largo estándar para romper con cuidado de 3 mm por 3 mm de trozos de vidrio cubreobjetos. Mientras sostiene el pedazo de hoja de la cubierta con tweezers, colocar el cristal en la llama hasta que los cuatro bordes se suavizan y la curva hacia abajo, formando una cúpula de cristal pequeño. Los bordes no deben ser afilados. Vea la Figura 1C.
5. Guarde los puentes cubreobjetos de vidrio mediante la inserción de ellos, los bordes hacia abajo, en el modelado de arcilla, que recubre la parte inferior de una placa de Petri. Inserte los puentes de tal manera que la parte superior del puente se mantiene por encima de la superficie de la arcilla. No empuje demasiado duro de tal manera que se rompe el puente, y no integrar plenamente el puente en la arcilla, ya que puede ser difícil de eliminar. Después de la esterilización con una llama o etanol al 70%, los puentes pueden ser reutilizados de experimento a experimento.

3. Preparación para la Operación de Embriones

1. Alinear un pequeño 60 mm de plástico placa de Petri con plastilina. Entre usos, la superficie del plato y la arcilla se lava a fondo con agua destilada y luego con etanol al 70%.
   NOTA: Utilice el rojo, blanco o amarillo, Van Aken Plastalina plastilina, que se puede comprar en un local paray o tienda de arte. El barro negro no es recomendable ya que libera un residuo.
2. Llene el recipiente con solución de Ficoll 0.5x MBS 3%. La concentración de sal superior impide la disociación de tejido, y el Ficoll polisacárido ayuda a espesar la solución, lo que ayuda a sujetar la cara en posición.
3. Utilice la herramienta de la pipeta Pasteur flameado (ver Figura 1) para hacer, 2-3 mm depresiones poco profundas en la arcilla, de la profundidad de un cuerpo de embriones etapa 20. Hacer 20-30 depresiones, 1-2 mm, en cada lado del plato, así que hay un total de 40 a 60 depresiones. Etiquetar un lado LOF / GOF, y la otra de tipo salvaje lado, tallando las iniciales en la arcilla con fórceps.

4. Preparación de embriones antes de la operación

1. Obtener y cultura Xenopus laevis embriones utilizando métodos estándar ^17. Para una descripción detallada de la cría de la rana, consulte Sive et al. ¹⁷
   1. Cuarenta y ocho horas antes del experimento obtaen los huevos de las ranas hembra y llevar a cabo la fertilización in vitro.
   2. Inyectar 0,5-1 ng de membrana cubiertas GFP mRNA, más cualquier ARNm deseado o anti-sentido oligonucleótidos antisentido morfolinos modificados ("morfolinos") en la etapa de una célula o en 2 células en la etapa de 2 células. La etapa de célula una duración aproximada de 70 a 90 min. Inyectar un volumen total de 1-3 nl. En lugar de ARN que codifica para una proteína fluorescente (tal como GFP o RFP ARN), se puede inyectar con FITC marcado morfolino o dextrano marcado con fluorescencia. La fluorescencia es importante para determinar si la cura tejido trasplantado y permanece en la cabeza.
   3. Capsulado ARNm puede prepararse a partir de un plásmido linealizado utilizando una SP6 mMessage mMachine o kit T7. Morpholinos se pueden diseñar y ordenó a través de Gene Tools LLC. La cantidad de morfolino requerida para un efecto deseado debe ser determinada para cada gen ^18.
   4. Guarde los embriones inyectados a 15 ° C durante 48 horas, hasta que llegan a la etapa 19-20. (Fo todos los pasos siguientes, embriones en estadio de acuerdo con la tabla normal de Xenopus laevis por Nieuwkoop y Faber ^19.)
      NOTA: En el día de la cirugía, ambos embriones receptores y donantes deben estar dentro de una etapa de la otra para los trasplantes para trabajar de manera óptima. Sin embargo, los embriones inyectados con morfolinos ("morphants") a veces se desarrollan más lentamente que la de tipo salvaje o controlan morphant embriones, por lo que es necesaria la coordinación de los experimentos por lo que ambos morphant y embriones de tipo salvaje están en la misma etapa. Morphants pueden necesitar ser mantenido a una temperatura superior durante 12-24 horas antes del procedimiento. Para aumentar la probabilidad de que los embriones se pueden encontrar en las etapas a juego, los embriones pueden ser mantenidos a diferentes temperaturas. Veinticuatro horas antes del experimento, se debe dividir los embriones en un varios platos, y hacer morphants a 18-20 ° C y los embriones de tipo salvaje a 15-18 ° C.
2. En el día del experimento de trasplante, REMove los embriones de the15 ° C incubadora y organizar de acuerdo a Nieuwkoop y Faber ^19. Si son menores de neurula tardía (etapa 19), dejarlos a temperatura ambiente durante 1-2 horas, hasta que llegan a la etapa 19.
3. Se tamizan los embriones inyectados bajo un microscopio de fluorescencia. Seleccionar embriones que muestran uniforme, fluorescencia brillante para el experimento.
4. Elimine el desorden y posibles contaminantes cerca de la zona de trabajo. Limpie la superficie de funcionamiento, estereomicroscopio y todas las herramientas con etanol al 70%.
5. Una vez que los embriones se encuentran en la etapa 19, quitar la membrana vitelina usando # 5/45 pinzas Dumont bajo un microscopio estereoscópico.
   1. Retire la membrana vitelina del 20-30 de cada uno de los donantes y los embriones de acogida.
   2. Durante los primeros experimentos de trasplante de cara, uno debe practicar con algunos embriones para cada condición. El método es difícil y requiere práctica cuidadosa antes de que pueda ser utilizado en una escala más grande, de forma rápida y con éxito. Uno puede trabajar up para hacer 20 trasplantes / experimento.
6. Mueva embriones de acogida en el plato operativo utilizando un plástico graduada transferencia pipeta con la punta cortada de manera que la apertura es mucho más amplio que un embrión (por lo menos unos pocos milímetros). Tenga cuidado de no tocar los embriones de burbujas o la superficie del agua, como embriones explotarán en la tensión superficial.
7. Utilice # 5/45 fórceps para insertar los embriones en las depresiones de arcilla, con la posterior del embrión en la arcilla. Cierre suavemente la arcilla alrededor de las bases del embrión utilizando la pinza, dejando el cuarto más alto del embrión, la cabeza, que sobresale de la depresión.
8. Una vez que todos los embriones de acogida están asegurados en sus depresiones, mueva al otro lado de la placa y comenzar a insertar los embriones donantes en sus depresiones. Repita el proceso de obtención de los embriones en sus pozos.

5. Realización de la cirugía del trasplante de rostro

1. Cuchillo de corte: Como un cuchillo de corte para la eliminaciónde tejido EAD donante, utilizar una aguja capilar de vidrio roto apropiadamente (véase el paso 2.3 y la Figura 1).
   NOTA: Se puede sujetar directamente el capilar entre los dedos (esto funciona bien para las personas con manos pequeñas) o se puede montar la aguja en un soporte de pasador de insectos. Agujas de tungsteno Electrosharpened ¹⁷ cargados en un soporte de pasador pueden utilizarse en lugar de una aguja, el tubo capilar. Por favor, vea los titulares pin sugeridas y agujas de tungsteno en la Tabla de Reactivos y Equipos Específicos.
2. Bajo un microscopio estereoscópico, inserte la aguja en la cabeza del embrión a la izquierda de la glándula de cemento. La aguja debe insertarse profundamente, de modo que pase desde fuera del embrión, a través de la cabeza, y en el intestino anterior. Para trasplantar todo el EAD, cortes deben extenderse desde el exterior del embrión a la intestino anterior. Para los trasplantes-ectodermo solamente, los recortes deberían ser más superficial y se extienden sólo a través del ectodermo.
   1. Flick de la aguja de la izquierda a la parte derecha de lacabeza, a través de toda la anchura de la glándula de cemento. El parpadeo es importante ya que el movimiento da un corte limpio. Refiérase a la Figura 2A para un resumen de la técnica y la Figura 2B para una demostración de los recortes. La glándula de cemento y los ojos son puntos de referencia importantes para los cortes. El orden de las cortes no afecta el resultado y puede variar en función de la preferencia del usuario o la prepotencia.
3. Coloque la aguja en el inicio del corte anterior, en el borde izquierdo de la glándula de cemento, y la película de la aguja hacia arriba hasta que alcanza el fondo del ojo izquierdo. Esto creará un corte vertical desde el borde izquierdo de la glándula de cemento a la parte inferior del ojo izquierdo.
4. Coloque la aguja en el borde derecho de la glándula de cemento, y la película de la aguja hacia arriba hasta llegar a la parte inferior del ojo derecho. Esto creará un corte vertical desde el borde derecho de la glándula de cemento hasta la parte inferior del ojo derecho.
5. Para extirpar totalmente el tejido, flick la aguja desde la parte inferior del ojo izquierdo a la parte inferior del ojo derecho, la creación de un corte horizontal que liberará el tejido. Los cortes pueden extenderse desde el exterior del embrión a la intestino anterior, incluyendo tanto ectodermo y endodermo en el explante EAD. Alternativamente, cortes poco profundos pueden ser utilizados para-sólo ectodermo trasplantes de EAD. Una vez que se elimina el tejido EAD, no debería haber un agujero rectangular desde el exterior del embrión en el intestino anterior, que se extiende desde la glándula de cemento justo por debajo de los ojos (de arriba abajo). El agujero debe extenderse desde el borde interior del ojo izquierdo hasta el borde interior del ojo derecho (lado a lado). Ver Figura 2Bb.
6. Empuje suavemente el tejido extirpado en la punta de la aguja, y la levante a través de la memoria intermedia a la parte del plato que contiene los embriones de acogida. No exponer el tejido al aire en la superficie o que se dañe.
7. Escindir el mismo tejido de embrión de acogida, como para el donante. Deseche el explante EAD host o guardarlo en la inserciónT en la cara de los donantes, para los trasplantes recíprocos.
8. Inserte el explante de los donantes en el agujero de acogida resultante usando # 5/45 fórceps.
9. Una vez que el tejido del donante se coloca correctamente y completamente insertado, coloque cuidadosamente un puente de vidrio (véase la Figura 1 y la Figura 2Bc) sobre la cara del embrión para sostener el trasplante en su lugar. Los extremos del puente se deben insertar en el barro, manteniéndolo en su lugar. El puente se debe aplicar una suave presión en el tejido trasplantado, de manera que el trasplante se encuentra a ras de la cabeza de acogida, sin que sobresale de la cabeza o se encuentra profundamente arraigado dentro de la cabeza. La cabeza puede ser ligeramente achatada por la hoja de la cubierta, pero tenga cuidado de no dañar el embrión con demasiada presión. Los trasplantes deben realizarse dentro de los 5 minutos.
   NOTA: Un investigador experimentado puede llevar a cabo una veintena de trasplantes por experimento, más de 2-3 horas. Durante este período, los embriones progresará de la etapa 20-22. Completando el trasplante de caras en la etapa 21 o 22 no afecta a los resultados. Trasplantes posteriores (en las etapas 22 a 26) se puede hacer, pero es más difícil, ya que la región de la línea media EAD-cresta libre se estrecha como craneales de la cresta neural se mueve en la cara. Homogeneidad entre los trasplantes es crítica.

6. Del trasplante de rostro Después de la operación de recuperación

1. La curación suele durar 2-3 horas. Deje los embriones a temperatura ambiente inalterado en sus depresiones de arcilla con los puentes de cristal que sostiene el tejido de un donante en su lugar.
2. Una vez que los trasplantes se han curado, retire con cuidado los puentes de cristal, quitar el barro alrededor de la base de los embriones utilizando fórceps, y el uso de un plástico graduó pipeta de transferencia para aspirar suavemente los embriones de sus depresiones.
3. Ponga los embriones en una placa de Petri marcada apropiadamente, medio lleno de MBS 0,1 X. limpias con gentamicina.
4. Crecer los embriones a 15 ° C o 18 ° C durante varios días hasta que alcanzan la alimentación etapa de renacuajo en la etapa 40, Wgallina fenotipos faciales pueden ser anotados.
   1. La solución MBS 0,1 X. con gentamicina se debe cambiar diariamente, y cualquier embriones muertos deben ser retirados inmediatamente para evitar la contaminación y la muerte de otros embriones.
   2. La boca se abre en la etapa 40. En la etapa 40 a 41, se debe comprobar que el tejido trasplantado sigue siendo curada en su lugar mediante la visualización de su fluorescencia. Trasplantes de vez en cuando se caen, así que uno debe asegurarse de que todos los embriones obtenidos tienen el tejido de un donante en su lugar.

Resultados

Tejido trasplantado debe estar completamente insertado en la cabeza huésped después del trasplante, como se muestra en la Figura 3A, y tienen un puente de vidrio apropiadamente colocado en la cara del embrión, como se muestra en la Figura 2Bc. El tejido del donante trasplantado debe dimensionarse correctamente para la apertura de acogida, para que el trasplante tenga éxito. El tejido EAD no debe sobresalir de la cabeza, de ninguna manera, como se ve en las figuras 3B

Discusión

Etapas críticas y Limitaciones: El procedimiento de trasplante de cara EAD es tiempo y trabajo intensivo. Requiere práctica, manos firmes, y la destreza para perfeccionar. El protocolo de trasplante de cara se basa en la capacidad del investigador para eliminar de manera eficiente y trasplante de tejidos. Si se toma demasiado tiempo para insertar el trasplante de la cara del anfitrión, la cara de acogida comenzará a contraerse y sanar. Fórceps se pueden utilizar para ampliar delicadamente la región facial. ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pasteur pipette	VWR	14672-400	Lime Glass
Size 5 3/4 in	Cotton Plugged
Graduated Transfer Pipette	VWR	16001-180	Disposable
#5/45 forceps	Fine Science Tools by Dupont medical	11251-35	Angled 45°
Standard Pattern Forceps	Fine Science Tools	11000-20	Straight; serrated tip; stainless steel
Capillary Tubing (for needles)	FHC	30-30-1	Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID/Fiber
Cover slip	VWR	48393 252	24 x 60 mm micro cover glass;
Ficoll 400	Sigma-Aldrich	F9378
Needle Puller	Sutter Instrument Co	Needle Puller: discontinued Filament: FB300B	The most similar, currently available  needle puller is the P-97. For filaments, use Sutter 3.00 mm square box filaments, 3.0 mm wide.
Model P-80	Flaming / Brown micropipette puller
Stereomicroscope	Zeiss
Stereomicroscope Lighting by Fostec	Fostec		Use a light box with 2 fiberoptic arms.
Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26018-17	Jaw Opening Diameter: 0-1 mm
Moria Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26016-12	Jaw opening Diameter: 0-1 mm
Tungsten Needles	Fine Science Tools	10130-05	0.125 mm Rod diameter
Van Aken Plastalina	Blick	#33268-2981
Modeling Clay- white, red, or yellow
mMessage mMashine SP6 or T7 Kit	Ambion	AM1340