神经细胞类型的流式细胞仪协议的表面和细胞内抗原分析

摘要

We provide a detailed description of a protocol for flow cytometric analysis of surface antigens and/or intracellular antigens in neural cell types. Critical aspects of experimental planning, step-by-step methodological procedures, and fundamental principles of flow cytometry are explained in order to enable neurobiologists to exploit this powerful technology.

摘要

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of protocols for flow cytometric analysis of the cluster of differentiation (CD) surface antigens and intracellular antigens in neural cell types. Our step-by-step description of the methodological procedures include: the harvesting of neural in vitro cultures, an optional carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeling step, followed by surface antigen staining with conjugated CD antibodies (e.g., CD24, CD54), and subsequent intracellar antigen detection via primary/secondary antibodies or fluorescently labeled Fab fragments (Zenon labeling). The video demonstrates the most critical steps. Moreover, principles of experimental planning, the inclusion of critical controls, and fundamentals of flow cytometric analysis (identification of target population and exclusion of debris; gating strategy; compensation for spectral overlap) are briefly explained in order to enable neurobiologists with limited prior knowledge or specific training in flow cytometry to assess its utility and to better exploit this powerful methodology.

引言

流式细胞仪已被广泛利用免疫学，血液学和肿瘤学，通过内在的散射特性，细胞表面的抗原表达，和其他荧光参数^1-3定义细胞群。我们的见解血统发育和疾病有结果后，其最初的实现^4,5个显著程度这一方法的不断细化。流的数量和整体分析潜在的意识提高术最近鼓励其在干细胞研究更广泛地使用，并且可以使在一个较短的时间框架⁶同样深刻的进展。然而，流式细胞术的应用，特别是分析和分离的神经种群早已被认为是具有挑战性的。在对比的是天然存在于悬浮液中的造血细胞，神经细胞类型通常由过度复杂的来源，其可包括神经胶质细胞和各种O收获疗法周围细胞以及过程承载神经元的一个复杂的网络。因此，神经生物学仍未实施流式细胞仪的多功能性，它在日常研究套路完整的潜力。然而，只要是可行的单细胞悬浮液可以产生（和协议已经设计和优化用于该目的^7），流式细胞术和荧光激活细胞分选（FACS）可以被认为是在神经生物学分析剧目的一个有价值的元件^8-11。

图1原理的流式细胞术分析和流量的部件仪的流式细胞仪包括三个主要系统:流体学，光学和电子学。细胞在悬浮液中简化的流被鞘flui完成（从主组织或离体培养的方法制备）通过水动力ð对焦，限制样品其中心的核心。该光学部件是由激光器照射细胞和光学过滤器，引导信号到相应的检测器的流。检测被转换成电子信号，然后由计算机处理和可视化的数据分析和门控在监视器上的光信号。 请点击此处查看该图的放大版本。

流式细胞方法利润的基本面，包括流式细胞仪的积木至少有一个基本的了解用户（审查见^12,13;另参见图1）。的激光束相交一个流体动力学聚焦流体流包含该细胞悬浮液，这反过来又通过在"单一文件'相继的激光束。该intercepti上的小区（或任何其它粒子，就此而言）与激光产生的光的，从该询问点的散射。散射光可在延续激光方向（前方散射，与颗粒的大小有关），垂直以及其方向来检测（侧向散射;反射颗粒/细胞的granulosity）。这些上述的散射特性不要求特定的标签，这是为什么未标记样品（或还细胞碎片，气泡等 ），将生成的二元前向散射与侧向散射图中常用的初始门控信号（事件）。通过使用适当的激光和特异于相应的激发和发射光谱过滤器，一个细胞可以为它的阳性，强度的水平，或不存在的荧光标记进行分析。大多数流式细胞应用已经通过细胞表面抗原的集中表征。不同于造血lineag即，在神经系一直根据表面抗原的表达模式⁵少广泛定义。利用表面抗原的一个优点是，活细胞能够进行细胞分选范式诸如FACS。与此相反，细胞内抗原染色，需要固定和透化步骤，以介导的表位 - 抗体相互作用，排除需要活菌下游应用。值得注意的是，这样的方法仍然允许众多的定量分析¹⁴以及下游分析为RNA和蛋白质的表达^15。血液学，免疫学和肿瘤学经常用来十多标记结合来定义特定亚群^16。此外，质谱术或CyTOF现在可以用来分析多达30个参数同时^17,18。

对神经干细胞的应用，以及原代培养^14,19,20细胞在异质体外是一种常见的现象^21-23。不表示感兴趣的目标人群的细胞体现为实验读数^24,25一个潜在的混杂因素。方便的是，在异构细胞悬浮液存在于不同的细胞亚群承受不同的（已知的或尚待解码）抗原的表达谱，这可以被用来确定这些不同的人群。流式细胞仪可因此在解决细胞异质性起到至关重要的作用，并且由此促进生物医学应用（ 体外测定法，细胞疗法），并通过集中最相关子集^24,26上优化的定量读数。各种表面抗原组合已经确定，在过去几年中，以允许特定的神经细胞类型的定量和隔离。这包括CD133为神经干细胞的²⁷中，CD15 / CD24 / CD29表面抗原的NSC的分离的组合，不同点的富集泰德神经元和神经嵴细胞²⁸或CD15 / CD24 / CD44 / CD184 / CD271隔离神经胶质子集^25，其他签名^29,30之间。除了 ​​神经元，神经胶质标记包括A2B5 ^{31，CD44 25，NG2 32}和³³ GLAST。最近的出版物开发的脑floorplate前体标记CORIN ^34,35，以丰富的多巴胺的前体帕金森细胞移植范式^36。光盘的分子不仅是标记物，但是细胞-细胞相互作用和当中的小区的能力功能相关介体从细胞外基质分子响应线索和生长因子^37。进一步提高组合的CD抗原库表征神经系的发展策略之一是使用一种称为胞内标记筛选并确定CD抗原组合感兴趣的特定细胞类型。最近，我们利用这种方法，并确定了CD4部9f ^- / CD200 ^高组合的表达模式作为一种新的方法用于富集从neurally分化诱导多能干细胞培养系统³⁸的神经元亚群。在这里，我们包括与讨论后者协议（和可选的变体），其中表面染色和细胞内染色，可同时用于通过流式细胞术确定的神经细胞亚群。

实验协议选项图2的流程图。该图描述中涉及的协议的主要步骤的示意性表示。可选步骤（CFSE染料或细胞内的抗原标记）被浅灰色方框表示。收获后，有必要进行评估之前的细胞表面染色的神经细胞悬浮液的活力和细胞数目。积极作为以及阴性对照需要包含除所关注的样品。样品可以通过流式细胞仪进行分析和/或细胞分选范例使用。 请点击此处查看该图的放大版本。

虽然我们以前使用与二次抗体结合第一抗体细胞内染色^38，我们现在通过荧光Fab片段（泽农标签），为轻微的变化引进第一抗体的非共价标记，从而减少了细胞操作³⁹的步骤。此外，作为协议的通用性的又一个例子中，我们通过羧基琥珀酰亚胺酯（CFSE）表面抗原染色前使用的一个实验性的子集的可选标记。这样的CFSE预标记使两个细胞系或实验条件下立即直接比较（CFSE标记的VS。未标记的）单一样品管，减少变异或孵化时间的细微差异，节约抗体内。 CFSE是通常用于细胞跟踪^40，在增殖^41,42和条形编码实验^43,44既定荧光染料。最后，虽然实际的分拣步骤（FACS，免疫细胞分离或immunopanning）不是该协议的一部分，在原则上，此处描述的收集和标识程序做，可以进行表面抗原或细胞内标记为基础分类应用收率样品^{15 25,28。}

在本文中，我们的目标是:总结出可行的表面抗原染色协议^25,28，总结了检测细胞内目标的协议，以及结合表面和细胞内的抗原分析^38，出现细胞内CFSE染料标记步骤^41,45作为实验选项COMparative分析神经细胞群，总结方法流式细胞仪分析（适当控制^13,46，门控策略和数据呈现^47）。

研究方案

1.神经细胞收获

1. 评估通过显微镜:
   1. 在此之前启动一个实验，请与明场或相衬显微镜文化的地位。
      注意:尽管从解剖得到初级神经组织是，在原则上，同样适合于流式细胞仪分析^14,28，请注意，该协议的重点是从体外神经细胞系统获得的细胞。
2. 收获细胞^7:
   1. 轻轻洗涤贴壁细胞用Mg ²⁺的盘/烧瓶/ ^钙自由磷酸盐缓冲的盐水（PBS）在室温下（ 如 5毫升的T75烧瓶中，每井3毫升6孔板或10毫升10cm皿）。
      注:PBS用于整个协议是Mg ²⁺ / ^钙免费的。
      1. 用于视频例如，使用的SH-SY5Y成神经细胞瘤细胞的T75烧瓶中，在80％的汇合。适用的情况下的附加的洗涤步骤大量的碎片存在于盘中。
      2. 考虑洗血清PBS含⁴⁸白蛋白，珀，或聚蔗糖⁴⁹梯度离心和/或市售珠^50,51。去除髓鞘和其它脂质或其他污染物是至关重要的，特别是当正在使用成人原发性组织来源。
   2. 添加预热（37℃）胰蛋白酶替换在覆盖组织培养皿的整个表面上适当的音量。
      注:另外，考虑的Accutase或其他酶消化选项。这关键的一步，可能表面抗原的表达产生负面影响（见^7）。
   3. 孵化菜/烧瓶，在37℃进行2 - 5分钟（取决于细胞类型），以使细胞分离。轻轻拍打组织培养皿或冲洗用血清学吸管打跑的细胞。避免过度消化（因为这可能会导致电池损耗和凝固在后面的步骤）。
   4. Quench胰蛋白酶置换，加入两倍的流动缓冲液（在PBS中的2％FBS）的体积和收集细胞在15ml锥形管中。
   5. 轻轻磨碎使用微升吸管将细胞悬浮液（100 - 1,000微升）或5ml的血清吸管以制备单细胞悬浮液。
   6. 离心细胞，在220×g离心5分钟，在25℃下。小心吸出上清液留下沉淀的后面。
   7. 重悬浮沉淀的流动缓冲器的适当体积，取决于粒料（尺寸例如为SH-SY5Y细胞中的一个汇合的T75烧瓶中的典型产率为至少10×10 ^6个细胞，在这种情况下，将细胞重新悬浮于5毫升的流动缓冲液）。
      注意:如果较大的块或凝血观察，筛选过30 - 100微米的网格。
3. 细胞计数^52:
   1. 在TR的一个体积调小等分的细胞悬浮液到一个离心管中，并稀释在限定的比率ypan蓝色或转移至血细胞计数器或自动细胞计数系统之前的替代生存能力染料。
   2. 通过加入流动缓冲液或PBS中适当体积用0.1％BSA（如果继续用CFSE标记）稀释细胞悬浮液以1×10 ⁶个活细胞/ ml的浓度。
      注:碘化丙锭，7氨基放线菌素D，膜联蛋白V和市售可定影活力检测试剂盒代表，以评估细胞的生存力的替代方案。此外，使用胱天蛋白酶-3的荧光凋亡测定法如先前描述的⁵³可以被使用。这些试剂如果包括所有样品中，可能会限制后续步骤中选择荧光通道将被"占用"。

2.细胞内染料标记用CFSE（图3）

1. 稀释CFSE至所需原料浓度可以很容易地使用。
   注:对于这些实验股票浓度0.01毫米中。确定的CFSE的最佳工作浓度凭经验。
2. 添加10微升每ml细胞的0.01毫CFSE溶液（1.3.2节，在PBS + 0.1％BSA的1×10 ^6个细胞/ ml的浓度）为0.1微米的最终浓度。简要涡旋拌匀。
   注意:这里使用CFSE浓度约10倍比那些在增殖实验常用的降低，因此电池中染料的毒性是最小的。我们没有观察到对细胞活力的不利影响。
3. 孵育5分钟，在RT下持续振荡（200转）。避光。
4. 通过加入5倍体积的缓冲液流动到管淬灭染料。离心在94×g离心5分钟，在室温。
5. 弃去上清液留下沉淀后面。重新悬浮细胞以5倍体积的缓冲液流动。
6. 离心在94×g离心5分钟，在室温。弃去上清液并重新悬浮的细胞在流缓冲器以1×10 ⁶个细胞的浓度/毫升。
7. 添加相同数量的感兴趣的染色细胞悬浮液未染色细胞。进行表面抗原染色协议（ 第3节 ）。

图3.检测通过CFSE染料标记。的SH-SY5Y成神经细胞瘤细 ​​胞两种细胞系之间的差分的CD表面抗原表达的是预先标记相比，未标记的BJ成纤维细胞用CFSE用于随后鉴定。共染色混合样品（右图）与表面标志物CD24或CD54（两者结合到APC）的证明，细胞系很容易分辨由于CFSE染色（箭头= SH-SY5Y;箭头= BJ成纤维细胞）。大多数的SH-SY5Y细胞表达CD24但不CD54（ICAM-1）。相比之下，BJ成纤维细胞（CFSE阴性）是CD54阳性，但主要是负面的CD24。"https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig3highres.jpg"目标="_空白">点击此处查看该图的放大版本。

3.细胞表面染色

1. 标签管包括样品和关键控制（ 见表1）。

管没有。	样品名称	抗原荧光	稀释
1	未染色细胞	-
2	单染	CD24-APC	1时50
3	单染	TUJ1-的Alexa Fluor 488nm的	1:2000
4	双染	CD24-APC	1:50
		TUJ1-的Alexa Fluor 488nm的	1:2000
五	单染	二级只:的Alexa Fluor 488nm的	1:2000

被包括在一个典型的流式细胞仪实验表1。L管IST。下表显示了一组所需的这个视频文章中描述的共染色实验样品管的最小的。一个理想的实验需要包括所有必要的控制（阴性，阳性以及补偿控制）对所获得的结果准确解释。

2. 加入100微升细胞悬液（从2.7或1.3.2），以每次1.5 ml离心管。
   注:确保最低0.1×10 ⁶细胞是每100微升细胞悬液的存在。
3. 添加荧光团共轭抗体与样品在适当的稀释度。
   注:确定工作稀释为在实验前各抗体。 见表2列表Ø˚F神经表面抗原。

抗原	电池类型	参考
CD15	神经干细胞	[28，67]
CD24	神经细胞	[28，68]
CD29	神经干细胞	[28，69，70]
CD44	神经胶质细胞	[25]
CD49f的	神经干细胞	[38]
CD56（NCAM）	神经细胞	[71]
CD133	神经干细胞	[27]
CD184	神经干细胞和神经胶质细胞	[25]
CD200	神经细胞	[38]
CD271	神经嵴干细胞	[25]
A2B5	神经胶质细胞	[31]
CORIN	多巴胺的前体	[35，36]
FORSE1	神经干细胞（NS​​C）	[72]
GLAST	神经胶质细胞	[33]
NG2	神经胶质细胞	[32]

表2.选择的神经表面抗原。此表提供发现由各种神经细胞类型被表示在举例用于表征神经谱系表面抗原的增加面板表面表位的列表。注意，这个选择是远未完成，大多数这些标记也通过一系列其他神经和非神经细胞中的表达。因此，将需要的几个标记物的组合，以更好地确定和分离指示神经子集。

1. 孵育在轨道摇床（200rpm）下在黑暗中30分钟。
2. 流缓冲区清洗
   1. 加入1毫升的流缓冲到管中。离心机在380×g离心在4℃下4分钟。
   2. 弃去上清液留下沉淀后面。
3. 再次重复清洗步骤。
4. 第二次洗涤后，倒出上清液，并重新悬浮细胞在流缓冲器中以达到100μl的最终体积。
5. 使用样本流式细胞仪分析。另外，继续进行第4和第5。
   注意:如果细胞是要排序并放回培养后的FACS（ 即没有固定或透化的活细胞悬浮液），收获，染色和分析步骤期间应用无菌技术。

4.固定和透³⁸

1. 固定使用多聚甲醛（PFA）:
   1. 制备含2％的PFA的PBS固定缓冲液中。
      注:PFA是对人体有害的环境。使用合适的个人防护装备和丢弃垃圾按照当地法规。
   2. 加入500微升固定缓冲液100微升细胞悬浮液。
   3. 孵育管在室温15分钟在定轨摇床（100rpm下）在黑暗中。
2. PBS洗:
   1. 加入1毫升的PBS到管。离心机在380×g离心3分钟，在4℃。
   2. 丢弃/倒出上清液留在管大约100微升。
3. 透用Tween-20:
   1. 制备含有0.7％吐温-20的PBS透化缓冲液中。
   2. 加入500微升的透化缓冲液至100μl细胞悬浮液。
   3. 孵育管在室温15分钟在定轨摇床（100rpm下）在黑暗中。
4. 用PBS（如第4.2节 ），一旦洗细胞，并从协管去除上清mpletely，只留下沉淀的后面。

5.细胞内抗原染色的^38（图4）

1. 准备一抗的解决方案:
   1. 稀释含1％牛血清白蛋白，10％血清（ 如正常驴或山羊血清）和0.5％吐温-20的PBS中稀释缓冲液中的一抗。
      注:选择根据二次抗体中提出的物种中使用的血清。
   2. 或者，根据制造商的说明使用第一抗体泽农荧光标记。
      1. 制备1微克的PBS初级抗体在适当的稀释液（总体积≤20微升）。
      2. 添加5微升的Zenon IgG的荧光标记试剂（组分A）与抗体溶液。
      3. 为5分钟，在RT下孵育所述混合物。
      4. 添加5微升的Zenon封闭试剂（成分B）的反应混合物中。
      5. 孵化为5分钟，在RT下将混合物。在30分钟内应用该抗体对所述样品。
2. 主要抗体染色:
   1. 添加100微升的初级抗体溶液到细胞沉淀中，并轻轻磨碎混合。
   2. 可替代地，泽农荧光素标记的抗体添加至细胞悬浮液在合适的稀释度。
   3. 孵育管在室温30分钟在定轨摇床（200rpm）下，避光。用PBS洗一次细胞（如描述在第4.2节），并从完全管去除上清，只留下沉淀的后面。
3. 第二抗体染色（不需要的泽农荧光素标记的抗体）:
   1. 稀释在PBS中的第二抗体在适当的浓度。
   2. 添加100微升的二次抗体溶液到细胞沉淀中，并轻轻磨碎混合。孵育管在RT在黑暗中30分钟在振荡器上（200rpm）下。
4. 与PBS洗涤样品两次（如第4.2节 ）。
5. 与流缓冲洗一次（见第3.5节 ）。
6. 重新悬浮细胞在大约150微升流动缓冲液和流式细胞仪上的流动分析。

图4.共染色的表面和细胞内的蛋白质。流式细胞术数据举例说明了主+二级抗体为基础的对与表面染色组合泽农荧光素为基础的细胞内染色的比较。在y轴（左上象限）和x轴（右下象限）独家阳性细胞显示染色MAP2和CD24，分别。后共染色，共用MAP2和CD24的表达可以看出，在右上象限（右图）。使用比较的Alexa Fluor 488（最高; AF488）与泽农荧光素（底）部MAP2标签产生类似的结果，请点击这里查看该图的放大版本。

6.流式细胞仪分析

1. 在完成使用流式细胞仪用适当的过滤器进行信号检测的染色方案后，立即进行流式细胞术分析。使用488nm的蓝色和640纳米的红色激光器FL-1（三十○分之五百三十三），FL-2（40分之585），和FL-4（25分之675）带通滤波器。
2. 建立基于前向和侧向散射不含碎片和死细胞的主要栅极。
3. 设置荧光门的表面和基于使用单一的彩色控制未染色样品，并赔偿频谱重叠细胞抗原≤0.5％。

结果

这里介绍的协议允许多功能的实验方法（ 图2）。在其最短的版本（ 步骤1，3和6），它可以被认为是表面抗原的简单染色的指南。在它的更复杂的形式，一些共标记的范例与一系列胞内抗原可以追求（任选的步骤2和/或4至5）。此外，将CFSE标记步骤举例说明它的应用程序，用于细胞-细胞相互作用的研究细胞标记/亚群的跟...

讨论

这里介绍的协议是公认的用于从人干细胞来源的神经细胞培养物，但也可以同样适用于其他的神经细胞来源，包括原代组织或神经细胞系。除了 ​​胚胎来源，神经干细胞或祖细胞，可以提取自成人脑²⁷的神经区域。此外，流式细胞仪和FACS可以被利用来量化，分 ​​析和分离各种细胞群体，包括成熟的神经元^54，星形胶质细胞^33，小胶质细胞^55，少突^56，?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12 (1:1) (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)	Life Technologies	11330057
DPBS without Ca2+ Mg2+	Life Technologies	14190169
Fetal bovine serum, qualified, E.U.-approved, South America origin (FBS)	Life Technologies	10270-106
MEM Non-essential amino acids (100x)	Life Technologies	11140035
TrypLE Express	Life Technologies	12604013
Trypan blue solution, 0.4%	Life Technologies	15250061
Paraformaldehyde	Carl Roth	335.3
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V	PAA Laboratories, Coelbe	K41-001
Tween-20 Detergent	Calbiochem	655205
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)	eBioscience	65-0850-84
DMSO	AppliChem	A1584
Bottle top filters express plus 0.22 µm, 250 ml	Millipore	SCGPU02RE
Cell culture treated flasks (T 25)	NUNC	156367
Cell culture treated flasks (T 75)	NUNC	156499
Conical tubes (15 ml)	Greiner Bio-One	188271
Conical tubes (50 ml)	Greiner Bio-One	227261
Pasteur pipet, glass (150 mm)	STEIN Labortechnik, Remchingen	S03710150
Pipet tips (0.1-10 µl)	Corning	4125
Pipet tips (1-200 µl)	Corning	4126
Pipet tips (100-1000 µl)	Corning	4129
Serological pipets, 5 ml	Corning	4051
Serological pipets, 10 ml	Corning	4101
Serological pipets, 25 ml	Corning	4251
Microcentrifuge tubes (0.5 ml)	Sarstedt	72,699
Microcentrifuge tubes (1.5 ml)	Greiner Bio-One	616201
Microcentrifuge tubes (2.0 ml)	Sarstedt	72,695,500
Anti-Human CD24 APC monoclonal antibody	eBioscience	17-0247-42	Working dilution 1:50
Anti-Human CD54 PE monoclonal antibody	eBioscience	12-0549-42	Working dilution 1:50
Neuronal Class III β-Tubulin (Tuj1) polyclonal antibody	Covance	PRB-435P	Working dilution 1:2,000
Alexa Fluor 488 Donkey anti Rabbit	Life Technologies	A21206	Working dilution 1:2,000
Zenon® Fluorescein Rabbit IgG Labeling Kit	Life Technologies	Z-25342
Neubauer-Improved counting chamber	Marienfeld	0640010
Vortex	Scientific Industries	G560E
Thermomixer comfort	Eppendorf	5355 000.001
Accuri C6 flow cytometer	Becton Dickinson (BD)	653118
Microcentrifuge refrigerated, PerfectSpin 24 R	Peqlab	91-PSPIN-24R
Orbital shaker, Unimax 1010	Heidolph	543-12310-00
Centrifuge refrigerated, Rotanta 96 RC	Hettich	4480-50
Class II Biological safety cabinet Safe 2020	Thermo Scientific	51026640
CO2 Incubator, Heracell 240i	Thermo Scientific	51026331
Vacuum system, Vacusafe comfort	Integra Biosciences	158320
Microscope, Axiovert 40 CFL	Zeiss	451212
Pipet controller, accu-jet pro	Brand	26303
Micropipet, Pipetman neo P20N (2-20 µl)	Gilson	F144563
Micropipet, Pipetman neo P200N (20-200 µl)	Gilson	F144565
Micropipet, Pipetman neo P1000N (100-1000 µl)	Gilson	F144566