Citometria de Fluxo protocolos para a superfície e intracelular Antigen análises de tipos de células neurais

Resumo

We provide a detailed description of a protocol for flow cytometric analysis of surface antigens and/or intracellular antigens in neural cell types. Critical aspects of experimental planning, step-by-step methodological procedures, and fundamental principles of flow cytometry are explained in order to enable neurobiologists to exploit this powerful technology.

Resumo

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of protocols for flow cytometric analysis of the cluster of differentiation (CD) surface antigens and intracellular antigens in neural cell types. Our step-by-step description of the methodological procedures include: the harvesting of neural in vitro cultures, an optional carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeling step, followed by surface antigen staining with conjugated CD antibodies (e.g., CD24, CD54), and subsequent intracellar antigen detection via primary/secondary antibodies or fluorescently labeled Fab fragments (Zenon labeling). The video demonstrates the most critical steps. Moreover, principles of experimental planning, the inclusion of critical controls, and fundamentals of flow cytometric analysis (identification of target population and exclusion of debris; gating strategy; compensation for spectral overlap) are briefly explained in order to enable neurobiologists with limited prior knowledge or specific training in flow cytometry to assess its utility and to better exploit this powerful methodology.

Introdução

A citometria de fluxo foi explorado extensivamente em imunologia, hematologia e oncologia para definir populações de células através de dispersão propriedades intrínsecas, a expressão do antigénio da superfície celular, e outros parâmetros de fluorescência ^1-3. Os nossos insights sobre desenvolvimento linhagem de sangue e doença são o resultado de um significativo grau de refinamento contínuo desta metodologia após a sua implementação inicial ^{de 4,5.} O aumento da consciência do potencial analítico quantitativo e global de citometria de fluxo tem incentivado recentemente o seu uso mais difundido na pesquisa com células-tronco e pode permitir semelhante profunda progresso em um tempo mais curto ^6. No entanto, a aplicação da citometria de fluxo para analisar especificamente e isolar populações neuronais tem sido entendida como um desafio. Em contraste com as células hematopoiéticas que existem naturalmente em suspensão, os tipos de células neuronais são tipicamente colhidas de fontes excessivamente complexas que podem incluir células gliais e vários outras células circundantes, bem como uma intrincada rede de neurônios portadores de processo. Consequentemente, neurobiologia ainda tem que implementar a versatilidade de citometria de fluxo para o seu potencial completo em rotinas do cotidiano da pesquisa. No entanto, desde que uma única suspensão de células viáveis ​​podem ser gerados (e protocolos têm sido desenvolvidos e optimizados para esse fim ^7), citometria de fluxo e de células activadas por fluorescência (FACS) pode ser considerado um elemento valioso do repertório analítico em neurobiologia ^8-11.

. Figura 1. Princípio da análise de citometria de fluxo e componentes de um citômetro de fluxo Fluxo cytometers compreendem três sistemas principais: fluídicos, óptica e eletrônica. Um fluxo simplificado de células em suspensão (preparada a partir de tecido primário ou em cultura in vitro) é realizada pela bainha Fluid através de focagem hidrodinâmica, a limitação da amostra para o seu núcleo central. As peças ópticas são compostos de lasers que iluminam o fluxo de células e os filtros ópticos que encaminham o sinal para os detectores apropriados. Os sinais de luz detectados são convertidos em sinais eletrônicos, posteriormente processadas por um computador e visualizadas em um monitor para análise de dados e gating. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Usuários de métodos de citometria de fluxo de lucro de pelo menos um conhecimento básico dos fundamentos subjacentes, incluindo blocos de construção de um citómetro (para revisão ver ^12,13; também veja a Figura 1). Um feixe de raios laser intersecta com um fluxo de fluidos hidrodinamicamente focado que contém as células em suspensão, que por sua vez, passam através do feixe de laser em um ficheiro único "um após o outro. O Interceptino de uma célula (ou qualquer outra partícula, para esse efeito) com os resultados de laser na dispersão de luz a partir deste ponto de interrogação. Luz dispersada pode ser detectada na continuação da direcção de laser (dispersão frontal, associada ao tamanho da partícula), bem como perpendiculares à sua direcção (dispersão lateral; reflectindo a granulosidade da partícula / célula). Estas propriedades de dispersão acima mencionados não exigem rotulagem específica, razão pela qual uma amostra não marcado (ou também os restos celulares, bolhas de ar, etc.) gerará um sinal (evento) na dispersão para a frente bivariada e lado dispersão comumente usado para gating inicial. Ao utilizar os lasers e filtros específicos para os espectros de excitação e de emissão correspondente adequadas, uma célula pode ser analisada quanto a sua positividade, o nível de intensidade, ou na ausência de marcadores fluorescentes. A maioria das aplicações de citometria de fluxo têm-se centrado na caracterização através de antigénios da superfície celular. Ao contrário do lineag hematopoiéticase, a linhagem neural permaneceu menos extensivamente definido de acordo com a superfície de expressão epitopo padrões ^5. Uma vantagem de explorar os antigénios de superfície é que as células vivas podem ser submetidas a triagem celular paradigmas tais como FACS. Em contraste, a coloração do antigénio intracelular requer fixação e permeabilização passos para mediar a interacção epitopo-anticorpo, o que impede a jusante aplicações que exigem células viáveis. Digno de nota, tais abordagens ainda permitem inúmeros ensaios quantitativos ^14, bem como análises a jusante para RNA e proteína expressão ^15. Hematologia, imunologia e oncologia, muitas vezes utilizado mais de uma dúzia de marcadores em conjunto para definir determinadas subpopulações ^16. Além disso, citometria de massa ou CyTOF pode agora ser utilizado para analisar se a 30 parâmetros simultaneamente ^17,18.

Para aplicações de células-tronco neurais, bem como culturas primárias ^14,19,20 A heterogeneidade das célulasvitro é um fenômeno comum ^21-23. As células não representam a população alvo de interesse encarnar um fator potencialmente confusão para leitura experimental ^24,25. Convenientemente, os diferentes tipos celulares presentes dentro de uma suspensão celular heterogénea suportar perfis de expressão de antigénio distintas (conhecidas ou ainda a ser decifrados), que podem ser utilizados para definir estes diferentes populações. A citometria de fluxo pode, portanto, desempenhar um papel crucial na resolução de heterogeneidade celular e, assim, facilitar aplicações biomédicas (ensaios in vitro, de terapia celular) e otimizar a leitura quantitativa, concentrando-se no subconjunto mais relevantes ^24,26. Várias combinações de antigénios de superfície foram identificados nos últimos anos para permitir o isolamento e quantificação de tipos de células neuronais específicas. Isto inclui CD133 para o enriquecimento de células estaminais neurais ^27, uma combinação dos / CD24 / CD29 antigénios de superfície CD15 para o isolamento da NSC, Differentiated neurônio e células da crista neural ²⁸ ou CD15 / CD24 / CD44 / CD184 / CD271 para isolar neural e subconjuntos gliais ^25, entre outras assinaturas ^29,30. Além neurônios, marcadores gliais incluem A2B5 ^31, CD44 ^25, NG2 ³² e GLAST ^33. Uma publicação recente tem explorado o mesencéfalo marcador precursor floorplate CORIN ^34,35 para enriquecer precursores dopaminérgicos no transplante de células Parkinson paradigmas ^36. Moléculas de CD não são apenas marcadores, mas mediadores funcionalmente relevantes de interações célula-célula e da capacidade de uma célula para responder a estímulos a partir de moléculas de matriz extracelular e fatores de crescimento ^37. Uma estratégia de reforçar ainda mais o arsenal de antigénios CD combinatórias para caracterizar desenvolvimento da linhagem neural é a utilização de marcadores intracelulares conhecidos para rastrear e definir as combinações de antigénios CD para um tipo particular de célula de interesse. Nós exploramos recentemente essa abordagem e identificaram CD49F ^- / CD200 padrões de expressão combinatórias ^altas como uma nova abordagem para o enriquecimento de subconjuntos de neurônios de pluripotentes induzidas sistemas de cultura de células-tronco diferenciadas neurally ^38. Aqui, nós incluímos e discutir o último protocolo (e variações opcionais dos mesmos), em que a coloração da superfície e coloração intracelular pode ser utilizado simultaneamente para definir sub-populações de células neurais, por citometria de fluxo.

Figura 2. Diagrama do sistema de opções de protocolos experimentais. A figura ilustra uma representação esquemática dos principais passos envolvidos no protocolo. Passos opcionais (corante CFSE ou rotulagem antígeno intracelular) são indicados por caixas de cinza claro. Após a colheita, é essencial avaliar o número e a viabilidade de células de suspensões de células neuronais antes da coloração da superfície celular. Positivo comobem como os controlos negativos devem ser incluídos em adição às amostras de interesse. As amostras podem ser analisadas por análise de citometria de fluxo e / ou utilizadas em paradigmas de separação de células. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Embora se tenha usado previamente anticorpos primários em combinação com anticorpo secundário por ³⁸ coloração intracelular, que agora introduzir a rotulagem não-covalente do anticorpo primário através de fragmentos Fab fluorescentes (rotulagem Zenon) como uma ligeira variação, reduzindo, assim, os passos de manipulação de células ^39. Além disso, como mais um exemplo da versatilidade do protocolo, que empregam uma etiquetagem opcional de um subconjunto experimental por carboxifluoresceína éster de succinimidilo (CFSE) antes da coloração de antigénio de superfície. Essa pré-rotulagem CFSE permite a comparação direta imediata de duas linhas celulares ou condições experimentais (CFSE marcado vs. sem rótulo) dentro de um único tubo de amostra, reduzindo variação ou diferenças sutis no tempo de incubação e de poupança de anticorpos. CFSE é um corante fluorescente estabelecido que é comumente usado para rastreamento de células ^40, na proliferação ^41,42 e barcoding experiências ^43,44. Finalmente, embora passos reais (FACS, de separação de células imunomagn�ica ou immunopanning) não fazem parte deste protocolo, em princípio, os procedimentos de colheita e de rotulagem descritos aqui fazer amostras de rendimento que podem ser submetidos a superfície antígeno ou aplicações de classificação baseada em rotulagem intracelulares ^{15 25,28.}

Com este artigo, pretendemos: resumir um protocolo de coloração antígeno de superfície viável ^25,28, resumir um protocolo para detecção de alvos intracelulares, bem como superfície combinada e análise do antígeno intracelular ^38, apresentar uma CFSE marcação com corante passo intracelular ^41,45 como um opção experimental para comanalisa comparativo de populações de células neurais, e resumir abordagens para análise de citometria de fluxo (controles apropriados ^13,46, gating estratégia e dados apresentação ^47).

Protocolo

1. Neural colheita celular

1. Avaliação por microscópio:
   1. Antes de iniciar um experimento, verificar o estado da cultura com brilhante-campo ou microscopia de contraste de fase.
      NOTA: Enquanto o tecido neural primário obtido a partir de dissecações é, em princípio, igualmente passível de análise por citometria de fluxo ^14,28, por favor, note que o foco do protocolo está em células obtidas de sistemas in vitro de células neurais.
2. Colheita de células ^7:
   1. Lavar suavemente o prato / frasco de células aderentes com Mg2 ⁺ / Ca2 ⁺ livre salina tamponada com fosfato (PBS) à temperatura ambiente (por exemplo, 5 ml para o frasco T75, 3 ml por poço de placa de 6 poços, ou 10 ml de prato de 10 cm).
      NOTA: O PBS usado durante todo o protocolo é Mg2 ⁺ / Ca2 ⁺ livre.
      1. Para o exemplo de vídeo, utilizar um frasco T75 de células de neuroblastoma SH-SY5Y em 80% de confluência. Aplicar etapas de lavagem suplementar nos casos emdetritos considerável está presente no prato.
      2. Considere ⁴⁸ lavagens com PBS, contendo albumina de Percoll, ou de centrifugação de Ficoll ⁴⁹ gradientes de soro e / ou grânulos comercialmente disponíveis ^50,51. A remoção da mielina e outros lípidos ou de outros contaminantes é crítica, especialmente quando as fontes de tecidos adultos primários estão a ser utilizados.
   2. Adicionar pré-aquecido (37 ° C) substituição de tripsina a um volume apropriado que cobre toda a superfície do recipiente de cultura de tecidos.
      NOTA: Como alternativa, considere Accutase ou outras opções de digestão enzimática. Este passo crítico pode afetar negativamente a expressão epitopo superfície (ver ^7).
   3. Incubar o prato / frasco a 37 ° C durante 2-5 minutos (dependendo do tipo de célula) para permitir que as células a separar. Bata levemente o vaso de cultura de tecidos ou flush com uma pipeta sorológica para desalojar as células. Evitar o excesso de digestão (pois isso pode causar a perda de células e coagulação em etapas posteriores).
   4. Quench a substituição da tripsina por adição de duas vezes o volume de tampão de fluxo (2% de FBS em PBS) e recolher as células num tubo de 15 ml.
   5. Triturar suavemente a suspensão de células utilizando uma pipeta de microlitro (100 - 1000 uL) ou uma pipeta de 5 ml serológico para preparar uma suspensão de célula única.
   6. Centrifuga-se as células a 220 xg durante 5 min a 25 ° C. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante deixando um pelete de trás.
   7. Re-suspender o sedimento num volume apropriado de tampão de fluxo, dependendo do tamanho da pastilha (por exemplo, para um frasco T75 confluente de células SH-SY5Y o rendimento típico é de pelo menos 10 x 10 ⁶ células, caso em que as células são ressuspensas em 5 ml de tampão de fluxo).
      NOTA: Se forem observados pedaços maiores ou coagulação, filtrar através de um 30 - malha 100 mm.
3. A contagem das células ^52:
   1. Transferir uma pequena alíquota da suspensão de células para um tubo de microcentrífuga e diluir em uma proporção definida em um volume de trypan azul ou um corante de viabilidade alternativa antes da transferência para um hemocitômetro ou sistema de contagem de células automatizado.
   2. Dilui-se a suspensão de células para uma concentração de 1 x 10 ⁶ células viáveis ​​/ ml através da adição do volume apropriado de tampão de fluxo ou PBS com 0,1% de BSA (se prosseguir com a rotulagem CFSE).
      NOTA: iodeto de propídio, D-7 aminoactinomycin, anexina V e comercialmente disponíveis kits de ensaio viabilidade solucionáveis ​​representam opções alternativas, a fim de avaliar a viabilidade das células. Além disso, ensaios de apoptose caspase-3 utilizando a fluorescência como anteriormente descrito ⁵³ pode ser usado. Canais fluorescentes serão "ocupado" por estes reagentes que podem limitar as opções para passos subsequentes, se incluído em todas as amostras.

2. Corante intracelular Etiquetagem Usando CFSE (Figura 3)

1. Dilui-se a CFSE para uma concentração do material desejado que pode ser facilmente utilizado.
   NOTA: Para estas experiências a concentração de ações de0,01 mM foi usada. Determinar a concentração de trabalho ideal de CFSE empiricamente.
2. Adicionam-se 10 ul de uma solução 0,01 mM de CFSE por ml de células (Secção 1.3.2, concentração de 1 x 10 ⁶ células / ml em PBS + BSA a 0,1%) para uma concentração final de 0,1 uM. Resumidamente vortex para misturar bem.
   NOTA: As concentrações de CFSE usados ​​aqui são cerca de dez vezes menor do que os normalmente aplicados em ensaios de proliferação, por conseguinte, a toxicidade celular do corante é mínima. Não observamos efeitos negativos sobre a viabilidade celular.
3. Incubar durante 5 min à temperatura ambiente com agitação constante (200 rpm). Proteger da luz.
4. Extingue-se o corante por adição de 5 volumes de tampão de fluxo para os tubos. Centrifuga-se a 94 x g durante 5 min à TA.
5. Descartar o sobrenadante deixando um pelete de trás. Re-suspender as células com 5 volumes de tampão de fluxo.
6. Centrifuga-se a 94 x g durante 5 min à TA. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em tampão de fluxo a uma concentração de 1 x 10 ⁶ células / ml.
7. Adicionar um número igual de células não coradas de interesse para a suspensão de células coradas. Proceder à tona protocolo de coloração antígeno (Seção 3).

Figura 3. Detecção de expressão diferencial entre o antigénio de superfície CD duas linhas de células por células SH-SY5Y neuroblastoma CFSE corante rotulagem. São pré-marcado com CFSE, para posterior identificação em comparação com fibroblastos BJ não marcados. Co-coloração da amostra mista (painéis à direita) com marcadores de superfície CD24 ou CD54 (ambos conjugados com APC) demonstra que as linhas celulares são facilmente distinguíveis devido à coloração CFSE (Setas = SH-SY5Y; setas = fibroblastos BJ). A maioria das células SH-SY5Y expressam CD24, mas não CD54 (ICAM-1). Em contraste, os fibroblastos BJ (CFSE-negativo) são positivas para CD54, mas amplamente negativo para CD24.Target "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig3highres.jpg" = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. celular coloração da superfície

1. Etiqueta de tubos, incluindo amostras e controlos críticos (ver Tabela 1).

Tubo não.	Nome da amostra	Antigen-fluorophore	Diluição
1	Células não coradas	-
2	Manchado Individual	CD24-APC	01:50
3	Manchado Individual	TUJ1-Alexa 488nm fluor	1: 2000
4	Duplo manchado	CD24-APC	01:50
		TUJ1-Alexa 488nm fluor	1: 2000
5	Manchado Individual	Secundária só: Alexa 488nm fluor	1: 2000

Tabela 1. L ist de tubos para ser incluído em um fluxo típico citometria experimento. A tabela mostra um conjunto mínimo de tubos de amostra necessários para uma experiência de co-coloração descrito neste artigo de vídeo. Um experimento ideal deve incluir todos os controles necessários (e positivas, bem como controles negativos de compensação) para a interpretação precisa dos resultados obtidos.

2. Adicionar 100 ul de suspensão de células (a partir da Secção 2.7 ou 1.3.2) a cada tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
   NOTA: Certifique-se de um mínimo de 0,1 x 10 ⁶ células estão presentes por 100 mL de suspensão de células.
3. Adicionar fluoróforo anticorpo conjugado com a amostra a uma diluição adequada.
   NOTA: Determinar a diluição de trabalho de cada um dos anticorpos, antes da experiência. Ver Tabela 2 para uma lista of antigénios de superfície neurais.

Antígeno	Tipo celular	Referência
CD15	As células estaminais neurais	[28, 67]
CD24	Células neuronais	[28, 68]
CD29	As células estaminais neurais	[28, 69, 70]
CD44	As células da glia	[25]
CD49f	As células estaminais neurais	[38]
CD56 (NCAM)	Células neuronais	[71]
CD133	As células estaminais neurais	[27]
CD184	Células-tronco neurais e células gliais	[25]
CD200	Células neuronais	[38]
CD271	Células-tronco da crista neural	[25]
A2B5	As células da glia	[31]
CORIN	Precursores dopaminérgicos	[35, 36]
FORSE1	Células-tronco neurais (NSC)	[72]
GLAST	As células da glia	[33]
NG2	As células da glia	[32]

Tabela 2. Selecção de antigénios de superfície neurais. Esta tabela fornece uma lista de epítopos de superfície que se verificou ser expresso por diversos tipos de células neurais para exemplificar o aumento painel de antigénios de superfície utilizados para caracterizar a linhagem neural. Note-se que esta selecção está longe de ser completa e que a maioria destes marcadores são também expressos por uma variedade de outras células neurais e não neurais. Por conseguinte, as combinações de vários marcadores será necessária para melhor definir e isolar os subconjuntos neurais indicados.

4. Incubar durante 30 min num agitador orbital (200 rpm) no escuro.
5. Tampão de lavagem de fluxo
   1. Adicionar 1 ml de tampão de fluxo para os tubos. Centrifugar a 380 g durante 4 min a 4 ° C.
   2. Descartar o sobrenadante deixando um pelete de trás.
6. Repita o passo de lavagem de novo.
7. Após a segunda lavagem, decantar o sobrenadante e ressuspender as células em tampão de fluxo para um volume final de 100 ul.
8. Use amostra para análise de citometria de fluxo. Como alternativa, proceder com a Seção 4 e 5.
   NOTA: Se as células estão a ser classificado e colocado de volta na cultura pós-FACS (ou seja, a suspensão de células viáveis ​​sem fixação ou permeabilização), aplicar técnicas de assepsia durante a colheita, a coloração e as etapas de análise.

4. Fixação e permeabilização ³⁸

1. Fixação com paraformaldeído (PFA):
   1. Preparar tampão de fixação contendo 2% de PFA em PBS.
      NOTA: PFA é prejudicial aos seres humanos e ao meio ambiente. Usar equipamento de protecção individual adequado e descarte de resíduos, de acordo com os regulamentos locais.
   2. Adicionar 500 ul de tampão de fixação de 100 ul de suspensão de células.
   3. Incubar os tubos à temperatura ambiente durante 15 min num agitador orbital (100 rpm) no escuro.
2. PBS lavagem:
   1. Adicionar 1 ml de PBS ao tubo. Centrifuga-se a 380 xg durante 3 min a 4 ° C.
   2. Descartar / decanta-se o sobrenadante deixando aproximadamente 100 ul do tubo.
3. Permeabilização com Tween-20:
   1. Preparar tampão de permeabilização que contém 0,7% de Tween-20 em PBS.
   2. Adicionar 500 ul de tampão de permeabilização de 100 ul de suspensão de células.
   3. Incubar os tubos à temperatura ambiente durante 15 min num agitador orbital (100 rpm) no escuro.
4. Lavar as células uma vez com PBS (como descrito na Secção 4.2) e remover o sobrenadante do co tubosmpletely, deixando apenas o sedimento atrás.

5. Coloração Intracelular Antigen ³⁸ (Figura 4)

1. Preparação das soluções de anticorpos primários:
   1. Dilui-se os anticorpos primários em tampão de diluição contendo 1% de albumina de soro bovino, 10% de soro (por exemplo, burro ou soro de cabra normal) e 0,5% de Tween-20 em PBS.
      NOTA: Escolha o soro a ser utilizado, dependendo da espécie os anticorpos secundários foram levantados no.
   2. Alternativamente, usar Zenon rotulagem de fluoresceína o anticorpo primário de acordo com as instruções do fabricante.
      1. Prepare 1 jig de anticorpo primário em PBS a uma diluição adequada (volume total ≤ 20 ul).
      2. Adiciona-se 5 ul de reagente de marcação Zenon fluoresceína IgG (Componente A) à solução de anticorpo.
      3. Incubar a mistura durante 5 minutos à temperatura ambiente.
      4. Adiciona-se 5 ul de reagente de bloqueio Zenon (Componente B) à mistura de reacção.
      5. Incubara mistura durante 5 minutos à temperatura ambiente. Aplicar o anticorpo com a amostra em 30 min.
2. Coloração de anticorpo primário:
   1. Adicionar 100 ul da solução de anticorpo primário para a pelete de células e tritura-se suavemente para misturar.
   2. Alternativamente, adicionar Zenon anticorpo marcado com fluoresceína para a suspensão de células na diluição apropriada.
   3. Incubar os tubos à temperatura ambiente durante 30 min num agitador orbital (200 rpm), protegida da luz. Lavar as células uma vez com PBS (como descreve na Secção 4.2) e remover o sobrenadante dos tubos completamente, deixando apenas o sedimento atrás.
3. Coloração do anticorpo secundário (não necessária para os anticorpos Zenon fluoresceína marcados):
   1. Dilui-se os anticorpos secundários em PBS a uma concentração apropriada.
   2. Adicionar 100 ul da solução de anticorpo secundário para a pelete de células e tritura-se suavemente para misturar. Incubar os tubos à temperatura ambiente durante 30 min num agitador (200 rpm) no escuro.
4. Lavam-se as amostras duas vezes com PBS (como descrito na Secção 4.2).
5. Lavar uma vez com tampão de fluxo (ver secção 3.5).
6. Re-suspender as células em cerca de 150 ul de tampão de fluxo e analisar no citómetro de fluxo.

Figura 4. Co-coloração de superfície e proteínas intracelulares. A citometria de fluxo de dados exemplifica uma comparação entre baseada em anticorpo primário + secundário contra a coloração intracelular com base em fluoresceína Zenon em combinação com coloração de superfície. Positividade exclusiva no eixo y (quadrante superior esquerdo) e o eixo x (quadrante inferior direito) mostra células coradas para MAP2 e CD24, respectivamente. Após co-coloração, MAP2 partilhada e expressão de CD24 pode ser visto no quadrante superior direito (painéis da direita). Comparação do usoAlexa Fluor 488. (Top; AF488) versus Zenon fluoresceína (em baixo) para os rendimentos de rotulagem MAP2 resultados semelhantes por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. Fluxo de análise de citometria

1. Realizar uma análise de citometria de fluxo, imediatamente após a conclusão do protocolo de coloração utilizando um citómetro de fluxo com filtros adequados para a detecção de sinal. Use 488 nm laser vermelho nm azul e 640 com FL-1 (533/30), FL-2 (585/40), e filtros FL-4 (675/25) de banda.
2. Configure portas primárias com base na dispersão frontal e lateral excluindo detritos e células mortas.
3. Definir portões fluorescência para superfície e antígeno intracelular para ≤0.5% com base nas amostras não coradas e indemnizações por sobreposição espectral usando controles manchadas de solteiro.

Resultados

O protocolo aqui apresentado permite abordagens para versátil experimentais (Figura 2). Na sua versão mais curta (passos 1, 3 e 6), ele pode ser considerado como um guia para a coloração simples de antigénios de superfície. Na sua forma mais complexa, um número de paradigmas de co-marcação com uma gama de antigénios intracelulares pode ser prosseguido passos opcionais (2 e / ou 4 a 5). Além d...

Discussão

O protocolo aqui apresentado é bem estabelecido para as culturas de células neurais derivadas de células estaminais humanas, mas pode ser igualmente aplicado a outras fontes de células neurais, incluindo tecido primário ou linhas de células neuronais. Para além das fontes embrionárias, células estaminais ou progenitoras neurais pode ser extraído a partir das regiões do cérebro adulto neurogénicos ^27. Além disso, a citometria de fluxo e FACS pode ser explorada para quantificar, analisar e isolar ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12 (1:1) (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)	Life Technologies	11330057
DPBS without Ca2+ Mg2+	Life Technologies	14190169
Fetal bovine serum, qualified, E.U.-approved, South America origin (FBS)	Life Technologies	10270-106
MEM Non-essential amino acids (100x)	Life Technologies	11140035
TrypLE Express	Life Technologies	12604013
Trypan blue solution, 0.4%	Life Technologies	15250061
Paraformaldehyde	Carl Roth	335.3
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V	PAA Laboratories, Coelbe	K41-001
Tween-20 Detergent	Calbiochem	655205
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)	eBioscience	65-0850-84
DMSO	AppliChem	A1584
Bottle top filters express plus 0.22 µm, 250 ml	Millipore	SCGPU02RE
Cell culture treated flasks (T 25)	NUNC	156367
Cell culture treated flasks (T 75)	NUNC	156499
Conical tubes (15 ml)	Greiner Bio-One	188271
Conical tubes (50 ml)	Greiner Bio-One	227261
Pasteur pipet, glass (150 mm)	STEIN Labortechnik, Remchingen	S03710150
Pipet tips (0.1-10 µl)	Corning	4125
Pipet tips (1-200 µl)	Corning	4126
Pipet tips (100-1000 µl)	Corning	4129
Serological pipets, 5 ml	Corning	4051
Serological pipets, 10 ml	Corning	4101
Serological pipets, 25 ml	Corning	4251
Microcentrifuge tubes (0.5 ml)	Sarstedt	72,699
Microcentrifuge tubes (1.5 ml)	Greiner Bio-One	616201
Microcentrifuge tubes (2.0 ml)	Sarstedt	72,695,500
Anti-Human CD24 APC monoclonal antibody	eBioscience	17-0247-42	Working dilution 1:50
Anti-Human CD54 PE monoclonal antibody	eBioscience	12-0549-42	Working dilution 1:50
Neuronal Class III β-Tubulin (Tuj1) polyclonal antibody	Covance	PRB-435P	Working dilution 1:2,000
Alexa Fluor 488 Donkey anti Rabbit	Life Technologies	A21206	Working dilution 1:2,000
Zenon® Fluorescein Rabbit IgG Labeling Kit	Life Technologies	Z-25342
Neubauer-Improved counting chamber	Marienfeld	0640010
Vortex	Scientific Industries	G560E
Thermomixer comfort	Eppendorf	5355 000.001
Accuri C6 flow cytometer	Becton Dickinson (BD)	653118
Microcentrifuge refrigerated, PerfectSpin 24 R	Peqlab	91-PSPIN-24R
Orbital shaker, Unimax 1010	Heidolph	543-12310-00
Centrifuge refrigerated, Rotanta 96 RC	Hettich	4480-50
Class II Biological safety cabinet Safe 2020	Thermo Scientific	51026640
CO2 Incubator, Heracell 240i	Thermo Scientific	51026331
Vacuum system, Vacusafe comfort	Integra Biosciences	158320
Microscope, Axiovert 40 CFL	Zeiss	451212
Pipet controller, accu-jet pro	Brand	26303
Micropipet, Pipetman neo P20N (2-20 µl)	Gilson	F144563
Micropipet, Pipetman neo P200N (20-200 µl)	Gilson	F144565
Micropipet, Pipetman neo P1000N (100-1000 µl)	Gilson	F144566