Cytométrie en flux pour les protocoles surface et intracellulaire Antigen analyses des types cellulaires de neurones

Résumé

We provide a detailed description of a protocol for flow cytometric analysis of surface antigens and/or intracellular antigens in neural cell types. Critical aspects of experimental planning, step-by-step methodological procedures, and fundamental principles of flow cytometry are explained in order to enable neurobiologists to exploit this powerful technology.

Résumé

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of protocols for flow cytometric analysis of the cluster of differentiation (CD) surface antigens and intracellular antigens in neural cell types. Our step-by-step description of the methodological procedures include: the harvesting of neural in vitro cultures, an optional carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeling step, followed by surface antigen staining with conjugated CD antibodies (e.g., CD24, CD54), and subsequent intracellar antigen detection via primary/secondary antibodies or fluorescently labeled Fab fragments (Zenon labeling). The video demonstrates the most critical steps. Moreover, principles of experimental planning, the inclusion of critical controls, and fundamentals of flow cytometric analysis (identification of target population and exclusion of debris; gating strategy; compensation for spectral overlap) are briefly explained in order to enable neurobiologists with limited prior knowledge or specific training in flow cytometry to assess its utility and to better exploit this powerful methodology.

Introduction

La cytométrie en flux a été largement exploitée dans l'immunologie, hématologie et en oncologie pour définir des populations de cellules via des propriétés intrinsèques de dispersion, l'expression d'antigènes de surface cellulaire, et d'autres paramètres de fluorescence ^3.1. Nos connaissances dans le sang le développement de la lignée et la maladie sont le résultat d'un degré significatif de l'amélioration continue de cette méthodologie après sa mise en œuvre initiale de ^4,5. Sensibilisation accrue du potentiel analytique quantitative et globale de cytométrie en flux a récemment encouragé son utilisation plus répandue dans la recherche sur les cellules souches et peut permettre des progrès similaire profonde dans un délai plus court ^6. Toutefois, l'application de la cytométrie en flux pour analyser spécifiquement et isoler des populations de neurones a longtemps été considérée comme difficile. Contrairement aux cellules hématopoïétiques qui existent naturellement en suspension, des types de cellules neurales sont typiquement récoltées à partir de sources excessivement complexes qui peuvent comprendre des cellules gliales et divers outres cellules environnantes ainsi que d'un réseau complexe de neurones de processus portant. Par conséquent, la neurobiologie a encore mis en œuvre la polyvalence de cytométrie de flux à son potentiel complet dans les routines quotidiennes de recherche. Toutefois, aussi longtemps que la suspension de cellules viables unique peut être générée (et protocoles ont été conçus et optimisés à cet effet ^7), la cytométrie en flux et les cellules activé par fluorescence (FACS) peut être considéré comme un élément précieux du répertoire analytique en neurobiologie ^8-11.

. Figure 1. Principe de l'analyse et de composants un cytomètre de flux cytométrie flux cytomètres de flux comprennent trois systèmes principaux: fluidiques, l'optique et l'électronique. Un écoulement laminaire de cellules en suspension (préparée à partir de tissu primaire ou en culture in vitro) est accomplie par la gaine de fluid via focalisation hydrodynamique, limitant l'échantillon à son noyau central. Les éléments optiques sont constitués de lasers qui illuminent le flux de cellules et de filtres optiques qui dirigent le signal de détecteurs appropriés. Les signaux lumineux détectés sont convertis en signaux électroniques, ensuite traitées par un ordinateur et visualisées sur un moniteur pour l'analyse des données et de déclenchement. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Les utilisateurs de flux profit des méthodes de cytométrie d'au moins une compréhension de base des fondamentaux sous-jacents, y compris les blocs de construction d'un cytomètre (pour revue voir ^12,13; voir aussi la figure 1). Un faisceau laser croise un flux fluide hydrodynamique concentré qui contient les cellules en suspension, qui à son tour passent par le faisceau laser dans "fichier unique" un après l'autre. Le interceptisur une cellule (ou tout autre particule, d'ailleurs) avec les résultats du laser dans la diffusion de la lumière à partir de ce point d'interrogation. La lumière diffusée peut être détectée dans la direction de poursuite laser (diffusion vers l'avant, associée à la taille de la particule), ainsi que perpendiculairement à sa direction (dispersion latérale; reflétant la granulosité de la particule / cellule). Ces propriétés de dispersion susmentionnés ne nécessitent pas de marquage spécifique, ce est pourquoi un échantillon non marqué (ou encore les débris cellulaires, des bulles d'air, etc.) va générer un signal (événement) sur la bivariée diffusion vers l'avant par rapport diagramme de dispersion latérale couramment utilisé pour déclenchement initial. En utilisant les lasers et des filtres spécifiques pour l'excitation et l'émission des spectres correspondant appropriées, une cellule peut être analysé pour déterminer sa positivité, le niveau d'intensité, ou l'absence de marqueurs fluorescents. La majorité des applications de cytométrie en flux ont porté sur la caractérisation par des antigènes de surface cellulaire. Contrairement à la LINEAG hématopoïétiquee, la lignée de neurones est resté moins largement définie selon les modèles ⁵ d'expression de l'épitope de surface. Un avantage de l'exploitation des antigènes de surface est que les cellules vivantes peuvent être soumis à des paradigmes de tri cellulaire telles que FACS. En revanche, l'antigène intracellulaire coloration nécessite fixation et perméabilisation étapes de médiation de l'interaction épitope-anticorps, ce qui empêche les applications en aval qui nécessitent des cellules viables. Fait à noter, ces approches permettent encore de nombreux essais quantitatifs ¹⁴ ainsi que des analyses en aval pour l'ARN et l'expression des protéines ^15. Hématologie, l'immunologie et de l'oncologie ont souvent utilisé plus d'une douzaine de marqueurs en collaboration pour définir des sous-populations particulières ^16. En outre, la cytométrie de masse CyTOF ou peuvent maintenant être utilisés pour analyser jusqu'à 30 paramètres simultanément ^17,18.

Pour des applications de cellules souches neurales, ainsi que des cultures primaires ^14,19,20 le hétérogénéité des cellules dansvitro est un phénomène commun ^21-23. Les cellules qui ne représentent pas la population cible d'intérêt incarnent un facteur potentiellement confusion pour la lecture expérimentale ^24,25. Idéalement, les différents sous-ensembles cellulaires présentes dans une suspension de cellules hétérogène portent les profils d'expression de l'antigène distinctes (connus ou encore à déchiffrer), qui peuvent être utilisés pour définir ces différentes populations. La cytométrie en flux peut donc jouer un rôle crucial dans la résolution de l'hétérogénéité cellulaire et, ainsi, faciliter les applications biomédicales (essais in vitro, thérapie cellulaire) et d'optimiser la lecture quantitative en se concentrant sur ​​le sous-ensemble le plus pertinent ^24,26. Diverses combinaisons d'antigènes de surface ont été identifiés au cours des dernières années afin de permettre la quantification et l'isolement de types spécifiques de cellules neurales. Cela comprend CD133 pour l'enrichissement de cellules souches neurales ^27, une combinaison du CD15 / CD24 / CD29 des antigènes de surface pour l'isolement de NSC, differentiaTed neurone et les cellules de la crête neurale ²⁸ ou CD15 / CD24 / CD44 / CD184 / CD271 pour isoler des sous-ensembles de neurones et cellules gliales ^25, entre autres signatures ^29,30. Au-delà de neurones comprennent des marqueurs gliaux A2B5 ^{31, 25} CD44, NG2 ³² et ³³ GLAST. Une publication récente a exploité le mésencéphale platelage précurseur marqueur CORIN ^34,35 pour enrichir précurseurs dopaminergiques dans la maladie de Parkinson transplantation de cellules paradigmes ^36. CD molécules ne sont pas seulement des marqueurs, mais fonctionnellement pertinents de médiateurs interactions cellule-cellule et de la capacité d'une cellule à répondre à des signaux à partir de molécules de la matrice extracellulaire et des facteurs de croissance ^37. Une stratégie de renforcer encore l'arsenal des antigènes CD combinatoires pour caractériser le développement de la lignée neuronale est d'utiliser des marqueurs intracellulaires connues pour cribler et définir des combinaisons d'antigènes de CD pour un type cellulaire particulier d'intérêt. Nous avons récemment exploité une telle approche et identifié CD49F ^- / CD200 des profils d'expression combinatoires ^élevées que une nouvelle approche pour enrichir des sous-ensembles de neurones différenciés neuronale pluripotentes induites systèmes de culture de cellules souches ^38. Ici, nous incluons et discutons ce dernier protocole (et des variations de ceux-ci en option), dans lequel une coloration de surface et une coloration intracellulaire peuvent être utilisés simultanément pour définir des sous-populations de cellules neurales par cytométrie de flux.

Figure 2. Schéma du options de protocole expérimental. La figure illustre une représentation schématique des principales étapes dans le protocole. Les étapes facultatives (CFSE de colorants d'étiquetage ou d'antigène intracellulaire) sont indiquées par des cadres gris clair. Après la récolte, il est indispensable pour évaluer la viabilité cellulaire et nombre de suspensions de cellules neurales avant la coloration de la surface cellulaire. Positifainsi que des contrôles négatifs doivent être inclus, en plus des échantillons d'intérêt. Les échantillons peuvent être analysés par analyse de cytométrie en flux et / ou utilisés dans les paradigmes de triage des cellules. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Bien que nous ayons précédemment utilisé anticorps primaire en combinaison avec un anticorps secondaire pour la coloration intracellulaire ^38, nous introduisons maintenant étiquetage non covalente de l'anticorps primaire par l'intermédiaire de fragments Fab fluorescents (d'étiquetage Zenon) comme une légère variation, ce qui réduit les étapes de manipulation de la cellule ^39. En outre, comme un autre exemple de la polyvalence du protocole, nous employons un étiquetage facultatif d'un sous-ensemble expérimentale par carboxyfluorescéine succinimidyl ester (CFSE) avant l'antigène de surface de coloration. Cette CFSE pré-étiquetage permet la comparaison directe immédiate de deux lignées cellulaires ou des conditions expérimentales (CFSE marqué vs. non marqué) dans un tube à échantillon unique, la réduction ou la variance des différences subtiles dans le temps d'incubation et l'enregistrement anticorps. CFSE est un colorant fluorescent mis en place qui est couramment utilisé pour le suivi de la cellule ^40, dans la prolifération ^{41,42 43,44} expériences par code barre. Enfin, alors que des mesures réelles de tri (FACS, séparation immunomagnétique ou immunopanning) ne font pas partie de ce protocole, en principe, les procédures de récolte et d'étiquetage décrites ici ne échantillons de rendement qui peuvent être soumis à la surface l'antigène ou des applications intracellulaires base étiquetage-tri ^{15 25,28.}

Avec cet article, nous visons à: résumer une surface viable protocole antigène coloration ^25,28, résumer un protocole pour la détection de cibles intracellulaires ainsi que la surface combinée et intracellulaire analyse de l'antigène ^38, présenter un CFSE étiquetage de teinture étape intracellulaire ^41,45 comme un option expérimentale pour comcomparative analyse des populations de cellules neurales, et résumer les approches à l'écoulement analyse cytométrique (des contrôles appropriés ^13,46, ouverture de porte stratégie et la présentation des données ^47).

Protocole

1. Neural cellulaire récolte

1. Évaluation au microscope:
   1. Avant d'entreprendre une expérience, vérifier l'état de la culture avec champ lumineux ou microscopie à contraste de phase.
      REMARQUE: Bien que le tissu neural primaire obtenu à partir dissections est, en principe, également ouvertes à couler analyse cytométrique ^14,28, se il vous plaît noter que l'accent mis par le protocole est sur ​​les cellules obtenues à partir de systèmes de cellules neurales in vitro.
2. La récolte des cellules ^7:
   1. Lavez délicatement le plat / flacon de cellules adhérentes avec Mg ²⁺ / Ca ²⁺ libre phosphate salin (PBS) à température ambiante (par exemple, 5 ml pour flacon T75, 3 ml par puits pour plaque de 6 puits, ou 10 ml boîte de 10 cm).
      NOTE: Le PBS utilisé dans le protocole est Mg ²⁺ / Ca ²⁺ libre.
      1. Pour l'exemple vidéo, utiliser un flacon T75 de cellules de neuroblastome SH-SY5Y à 80% de confluence. Appliquer étapes de lavage supplémentaires dans les cas oùconsidérable débris est présent dans la coupelle.
      2. Considérons lavages avec du sérum, Percoll, Ficoll ou ⁴⁹ gradients de centrifugation ⁴⁸ PBS contenant de l'albumine et / ou des billes disponibles dans le commerce ^50,51. L'élimination de la myéline et d'autres lipides ou autres impuretés est essentiel, en particulier lorsque les sources de tissus adultes primaires sont utilisés.
   2. Ajouter préchauffé (37 ° C) remplacement de la trypsine à un volume approprié qui recouvre toute la surface du récipient de culture de tissus.
      NOTE: Vous pouvez également envisager de Accutase ou d'autres options de digestion enzymatique. Cette étape critique peut affecter négativement l'expression de l'épitope de surface (voir ^7).
   3. Incuber le plat / fiole à 37 ° C pendant 2-5 min (selon le type cellulaire) pour permettre aux cellules de se détacher. Tapoter doucement le récipient de culture de tissu ou de niveau avec une pipette sérologique pour déloger les cellules. Évitez de trop digestion (car cela peut causer la perte de cellules et la coagulation à des stades ultérieurs).
   4. Quench le remplacement de la trypsine en ajoutant deux fois le volume de tampon d'écoulement (2% de FBS dans du PBS) et recueillir les cellules dans un tube conique de 15 ml.
   5. Triturer doucement la suspension de cellules en utilisant une pipette microlitres (100 - 1 000 pi) ou une pipette sérologique de 5 ml pour préparer une suspension cellulaire unique.
   6. Centrifuger les cellules à 220 xg pendant 5 min à 25 ° C. Aspirer soigneusement le surnageant laissant le culot derrière.
   7. Remettre en suspension le culot dans un volume approprié de tampon d'écoulement, en fonction de la taille de la pastille (par exemple, pour une confluence flacon T75 de cellules SH-SY5Y le rendement typique est d'au moins 10 x 10 ⁶ cellules, dans ce cas, les cellules sont remis en suspension dans 5 ml de tampon de flux).
      NOTE: Si plus gros morceaux ou coagulation sont observées, filtrer à travers un 30 - 100 um mesh.
3. Le comptage des cellules ^52:
   1. Transférer une petite portion aliquote de la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation et diluer à un rapport défini dans un volume de trypan bleu ou un colorant viabilité alternatif avant le transfert à un hémocytomètre automatique ou système de comptage de cellules.
   2. Diluer la suspension cellulaire à une concentration de 1 x 10 ⁶ cellules viables / ml en ajoutant le volume approprié de tampon d'écoulement ou du PBS avec 0,1% de BSA (si le traitement de l'étiquetage des CFSE).
      NOTE: L'iodure de propidium, 7 D-aminoactinomycine, annexine V et kits de dosage de viabilité corrigeables disponibles dans le commerce représentent d'autres options afin d'évaluer la viabilité des cellules. En outre, des dosages d'apoptose en utilisant la caspase-3 fluorescence comme décrit précédemment ⁵³ peuvent être utilisés. Canaux fluorescents seront "occupés" par ces réactifs qui peuvent limiter les options pour les étapes suivantes si inclus dans tous les échantillons.

2. intracellulaire Dye étiquetage Utilisation CFSE (Figure 3)

1. Diluer le CFSE à une concentration de stock souhaité qui peut être facilement utilisé.
   NOTE: Pour ces expériences, une concentration de l'action de0,01 mM a été utilisé. Déterminer la concentration de travail optimal de CFSE empiriquement.
2. Ajouter 10 ul d'une solution 0,01 mM de CFSE par ml de cellules (section 1.3.2, la concentration de 1 x 10 ⁶ cellules / ml dans du PBS + BSA à 0,1%) pour une concentration finale de 0,1 uM. Brièvement vortex pour bien mélanger.
   REMARQUE: concentrations CFSE utilisés ici sont environ dix fois plus faible que celles couramment appliquées dans les essais de prolifération, d'où la toxicité cellulaire du colorant est minime. Nous ne observons pas d'effets négatifs sur la viabilité des cellules.
3. Incuber pendant 5 min à température ambiante avec une agitation constante (200 rpm). Protéger de la lumière.
4. Stopper la teinture en ajoutant 5 volumes de tampon d'écoulement dans les tubes. Centrifuger à 94 g pendant 5 min à température ambiante.
5. Jeter le surnageant laissant le culot derrière. Remettre en suspension les cellules avec 5 volumes de tampon d'écoulement.
6. Centrifuger à 94 g pendant 5 min à température ambiante. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans du tampon de flux à une concentration de 1 x 10 ⁶ cellules / ml.
7. Ajouter un nombre égal de cellules non colorées présentant un intérêt pour la suspension de cellules colorées. Procéder à la surface protocole de coloration antigène (section 3).

Figure 3. Détection de l'expression différentielle de l'antigène de surface de CD entre deux lignées cellulaires par l'intermédiaire de cellules SH-SY5Y de neuroblastome CFSE colorant étiquetage. Sont pré-marquées avec CFSE pour identification ultérieure par rapport à des fibroblastes BJ non marqués. Co-coloration de l'échantillon mélangé (panneaux de droite) avec des marqueurs de surface CD24 ou CD54 (à la fois conjugué à APC) démontre que les lignées cellulaires sont facilement distinguables à cause de la coloration CFSE (flèches = SH-SY5Y, des pointes de flèches = fibroblastes BJ). La majorité des cellules SH-SY5Y expriment CD24 mais pas CD54 (ICAM-1). En revanche, les fibroblastes BJ (CFSE-négatif) sont positives pour CD54 mais largement négatif pour CD24.Cible "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig3highres.jpg" = "_ blank"> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

3. coloration de surface cellulaire

1. tubes d'étiquetage y compris les échantillons et les contrôles critiques (voir le tableau 1).

Tube pas.	Nom Sample	Antigen-fluorophore	Dilution
1	Cellules non colorées	-
2	Teinté Simple	CD24-APC	01h50
3	Teinté Simple	TUJ1-Alexa Fluor 488 nm	1: 2000
4	Double teinté	CD24-APC	01h50
		TUJ1-Alexa Fluor 488 nm	1: 2000
5	Teinté Simple	Secondaire seulement: Alexa fluor 488 nm	1: 2000

Tableau 1. L ist de tubes à inclure dans un flux typique cytométrie expérience. Le tableau montre un ensemble minimal de tubes d'échantillon requis pour une expérience de co-coloration décrit dans cet article vidéo. Une expérience idéale doit inclure tous les contrôles nécessaires (contrôles négatifs, positifs de compensation ainsi que) pour l'interprétation précise des résultats obtenus.

2. Ajouter 100 pi de suspension cellulaire (de la section 2.7 ou 1.3.2) à chaque tube de 1,5 ml.
   NOTE: Assurez-vous un minimum de 0,1 x 10 ⁶ cellules sont présents pour 100 ul de suspension cellulaire.
3. Ajouter fluorophore conjugué anticorps à l'échantillon à une dilution appropriée.
   NOTE: Déterminer la dilution de travail pour chaque anticorps avant l'expérience. Voir le tableau 2 pour une liste of antigènes de surface de neurones.

Antigène	Type de cellule	Référence
CD15	Les cellules souches neurales	[28, 67]
CD24	Cellules neuronales	[28, 68]
CD29	Les cellules souches neurales	[28, 69, 70]
CD44	Les cellules gliales	[25]
CD49f	Les cellules souches neurales	[38]
CD56 (NCAM)	Cellules neuronales	[71]
CD133	Les cellules souches neurales	[27]
CD184	Les cellules souches neurales et les cellules gliales	[25]
CD200	Cellules neuronales	[38]
CD271	Les cellules souches de la crête neurale	[25]
A2B5	Les cellules gliales	[31]
CORIN	précurseurs dopaminergiques	[35, 36]
FORSE1	Les cellules souches neurales (NSC)	[72]
GLAST	Les cellules gliales	[33]
NG2	Les cellules gliales	[32]

Tableau 2. Sélection des antigènes de surface de neurones. Ce tableau fournit une liste des épitopes de surface trouvés être exprimé par divers types de cellules neurales pour illustrer le panneau croissante des antigènes de surface utilisées pour caractériser la lignée de neurones. Notez que cette sélection est loin d'être complète et que la plupart de ces marqueurs sont également exprimée par une série d'autres cellules neurales et non neuronaux. Par conséquent, des combinaisons de plusieurs marqueurs seront nécessaires pour mieux définir et isoler les sous-ensembles de neurones indiqués.

4. Incuber pendant 30 min sur un agitateur orbital (200 tpm) dans l'obscurité.
5. Flux lavage tampon
   1. Ajouter 1 ml de tampon d'écoulement dans les tubes. Centrifuger à 380 g pendant 4 min à 4 ° C.
   2. Jeter le surnageant laissant le culot derrière.
6. Répétez l'étape de lavage.
7. Après le second lavage, décanter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans du tampon de flux à un volume final de 100 ul.
8. Utilisation échantillon pour l'analyse par cytométrie en flux. Sinon, passez à la section 4 et 5.
   NOTE: Si les cellules doivent être triés et remis en culture post-FACS (c.-à-suspension de cellules viables sans fixation ou perméabilisation), appliquer les techniques d'asepsie pendant la récolte, la coloration et étapes analytiques.

4. Fixation et perméabilisation ³⁸

1. Fixation utilisant paraformaldéhyde (PFA):
   1. Préparer tampon de fixation contenant 2% de PFA dans du PBS.
      NOTE: PFA est nocif pour les humains et l'environnement. Utiliser un équipement de protection individuelle approprié et jeter les déchets conformément à la réglementation locale.
   2. Ajouter 500 ul de tampon de fixation à 100 ul de suspension cellulaire.
   3. Incuber les tubes à température ambiante pendant 15 min sur un agitateur orbital (100 tpm) dans l'obscurité.
2. PBS lavage:
   1. Ajouter 1 ml de PBS au tube. Centrifuger à 380 g pendant 3 min à 4 ° C.
   2. Jeter / décanter le surnageant laissant environ 100 pi dans le tube.
3. Perméabilisation avec du Tween-20:
   1. Préparer le tampon de perméabilisation contenant 0,7% de Tween-20 dans du PBS.
   2. Ajouter 500 ul de tampon de perméabilisation à 100 ul de suspension cellulaire.
   3. Incuber les tubes à température ambiante pendant 15 min sur un agitateur orbital (100 tpm) dans l'obscurité.
4. Laver les cellules une fois avec du PBS (comme décrit à la section 4.2) et retirer le surnageant de la tubes completely, laissant seulement derrière le culot.

5. Antigène coloration intracellulaire ³⁸ (Figure 4)

1. Préparation des solutions d'anticorps primaires:
   1. Diluer les anticorps primaires dans du tampon de dilution contenant 1% d'albumine de sérum bovin, 10% de sérum (par exemple sérum de chèvre d'âne ou normal) et 0,5% de Tween-20 dans du PBS.
      REMARQUE: Choisissez le sérum doit être utilisé selon les espèces les anticorps secondaires ont été soulevées dans.
   2. Vous pouvez également utiliser l'étiquetage Zenon fluorescéine de l'anticorps primaire selon les instructions du fabricant.
      1. Préparer 1 pg de l'anticorps primaire dans du PBS à une dilution appropriée (volume total ≤ 20 ul).
      2. Ajouter 5 ul de fluorescéine Zenon réactif de marquage IgG (le composant A) à la solution d'anticorps.
      3. Incuber le mélange pendant 5 min à température ambiante.
      4. Ajouter 5 ul de réactif de blocage Zenon (composant B) au mélange de réaction.
      5. Incuberle mélange pendant 5 min à température ambiante. Appliquer l'anticorps à l'échantillon dans les 30 min.
2. Coloration à l'anticorps primaire:
   1. Ajouter 100 ul de la solution d'anticorps primaire au culot cellulaire et triturer doucement pour mélanger.
   2. En variante, ajouter un anticorps marqué à la fluorescéine Zenon à la suspension cellulaire à la dilution appropriée.
   3. Incuber les tubes à température ambiante pendant 30 min sur un agitateur orbital (200 tpm), à l'abri de la lumière. Laver les cellules une fois avec du PBS (comme décrit à la section 4.2) et retirer le surnageant des tubes complètement, ne laissant que le culot derrière.
3. Coloration d'anticorps secondaire (non requis pour les anticorps marqués Zenon fluorescéine):
   1. Diluer les anticorps secondaires dans du PBS à une concentration appropriée.
   2. Ajouter 100 ul de la solution d'anticorps secondaire au culot cellulaire et triturer doucement pour mélanger. Incuber les tubes à température ambiante pendant 30 min sur un agitateur (200 rpm) dans l'obscurité.
4. Laver les échantillons deux fois avec du PBS (comme décrit à la section 4.2).
5. Laver une fois avec le tampon de flux (voir section 3.5).
6. Remettre en suspension les cellules dans environ 150 ul de tampon de flux et d'analyser sur le cytomètre de flux.

Figure 4. Co-coloration de la surface et des protéines intracellulaires. Cytométrie en flux de données illustre une comparaison entre repose-anticorps primaire + secondaire par rapport coloration intracellulaire base-fluorescéine Zenon en combinaison avec une coloration de surface. Positivité exclusive sur l'axe des y (quadrant supérieur gauche) et l'axe des x (quadrant inférieur droit) montre des cellules colorées pour MAP2 et CD24, respectivement. Après co-coloration, MAP2 partagée et d'expression CD24 peut être vu dans le quadrant supérieur droit (des panneaux de droite). Comparaison de l'utilisation deAlexa fluor 488. (En haut; AF488) contre Zenon fluorescéine (en bas) pour les rendements MAP2-en matière d'étiquetage des résultats similaires Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

6. Analyse par cytométrie en flux

1. Effectuer une analyse par cytométrie en flux, immédiatement après l'achèvement du protocole de coloration à l'aide d'un cytomètre en flux avec des filtres appropriés pour la détection de signaux. Utilisez 488 nm bleu et 640 nm laser rouge avec FL-1 (533/30), FL-2 (585/40), et des filtres FL-4 (675/25) passe-bande.
2. Mettre en place des portes primaires basées sur la diffusion vers l'avant et le côté excluant les débris et les cellules mortes.
3. Set portes de fluorescence pour la surface et l'antigène intracellulaire ≤0.5% sur la base des échantillons non colorées et l'indemnisation des chevauchement spectral utilisant des contrôles simples colorés.

Résultats

Le protocole présenté ici permet d'approches expérimentales polyvalent (figure 2). Dans sa version la plus courte (étapes 1, 3 et 6), il peut être considéré comme un guide pour les simples coloration des antigènes de surface. Dans sa forme la plus complexe, un certain nombre de paradigmes co-marquage avec une gamme d'antigènes intracellulaires peut être poursuivi (étapes facultatives 2 et / ou 4-5). E...

Discussion

Le protocole présenté ici est bien établie pour les cultures de cellules neurales dérivées de cellules souches humaines, mais peut être appliqué également à d'autres sources de cellules neurales, y compris le tissu primaire ou des lignées de cellules neurales. En plus des sources embryonnaires, les cellules neuronales souches ou progénitrices peuvent être extraits à partir des régions neurogènes de cerveau adulte ^27. En outre, la cytométrie en flux et FACS peuvent être exploitées à quan...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12 (1:1) (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)	Life Technologies	11330057
DPBS without Ca2+ Mg2+	Life Technologies	14190169
Fetal bovine serum, qualified, E.U.-approved, South America origin (FBS)	Life Technologies	10270-106
MEM Non-essential amino acids (100x)	Life Technologies	11140035
TrypLE Express	Life Technologies	12604013
Trypan blue solution, 0.4%	Life Technologies	15250061
Paraformaldehyde	Carl Roth	335.3
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V	PAA Laboratories, Coelbe	K41-001
Tween-20 Detergent	Calbiochem	655205
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)	eBioscience	65-0850-84
DMSO	AppliChem	A1584
Bottle top filters express plus 0.22 µm, 250 ml	Millipore	SCGPU02RE
Cell culture treated flasks (T 25)	NUNC	156367
Cell culture treated flasks (T 75)	NUNC	156499
Conical tubes (15 ml)	Greiner Bio-One	188271
Conical tubes (50 ml)	Greiner Bio-One	227261
Pasteur pipet, glass (150 mm)	STEIN Labortechnik, Remchingen	S03710150
Pipet tips (0.1-10 µl)	Corning	4125
Pipet tips (1-200 µl)	Corning	4126
Pipet tips (100-1000 µl)	Corning	4129
Serological pipets, 5 ml	Corning	4051
Serological pipets, 10 ml	Corning	4101
Serological pipets, 25 ml	Corning	4251
Microcentrifuge tubes (0.5 ml)	Sarstedt	72,699
Microcentrifuge tubes (1.5 ml)	Greiner Bio-One	616201
Microcentrifuge tubes (2.0 ml)	Sarstedt	72,695,500
Anti-Human CD24 APC monoclonal antibody	eBioscience	17-0247-42	Working dilution 1:50
Anti-Human CD54 PE monoclonal antibody	eBioscience	12-0549-42	Working dilution 1:50
Neuronal Class III β-Tubulin (Tuj1) polyclonal antibody	Covance	PRB-435P	Working dilution 1:2,000
Alexa Fluor 488 Donkey anti Rabbit	Life Technologies	A21206	Working dilution 1:2,000
Zenon® Fluorescein Rabbit IgG Labeling Kit	Life Technologies	Z-25342
Neubauer-Improved counting chamber	Marienfeld	0640010
Vortex	Scientific Industries	G560E
Thermomixer comfort	Eppendorf	5355 000.001
Accuri C6 flow cytometer	Becton Dickinson (BD)	653118
Microcentrifuge refrigerated, PerfectSpin 24 R	Peqlab	91-PSPIN-24R
Orbital shaker, Unimax 1010	Heidolph	543-12310-00
Centrifuge refrigerated, Rotanta 96 RC	Hettich	4480-50
Class II Biological safety cabinet Safe 2020	Thermo Scientific	51026640
CO2 Incubator, Heracell 240i	Thermo Scientific	51026331
Vacuum system, Vacusafe comfort	Integra Biosciences	158320
Microscope, Axiovert 40 CFL	Zeiss	451212
Pipet controller, accu-jet pro	Brand	26303
Micropipet, Pipetman neo P20N (2-20 µl)	Gilson	F144563
Micropipet, Pipetman neo P200N (20-200 µl)	Gilson	F144565
Micropipet, Pipetman neo P1000N (100-1000 µl)	Gilson	F144566