器官空调，媒体和应用的产生对乳腺癌转移行为研究器官特异性的影响

摘要

This manuscript describes an ex vivo model system comprised of organ-conditioned media derived from the lymph node, bone, lung, and brain of mice. This model system can be used to identify and study organ-derived soluble factors and their effects on the organ tropism and metastatic behavior of cancer cells.

摘要

Breast cancer preferentially metastasizes to the lymph node, bone, lung, brain and liver in breast cancer patients. Previous research efforts have focused on identifying factors inherent to breast cancer cells that are responsible for this observed metastatic pattern (termed organ tropism), however much less is known about factors present within specific organs that contribute to this process. This is in part because of a lack of in vitro model systems that accurately recapitulate the organ microenvironment. To address this, an ex vivo model system has been established that allows for the study of soluble factors present within different organ microenvironments. This model consists of generating conditioned media from organs (lymph node, bone, lung, and brain) isolated from normal athymic nude mice. The model system has been validated by demonstrating that different breast cancer cell lines display cell-line specific and organ-specific malignant behavior in response to organ-conditioned media that corresponds to their in vivo metastatic potential. This model system can be used to identify and evaluate specific organ-derived soluble factors that may play a role in the metastatic behavior of breast and other types of cancer cells, including influences on growth, migration, stem-like behavior, and gene expression, as well as the identification of potential new therapeutic targets for cancer. This is the first ex vivo model system that can be used to study organ-specific metastatic behavior in detail and evaluate the role of specific organ-derived soluble factors in driving the process of cancer metastasis.

引言

乳腺癌是女性最常见的癌症和癌症相关死亡¹的第二大原因。乳腺癌的死亡率高的主要原因是常规治疗，以减轻和消除转移性疾病的故障;癌症相关死亡的约90％是由于转移^2。理解转移级联的分子机制是至关重要的，以有效地早期和晚期乳腺癌治疗剂的开发。

过去的研究已经帮助阐明乳腺癌转移的多步性质以及它是假设，既癌症进展和转移的结果在很大程度上取决于癌细胞和主机环境³之间的相互作用。临床观察表明，许多癌症显示器官趋向性， 即 ，该倾向优先转移到特定organs.In的CAS乳腺癌E，病人的疾病通常传播或转移至5个主要景点，包括骨，肺，淋巴结，肝，脑^4-6。许多理论已​​经发展到解释这个过程，但只有少数经受住了时间的考验。尤文转移的理论，在20世纪20年代提出的，假设转移thatthe分布严格，由于机械因素;由此肿瘤细胞通过正常定义生理血流模式整个身体携带并在第一毛细管床简单地阻止他们遇到^7。相比之下，斯蒂芬·佩吉特氏1889"种子和土壤"假说认为，额外的分子相互作用负责存活和转移生长，因此癌细胞（"种子"），只能建立自己和产生相应的分子因素proliferatein器官微环境（"土^"）8。将近一个世纪之后，伦纳德在韦斯花了此前公布的尸检资料进行了荟萃分析，证实了尤文的预言，在尸检时发现许多转移性肿瘤的转移是否器官取向是由血流模式单独确定，将有望在预期的比例被发现了。然而，在manyinstances有在某些网站，然后会被尤文提出的力学因素⁹预期形成更少或更多的转移。这些帐户和理论认为特定器官的微环境起到传播模式和多种癌症，包括乳腺癌的随后的生长和存活的关键作用。

过去的研究工作主要集中于肿瘤细胞衍生因子及其在乳腺癌转移^10-12观察到的器官向性的贡献，从器官微环境衍生但是很少有研究探讨因素，可能为建立提供了有利的利基乳腺癌转移。这主要归因于在体外研究器官微环境的组件的技术挑战。

当前文章描述了一种用于研究淋巴结，骨，肺和大脑对人乳腺癌细胞的转移行为的水溶性组分的影响的综合体外模型系统。通过证明不同乳腺癌细胞系显示响应于器官条件培养基器官特异性细胞系特异性和恶性行为对应于它们的体内转移潜能¹³以前的研究已经证实该模型的系统。该模型系统可用于识别和评估可在乳房和其他类型的癌细胞，包括生长，迁移影响的转移行为发挥作用器官特异性的可溶性因子，干样行为，以及基因表达，以及鉴定潜在的新的治疗靶点为癌症。这是可以用来详细研究器官特异性转移行为，并评价在驱动癌转移的方法的器官来源的可溶性因子的作用的第一个体外模型系统。

研究方案

所有动物研究均按照加拿大议会关于动物保护的建议进行的，根据受西方大学动物使用小组委员会批准的方案。

1.器官隔离（肺，脑，骨，淋巴结）

1. 制备四种无菌50ml锥形管中（每个器官中分离）含有大约30毫升无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）的。使用电子天平预称PBS中每管。
2. 安乐死6-12周龄小鼠用CO ₂吸入。小鼠应中的CO ₂室中放置约1 - 2分钟，或直至鼠标停止移动和呼吸。成功安乐死可以用手指手动检查时，可以进一步通过缺乏心跳的确认。避免颈椎脱臼因为这种方法可能会破裂颈部，​​导致难以去除腋下淋巴结的血管。
   注:以前的工作专门用于健康的雌性裸鼠，HSD:无胸腺Nude- Foxn1 ^{NU 13。}
3. 在无菌组织培养罩，将鼠标放在其上的聚苯乙烯泡沫垫回，传播四肢和用针，以保持他们在的地方。
4. 使用无菌镊子和剪刀，剪开腹部皮肤在在生殖器中线向上朝切口。轻轻地拉了回来，从腹部肌肉腹部皮肤并在聚苯乙烯泡沫垫脚的地方。
5. 找到腋窝，上臂和腹股沟淋巴结肿大。
   注意:淋巴结通常是由脂肪组织包围。腹股沟淋巴结是最容易定位，因为它们是两个血管上拉回腹部皮肤的交界表面找到。腋窝及肱淋巴结组织内位于更深并要求组织温柔操纵。
   1. 你已经找到淋巴结后，用剪刀轻轻地，小心地切淋巴结无德从皮肤，脂肪和血管，距鼠标删除它们。要确认正确的解剖，滚动镊子在去除的组织。如果滚过组织镊子时存在硬块，然后淋巴结可能已经被成功删除。
   2. 放置在冰冷的PBS除去淋巴结。
6. 使用镊子和剪刀，通过暴露的腹壁在朝向胸部向上运动切割打开腹腔。通过胸骨小心切开，露出胸腔。
7. 找到肺部下方的隔膜，减少隔膜。它应该拉向因紧张的肋骨。
8. 解除从下方肺和切向气管下面的组织。这使得肺部自由地从胸腔除去。在冰冷的PBS取出心脏和肺整块和地点。该心脏可以从这里或者只是在步骤2中称重前肺部被删除。
9. 去除销，保持小鼠就位在聚苯乙烯泡沫垫。打开鼠标和削减跨越从侧面侧翼后腰一路皮肤。
10. 使用无菌纱布按住鼠标的躯干，剥离鼠标在鼠标的腿和脚的背部皮肤。
11. 使用同一块无菌纱布，保持小腿到位，小心打破鼠标脚的踝关节和近侧剥离在关节皮肤朝着膝关节。
12. 用剪刀，除去从冰冷的PBS膝关节和地点免费胫骨。
13. 与对侧肢体重复步骤1.11）至1.12）。
14. 使用镊子，保持股骨的地方，切掉用剪刀肌肉组织周围并取出股骨，将其放置在冰冷的PBS。
15. 重复步骤1.14）与另一侧肢体。
16. 使用新的一块消毒纱布中，按住鼠标的头部到位。使用镊子和剪刀，轻轻去除皮肤暴露在S库尔。使用剪刀，小心地切枕骨从顶部中心在一条直线和向下线以暴露后大脑。
17. 使用镊子，舀朝前大脑的下面，并删除整个大脑。放置在冰冷的PBS大脑。
18. 重复1.1）至1.17）步骤至少四只小鼠。

2.器官称重

1. 以下器官隔离，称量用电子天平含有肺和脑组织各个PBS管。
2. 通过减去隔离前体重（仅PBS）中从PBS管+器官（肺和脑）的重量计算的重量差。
3. 确定的，从所计算的重量差悬浮组织碎片所需要的介质的量。
   注:肺和脑组织的重量重悬在4归:1介质:组织的比例（体积/重量）。

3. Lung-和Brain-条件培养基的产生

1. 在无菌Ť问题培养罩，包含反转肺或脑三次从器官和吸PBS含血液清除残留血液PBS管。用新鲜的冷PBS重复，直到解决方案出现带有无血清晰。
2. 将肺和大脑在不同60毫米²的玻璃培养皿中。通过反复切片来回使用两个无菌手术刀片，肉肺或脑部，直至组织碎片约有约1 ^立方毫米大小。
3. 悬浮组织片段在适当体积的Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基（DMEM）的（在步骤2.3预先确定的）:补充有1×F12培养基浓缩有丝分裂原的补充和青霉素（50微克/毫升）/链霉素（50微克/毫升）。
4. 添加再悬浮肺或脑组织碎片到6孔板的一个孔中。
5. 孵育组织片段中的媒体，在37℃下24小时和5％ _的 CO _2。孵育后，收集条件培养基对每个组织和further通过在50ml锥形管中加入新鲜的培养基三个等体积稀释。
6. 离心机在4℃下1000 XG在每个器官稀释条件培养基15分钟以除去大的组织碎片。收集介质上清并通过0.22μm注射过滤器进行过滤。
7. 池条件培养基从各器官（ 即 ，肺肺和大脑脑）从多个小鼠占鼠标对鼠标的可变性。分装和储存在-80°C，直到使用条件培养基。

4.代骨髓条件培养基

1. 在无菌组织培养罩，从骨修剪多余的组织，并从骨头骨骺（端件）用剪刀。
2. 通过各骨的中心推1ml的PBS使用骨头27½ģ针，冲水髓腔。这将允许你收集骨髓基质细胞（BMSC）到含有PBS新管。
3. 离心1,000在4℃×g离心5分钟，并用PBS洗BMSC两次。在20ml骨基质细胞生长培养基的悬浮骨髓基质细胞（DMEM:补充有1×F12培养基浓缩有丝分裂原的补充，青霉素（50微克/毫升）/链霉素（50微克/毫升）和10％胎范博芬血清（FBS）的）。
4. 板10毫升悬浮骨髓基质细胞在一个T75烧瓶中。
   注:在每个T75瓶中，每2只合并和板细胞;对四只小鼠，二T75烧瓶需要（约1×10 ^7个细胞/烧瓶）中。
5. 孵育在骨基质细胞生长培养基的骨髓基质细胞24小时，在37℃和5％的CO _2。孵育后，从两个T75瓶中取出媒体并投入新的T75瓶中，贴上标签这个烧瓶"浮瓶"。鲜骨基质细胞生长介质添加到以前的2瓶和培养所有3瓶在37℃和5％ _的 CO _2。
6. 后的细胞达到约70％汇合（约5 - 7天）传代细胞。要做到这一点，除去培养基并用PBS（3 ml的每种洗涤）洗涤细胞两次。移除PBS并加入3ml胰蛋白酶/ EDTA溶液，确保胰蛋白酶覆盖烧瓶的整个表面。细胞解除后离烧瓶（〜2 - 3分钟），通过加入3ml骨基质细胞生长培养基）停止胰蛋白酶反应。离心机900 xg离心在4℃下5分钟，弃去培养基，并悬浮细胞在10ml新鲜骨基质细胞生长培养基。
7. 从所有培养瓶中和通道1池细胞:5成三个新的T75烧瓶，并在37℃和5％的CO _2。经过细胞再次达到70％以上，重复步骤4.6和游泳池和通道都贴壁细胞第二次。重板的所有单元四个T75烧瓶孵育37℃和5％的CO _2。骨基质细胞生长培养基应当用于所有步骤。
8. 使细胞达到汇合，用PBS洗涤细胞三次，并添加骨基质细胞采集的媒体（DMEM:F12培养基+ 1X集中有丝分裂原苏pplement +青霉素（50微克/毫升）/链霉素（50微克/毫升）;以10ml / T75），确保该媒体是自由的FBS。采集骨髓条件培养基72小时后，在-80℃，直到使用0.22微米的过滤器，游泳池，分装和存储进行过滤。
9. 如果需要的话，确认使用针对小鼠的Sca-1，CD105，CD29，和CD73，CD44，抗体使用如先前¹³描述的标准流式细胞技术的分离的骨髓基质细胞（BMSC）的表型。

5.代淋巴结空调传媒

1. 在无菌组织培养罩，包含反转淋巴结三次从淋巴结穿刺血腥PBS清除残留血液PBS管。用新鲜的冷PBS重复，直到解决方案出现带有无血清晰。
2. 放置60 ^平方毫米的玻璃培养皿中的淋巴结。使用两个无菌手术刀片，肉末淋巴结反复切片来回，直到Tissu酒店Ë片段约为1 ^立方毫米大小。
3. 在一个锥形管，在10ml罗斯韦尔园区纪念研究所1640（RPMI 1640），补充有青霉素（50微克/毫升）的介质/链霉素（50微克/毫升），5×10 ^-5 M的无菌β巯基乙醇的悬浮组织碎片（ 1.75微升/500毫升培养基）和10％FBS。
4. 离心机在4℃下900×g离心5分钟，重悬所有细胞在30毫升介质。添加5毫升介质/孔在6孔板中并孵育在37℃下7天，5％的CO _2。
5. 以下7天温育后，弃去培养基，洗涤贴壁细胞用5ml温PBS，加入5毫升的新鲜培养基到每个孔中。使细胞生长到汇合（约5 - 7天），trypsinize，池中的所有细胞，并通过如步骤4.6所述。重板的细胞到6孔板中。重复此步骤三次。
6. 经过三年的通道，让细胞生长至融合，用PBS洗孔三次，并加入2毫升/ DMEM的:F12 + 1X浓缩有丝分裂原的补充和青霉素（50微克/毫升）/链霉素（50微克/毫升），确保该媒体是免费的FBS。在72小时后，池，分装，并储存在-80°C，直到使用收集淋巴结条件培养基。
7. 如果需要的话，确认使用抗小鼠CD45和GP38，抗体使用如先前¹³描述的标准流式细胞技术的分离的淋巴结基质细胞（LNSC）的表型。

6.使用器官的空调媒体对有关癌细胞的转移行为下游化验

1. 一旦器官条件培养基中的步骤1中描述已生成 - 5，用它来进行不同的下游细胞和分子生物学分析以确定可溶性器官衍生的因子对肿瘤细胞的转移行为的影响。标准测定法（在文献中其它地方描述的）的实例包括蛋白质阵列^13，细胞生长测定 ^{13，细胞迁移测定法13，tumorsphere形成14，和RT-PCR 15。原始基础媒体用于生成器官条件培养基（ 即 ，无条件的DMEM:补充有1×F12培养基浓缩有丝分裂原的补充和青霉素（50微克/毫升）/链霉素（50微克/毫升）应该被用作阴性对照。}

结果

器官条件培养基的产生

器官分离和产生条件培养基的方法的概要图/示意图示于图1，与图2所示的过程的代表性照片图像。应该注意的是，当这个协议是第一下发展，肝被列入在我们的分析，因为它是乳腺癌转移的常见部位。然而，由于大量产生和由肝脏分泌的蛋白酶，它是非常困难的，?...

讨论

转移是一个复杂的过程，其中一系列的细胞事件最终都是用于组织浸润和远处肿瘤形成^4,30,31负责。这里提出的离体模型系统可用于转移进展的两个重要方面研究:癌细胞归巢或迁移到特定器官（"到达那里"）和生长在该机构（"生长在那里"）。先前许多研究都集中在识别与癌细胞本身有助于转移过程相关的关键分子的特性。例如，通过琼Massagué的组所做的工作已经确定肺特异性的，?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 ml conical tubes	Thermo Scientific (Nunc)	339652	Keep sterile
1x Phosphate-buffered saline	ThermoFisher Scientific	10010-023	Keep sterile
Nude mice	Harlan Laboratories	Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu	Use at 6 - 12 weeks of age
Polystyrene foam pad	N/A	N/A	The discarded lid (~ 4 x 8 inches or larger) of a polystyrene foam shipping container can be used for this purpose. Sterilize by wiping with ethanol.
Forceps	Fine Science Tools	11050-10	Keep sterile
Scissors	Fine Science Tools	14058-11	Keep sterile
Gauze pads	Fisher Scientific	22-246069	Keep sterile
60 mm2 glass petri dishes	Sigma-Aldrich	CLS7016560	Keep sterile
Scalpel blades	Fisher Scientific	S95937A	Keep sterile
DMEM:F12	Life Technologies	21331-020	Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile
1x Mito + Serum Extender	BD Biosciences	355006	Referred to as "concentrated mitogen supplement" in the manuscript. Keep sterile
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	Keep sterile
Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640)	Life Technologies	11875-093	Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F1051-500ML	Keep sterile
Trypsin/EDTA solution	ThermoFisher Scientific	R-001-100	Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile
6-well tissue culture plates	Thermo Scientific (Nunc)	140675	Keep sterile
0.22 μm syringe filters	Sigma-Aldrich	Z359904	Keep sterile
T75 tissue culture flasks	Thermo Scientific (Nunc)	178905	Keep sterile
Transwells	Sigma-Aldrich	CLS3464	Keep sterile, use for migration assays
Anti-mouse Sca-1	R&D Systems	FAB1226P	use at 10 µl/106 cells
Anti-mouse CD105	R&D Systems	FAB1320P	use at 10 µl/106 cells
Anti-mouse CD29	R&D Systems	FAB2405P-025	use at 10 µl/106 cells
Anti-mouse CD73	R&D Systems	FAB4488P	use at 10 µl/106 cells
Anti-mouse CD44	R&D Systems	MAB6127-SP	use at 0.25 µg/106 cells
Anti-mouse CD45	eBioscience	11-0451-81	use at 5 µl/106 cells
Anti-mouse gp38	eBioscience	12-5381-80	use at 10 µl/106 cells
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250	Keep sterile
Protein arrays	RayBiotech Inc.	AAM-BLM-1-2	Use 1 array per media condition (including negative control), in triplicate