דור של איברים ממוזגים מדיה ויישומים עבור לימוד השפעות איבר ספציפי על התנהגות סרטן שד גרורתי

Summary

This manuscript describes an ex vivo model system comprised of organ-conditioned media derived from the lymph node, bone, lung, and brain of mice. This model system can be used to identify and study organ-derived soluble factors and their effects on the organ tropism and metastatic behavior of cancer cells.

Abstract

Breast cancer preferentially metastasizes to the lymph node, bone, lung, brain and liver in breast cancer patients. Previous research efforts have focused on identifying factors inherent to breast cancer cells that are responsible for this observed metastatic pattern (termed organ tropism), however much less is known about factors present within specific organs that contribute to this process. This is in part because of a lack of in vitro model systems that accurately recapitulate the organ microenvironment. To address this, an ex vivo model system has been established that allows for the study of soluble factors present within different organ microenvironments. This model consists of generating conditioned media from organs (lymph node, bone, lung, and brain) isolated from normal athymic nude mice. The model system has been validated by demonstrating that different breast cancer cell lines display cell-line specific and organ-specific malignant behavior in response to organ-conditioned media that corresponds to their in vivo metastatic potential. This model system can be used to identify and evaluate specific organ-derived soluble factors that may play a role in the metastatic behavior of breast and other types of cancer cells, including influences on growth, migration, stem-like behavior, and gene expression, as well as the identification of potential new therapeutic targets for cancer. This is the first ex vivo model system that can be used to study organ-specific metastatic behavior in detail and evaluate the role of specific organ-derived soluble factors in driving the process of cancer metastasis.

Introduction

סרטן השד הוא הסרטן שאובחן הנפוץ ביותר אצל נשים ואת הסיבה המובילה השנייה של מקרי מוות הקשורים לסרטן ^1. שיעור התמותה הגבוה של סרטן השד הוא בעיקר בשל כישלון הטיפול קונבנציונלי להמתיק ולחסל מחלה גרורתית; כ -90% ממקרי המוות מסרטן הן בשל גרורות ^2. הבנת המנגנונים המולקולריים שבבסיס של המפל גרורתי היא בעל חשיבות עליונה בפיתוח תרופה יעילה הוא מוקדם סרטן השד בשלב מאוחר.

מחקרים שנערכו בעבר סייעו להבהיר את האופי הרב השלבים של גרורות סרטן שד ההיפותיזה הוא התוצאה של שתי התקדמות סרטן הגרורות תלויה במידה רבה על אינטראקציות בין תאים הסרטניים מארח הסביבה ^3. תצפיות קליניות הראו כי סרטן רב להציג כמיהות איברים, כלומר., הנטייה גרורה ספציפי מועדפת organs.In את הרשויותדואר של סרטן השד, המחלה של מטופל בדרך כלל מתפשטת או גרורות עד 5 אתרים מרכזיים, כולל העצם, ריאות, בלוטה לימפה, כבד, ומוח ^4-6. תאוריות רבות פותחו כדי להסביר את התהליך הזה, אבל רק מעטים מהם עמדו במבחן הזמן. התיאוריה של גרורות של יואינג, הציע בשנת 1920, שיערו thatthe חלוקת גרורות נבע אך ורק גורמים מכניים; לפיו תאים סרטניים מבוצעים בכל הגוף על ידי דפוסי זרימת דם פיסיולוגי מוגדרים נורמלים פשוט לעצור במיטת הנימים הראשונה שהם נתקלים ^7. לעומת זאת, השערת 1889 "זרע ואדמה" של סטיבן פאג'ט הציעה אינטראקציות מולקולריות נוספות היו אחראי ההישרדות והצמיחה של גרורות, לפיו תאים סרטניים ( "זרעים") יכולים רק להקים לעצמם microenvironments איבר proliferatein המייצרים גורמים מולקולריים מתאימים ( "אדמה ") ^8. כמעט מאה שנה מאוחר יותר, לאונרד וייס תחתלקח מטה-אנליזה של נתוני נתיחה שפורסמו בעבר ואשר תחזיתו של יואינג שגידולים גרורתי רבים שהתגלו בעת הנתיחה נמצאו בפרופורציות הצפויות כי יהיה צפויות אם נקבעו כמיהות איבר גרורתי ידי דפוסי זרימת דם לבד. עם זאת, ב manyinstances היו גרורות פחות או יותר נוצר באתרים מסויימים, יהיה צפוי על ידי גורמים מכניים המוצע של יואינג ^9. חשבונות אלה והתיאוריות מראים כי microenvironments איבר מסוים לשחק תפקיד קריטי בדפוסי ההפצה והצמיחה הבאה והישרדות של סרטן רב, כוללים סרטן השד.

מאמצי מחקר בעבר התמקדו בעיקר על גורמים שהתקבלו תאים סרטניים תרומתם כמיהות האיבר שנצפו גרורות סרטן השד ^10-12, מחקר קטן אולם יש גורמים בחנו נגזרים microenvironment האיבר שעשויה לספק נישה נוחה להקמהשל גרורות סרטן השד. זאת במידה רבה על האתגרים הטכניים של לימוד מרכיבי המיקרו-סביבת האיבר במבחנה.

המאמר הנוכחי מתאר מערכת מודל מקיף לשעבר vivo לחקר השפעת רכיבים מסיסים של קשרי לימפה, עצמות, ריאות, והמוח על התנהגות גרורתי של תאי סרטן שד אנושיים. מחקרים קודמים תוקפים מערכת מודל זה על ידי ההוכחה כי שורות תאי סרטן השד שונות להציג התנהגות ממאיר תא אונליין ספציפי איבר ספציפי בתגובת תקשורת ממוזג איבר שמתאים שלהם in vivo גרורתי ¹³ פוטנציאליים. מערכת מודל זה יכול לשמש כדי לזהות ולהעריך גורמים מסיסים ספציפיים הנגזר איבר שעשוי לשחק תפקיד בהתנהגות גרורתי של שד וסוגים אחרים של תאים סרטניים, כוללים השפעות על צמיחה, הגירה, הגבעולי התנהגות, ביטוי גנים, כמו גם זיהוי שלמטרות טיפוליות פוטנציאליות חדשות לסרטן. זוהי מערכת מודל vivo לשעבר הראשון, שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד את ההתנהגות גרורתי איבר ספציפי בפירוט כדי להעריך את התפקיד של גורמים מסיסים הנגזרות איבר נהיגה לתהליך של גרורות סרטן.

Protocol

כל המחקרים בבעלי חיים נערכו בהתאם להמלצות של המועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים, תחת הפרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת המשנה השתמש בבעלי חיים באוניברסיטת המערבי.

1. בידוד איברים (ריאות, מוח, עצם, הלימפה)

1. הכן ארבעה צינורות חרוטי 50 מ"ל סטרילי (אחד עבור כל איבר להיות מבודדת) המכיל כ 30 מ"ל של תמיסת מלח שנאגרו פוספט סטרילית (PBS). טרום לשקול צינור אחד של PBS באמצעות משקל אלקטרוניות.
2. להרדים 6-12 בשבוע עכבר ישן משאיפת CO _2. עכברים יש להשאיר בתא CO ₂ למשך כ 1 - 2 דקות או עד העכבר מפסיק לזוז ונשימה. המתת חסד מוצלחת ניתן אישור נוסף על ידי חוסר דופק כאשר בדקו באופן ידני עם אצבע. הימנע נקע בצוואר רחם כשיטה זה עלולה לגרום לפריצת כלי דם של הצוואר המוביל לקושי הסרת בלוטות הלימפה בבית השחי.
   הערה: מחקרים קודמים המשמשים במיוחדעכברים עירום נשי בריא, HSD: athymic Nude- Foxn1 ^{נו 13.}
3. במנדף בתרבית רקמה סטרילית, במקום את העכבר על גבו על כרית קצף פוליסטירן, להפיץ את הגפיים ולהשתמש סיכות כדי לשמור אותם במקום.
4. בעזרת מלקחיים ומספריים סטרילי, לחתוך את עור הבטן על קו האמצע על אברי המין ופצע כלפי מעלה לכיוון הפה. משוך בעדינות בחזרה את עור הבטן מן שרירי הבטן ואת הסיכה במקום על משטח קצף פוליסטירן.
5. אתר את בית השחי, הזרוע, ואת בלוטות הלימפה מפשעתי.
   הערה: בלוטות הלימפה בדרך כלל מוקפים רקמת שומן. בלוטות הלימפה מפשעתי הם הקלים ביותר לאיתור כפי שהם מצאו שטחי בצומת של שני כלי דם על עור הבטן משוך לאחור. בלוטות בית השחי והלימפה הזרוע נמצאות עמוקות בתוך הרקמה ודורשות תמרון עדין של רקמות.
   1. לאחר שאיתרת את בלוטות הלימפה, השתמש במספריים בעדינות ובזהירות לחתוך את לימפה לאdes מהעור, שומן וכלי ולהסיר אותם מן העכבר. כדי לאשר דיסקציה נכונה, לגלגל את המלקחיים על הרקמה שהוסרה. אם גוש קשה קיים כאשר מתגלגלים מלקחיים על הרקמות, ולאחר מכן לימפה סבירה הוסרה בהצלחה.
   2. מניחים בלוטות לימפה שהוסרו ב PBS קר כקרח.
6. באמצעות מלקחיים ומספריים, לפתוח את חלל הבטן על ידי חיתוך דרך דופן הבטן נחשף בתנועה כלפי מעלה לכיוון החזה. בזהירות לחתוך דרך עצם החזה, חושף את חלל בית החזה.
7. אתר את הסרעפת מתחת הריאות לחתוך את הסרעפת. זה צריך למשוך לכיוון הצלעות בשל מתח.
8. הרם את הריאות מתחת וחתך את הרקמה הבסיסית כלפי קנה הנשימה. זה מאפשר לריאות להסירו בחופשיות את חלל בית החזה. הסר את הלב והריאות כמקשה אחת ומניחים PBS קר כקרח. הלב ניתן להסיר מהריאות כאן או ממש לפני שקילת שלב 2.
9. הסר אתסיכות, שמירה על העכבר במקום על משטח קצף פוליסטירן. סובבו את העכבר מעל לחתוך את העור של כל הגב התחתון הדרך מול ירך אל ירך.
10. באמצעות פיסת סטרילית של גזה להחזיק את פלג הגוף העליון של העכבר, לקלף את העור האחורי של העכבר על הרגליים וכפות הרגליים של העכבר.
11. שימוש באותה פיסת גזה סטרילי, להחזיק את הרגל התחתונה במקום, בזהירות לשבור את מפרק הקרסול של הרגל העכבר לקלף את העור מעל המפרק proximally כלפי מפרק הברך.
12. בעזרת מספריים, להסיר את השוקה ללא מפרק הברך ומניחים PBS קר כקרח.
13. חזור על שלבי 1.11) 1.12) עם איבר הפוך.
14. בעזרת מלקחיים, להחזיק את הירך במקום, לחתוך משם לרקמות שרירות באמצעות המספריים להסיר את עצם הירך, הצבתו בקרח הקר PBS.
15. חזור על שלב 1.14) עם איבר הפוך.
16. באמצעות יצירה חדשה של גזה סטרילי, להחזיק את הראש של העכבר במקום. בעזרת מלקחיים ומספריים, להסיר את העור בעדינות כדי לחשוף את היםכול. בעזרת מספריים, לחתוך את הגולגולת העורפית בזהירות מהמרכז העליון בקו ישר וכלפי מטה כדי לחשוף את המוח האחורי.
17. בעזרת מלקחיים, סקופ מתחת למוח לכיוון הקדמי והסר את המוח כולו. מניחים את המוח ב PBS קר כקרח.
18. חזור על שלבים 1.1) ל 1.17) עבור ארבעה עכברים לפחות.

2. איברים שקילים

1. בעקבות בידוד איברים, לשקול כל צינור PBS המכיל ריאות רקמת המוח באמצעות משקל אלקטרוניות.
2. חשב את ההבדל במשקל על ידי הפחתת המשקל טרום בידוד (PBS בלבד) מן המשקל של הצינור + איברי PBS (ריאות ומוח).
3. לקבוע את כמות תקשורת צריכה resuspend שברי רקמה מפער המשקל המחושב.
   הערה: ריאות רקמת המוח היא משקל מתוקנן לפי resuspension בתוך 4: יחס רקמות (כרך / WT): 1 מדיה.

דור 3. Lung- ואת מוח מדיה אוויר

1. בחולצת סטריליברדס נושא התרבות, להפוך צינורות PBS המכילים ריאות או מוח שלוש פעמים כדי להסיר דם שיורית מאיברים לשאוב PBS המכילים דם. חזור עם קר PBS הטרי עד הפתרון נראה ברור ומובן ללא ראיות דם.
2. מניח ריאות ומוח בצלחות פטרי זכוכית נפרדות 60 מ"מ ^2. באמצעות שני להבי אזמל סטרילי, ריאות בשר טחונות או מוח על ידי החיתוך הלוך ושוב מספר פעמים עד שברי רקמה כ ~ 1 מ"מ ³ בגודל.
3. שברי הרקמה Resuspend בנפח המתאים (נקבע בעבר בשלב 2.3) של בינוני של הנשר שונה של Dulbecco (DMEM): התקשורת F12 בתוספת 1x מרוכז תוספת mitogen ו פניצילין (50 מיקרוגרם / מ"ל) / סטרפטומיצין (50 מיקרוגרם / מ"ל).
4. להוסיף רקמת ריאה או המוח מושעה שבר כדי אחד טוב של צלחת 6 באר.
5. דגירה שברי רקמה בתקשורת במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2. לאחר דגירה, לאסוף מותנה מדיה לכל רקמות further לדלל על ידי הוספה שלושה כרכים מקבילים של תקשורת הטריה צינור חרוטי 50 מיליליטר.
6. צנטריפוגה XG ב 1000 ב מדיה בדילול מותנית עבור כל איבר על 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי להסיר שאריות רקמה גדולות. איסוף supernatant התקשורת ולסנן דרך פילטר מזרק 0.22 מיקרומטר.
7. ברכת מותנית תקשורת מכל איבר (כלומר., ריאות עם ריאות ומוח עם מוח) מעכברים מרובים לתת דין וחשבון על השתנות עכבר אל עכבר. Aliquot ולאחסן מותנה התקשורת ב -80 ° C עד השימוש.

דור 4. של מח העצם ממוזג מדיה

1. במנדף בתרבית רקמה סטרילית, לקצץ רקמה עודפת מהעצם ולהסיר אפיפיזות (חתיכות סוף) מהעצמות במספריים.
2. באמצעות חלל מדולרי 27 ½ מחט G, סומק של עצמות ידי דחיפת 1 מ"ל של PBS דרך מרכז כל עצם. זה יאפשר לך לאסוף תאי סטרומה מח עצם (BMSC) לתוך צינור טרי המכיל PBS.
3. צנטריפוגה ב 1,000 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C ולשטוף BMSC פעמים עם PBS. בתאי סטרומה מח עצם Resuspend ב 20 מ"ל של התקשורת צמיחת תאים העצם סטרומה (DMEM: התקשורת F12 בתוספת 1x מרוכז תוספת mitogen, פניצילין (50 מיקרוגרם / מ"ל) / סטרפטומיצין (50 מיקרוגרם / מ"ל) ו בסרום עוברי 10% Boven (FBS) ).
4. פלייט 10 מ"ל של תאי סטרומה מח עצם resuspended ב בבקבוק T75 אחד.
   הערה: שלב ותאי צלחת מכל 2 עכברים בכל בבקבוק T75; במשך ארבעה עכברים, שתי צלוחיות T75 נדרשות (כ 1 x 10 ⁷ תאים / בקבוקון).
5. דגירת תאי סטרומה מח עצם בתקשורת צמיחת תא עצם סטרומה למשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2. לאחר דגירה, להסיר התקשורת משני T75 צלוחיות והכניסו בבקבוק T75 חדש, תווית הבקבוק הזה כמו "לרחפן Flask". הוסף מדיה צמיחת תאי העצם סטרומה טריה 2 צלוחיות קודמות דגירה כל 3 צלוחיות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
6. לאחר התאים מגיעים כ 70% confluency (כ 5 - 7ימים) תאי מעבר. לשם כך, הסר בינוני לשטוף את התאים פעמיים עם PBS (3 מ"ל כל אחד לשטוף). הסר PBS ולהוסיף 3 מ"ל של תמיסת טריפסין / EDTA, הבטחת טריפסין שמכסה את כל פני השטח של הבקבוק. לאחר התאים להרים את הבקבוק (~ 2 - 3 דקות), להפסיק trypsinization תגובה על ידי הוספת 3 מיליליטר תקשורת צמיחת תאי עצם סטרומה). צנטריפוגה 900 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C, להשליך תקשורת, ותאי resuspend ב 10 מיליליטר של תקשורת צמיחת תאים הטריה עצם סטרומה.
7. תאי ברכה מכל הצלוחיות והמעבר 1: 5 לשלוש צלוחיות T75 חדשות לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2. לאחר תאים שוב להגיע ל -70%, וחזור על שלב 4.6 וברכה ומעבר לכל התאים החסידים בשנית. Re-צלחת כל התאים ארבע צלוחיות T75 דגירה 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2. תקשורת צמיחת עצם תא סטרומה אמורה לשמש עבור כל השלבים.
8. אפשר תאים מגיעים למפגש, לשטוף תאים שלוש פעמים עם PBS ולהוסיף תקשורת אוסף תא עצם סטרומה (DMEM: F12 תקשורת + 1x su mitogen המרוכזpplement + פניצילין (50 מיקרוגרם / מ"ל) / סטרפטומיצין (50 מיקרוגרם / מ"ל); 10 מ"ל / T75), ולוודא כי המדיה הזו היא ללא FBS. אסוף התקשורת עצם ממוזג מח 72 שעות מאוחר יותר, לסנן דרך 0.22 מיקרומטר מסנן, בריכה, aliquot, ולאחסן ב -80 ° C עד השימוש.
9. אם תרצה, לאשר את הפנוטיפ של תאי סטרומה מבודדים מח עצם (BMSC) באמצעות נוגדנים כנגד SCA-1 עכבר, CD105, CD29, CD73 ו, CD44, באמצעות זרימת תקן cytometry טכניקות כפי שתואר לעיל ^13.

דור 5. לימפה צומת ממוזגת מדיה

1. במנדף בתרבית רקמה סטרילית, ללא מרחב צינור PBS המכיל בלוטות הלימפה שלוש פעמים כדי להסיר דם שיורית בלוטות הלימפה לשאוב PBS הדמים. חזור עם קר PBS הטרי עד הפתרון נראה ברור ומובן ללא ראיות דם.
2. מניחים בלוטות הלימפה ב -60 מ"מ ² זכוכית בצלחות פטרי. באמצעות שני להבים אזמל סטרילי, בלוטות לימפה בשר טחון על ידי חיתוך הלוך ושוב מספר פעמים עד tissuשברי דואר הם כ 1 מ"מ ³ בגודל.
3. בתוך צינור חרוטי, שברי הרקמה resuspend ב 10 מ"ל של מכון ממוריאל פארק רוזוול 1640 (RPMI1640) התקשורת השלימו עם פניצילין (50 מיקרוגרם / מ"ל) / סטרפטומיצין (50 מיקרוגרם / מ"ל), 5 x 10 ^-5 M סטרילי β-mercaptoethanol ( 1.75 μl / 500 מ"ל מדיה) ו -10% FBS.
4. צנטריפוגה ב 900 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C ו resuspend כל התאים 30 מ"ל התקשורת. הוסף 5 מ"ל מדיה / היטב צלחת 6-היטב דגירה במשך 7 ימים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
5. לאחר דגירה 7 יום, להשליך התקשורת, לשטוף תאים חסיד עם 5 מ"ל PBS חם ולהוסיף 5 מ"ל התקשורת טרי היטב כל אחד. אפשר לתאים לגדול כדי confluency (כ 5 - 7 ימים), trypsinize, בריכת כל התאים, ומעבר כמתואר בשלב 4.6. Re-צלחת תאים לצלחת 6 באר. חזור על פעולה זו שלוש פעמים.
6. אחרי שלושה קטעים, ולאפשר לתאים לגדול confluency, לשטוף בארות שלוש פעמים עם PBS ולהוסיף 2 מ"ל / היטב DMEM: F12 + 1xתוספת ו פניצילין mitogen מרוכז (50 מיקרוגרם / מ"ל) / סטרפטומיצין (50 מיקרוגרם / מ"ל), כדי להבטיח את המדיה הזו היא ללא FBS. אסוף התקשורת ממוזג בלוטת לימפה לאחר 72 שעות, בריכה, aliquot, ולאחסן ב -80 ° C עד השימוש.
7. אם תרצה, לאשר את הפנוטיפ של תאים סטרומה בלוטת לימפה מבודדים (LNSC) באמצעות נוגדנים כנגד CD45 העכבר gp38, באמצעות זרימה תקן cytometry טכניקות כפי שתואר לעיל ^13.

6. שימוש מדיה איברים ממוזגים עבור מבחני Downstream קשורים להתנהגות גרורתי של תאי הסרטן

1. ברגע התקשורת ממוזג האיבר נוצר כמתואר בשלבי 1 - 5, ולהשתמש בו כדי לבצע תא במורד זרם שונה מבחני ביולוגיה מולקולריים כדי לקבוע את השפעתם של גורמים מסיסים הנגזר איבר על ההתנהגות גרורתי של תאים סרטניים. דוגמאות של מבחני תקן (תארו במקום בספרות) כוללות מערכי חלבון ^13, מבחני צמיחה הסלולר ^{13, הגירה הסלולר מבחני 13, tumorsphere היווצרות 14, ו RT-PCR 15. תקשורת הבסיס המקורית השתמשה כדי ליצור את התקשורת ממוזג איבר (כלומר, בלתי מותנית DMEM:. תקשורת F12 בתוספת 1x מרוכזת mitogen כתוספת פניצילין (50 מיקרוגרם / מיליליטר) / סטרפטומיצין (50 מיקרוגרם / מיליליטר) אמור לשמש כביקורת שלילית .}

תוצאות

הדור של מדיה איברים ממוזג

דיאגרמה סקירה / סכמטי של התהליך של בידוד איברי דור התקשורת המותנה מוצג באיור 1, עם דימויים מצולמים נציג של ההליך שמוצג באיור 2. יצוין כי כ?...

Discussion

גרורה היא תהליך מורכב שבאמצעותו סדרה של אירועים הסלולר היא בסופו של דבר אחראי על גידול פלישת רקמות ומרוחק ההקמה ^4,30,31. מערכת מודל vivo לשעבר המוצגת כאן יכולה להיות מנוצלת כדי ללמוד שני היבטים חשובים של התקדמות גרורתי: ביות תאים סרטנית או הגירת איבר מסוים ( "?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 ml conical tubes	Thermo Scientific (Nunc)	339652	Keep sterile
1x Phosphate-buffered saline	ThermoFisher Scientific	10010-023	Keep sterile
Nude mice	Harlan Laboratories	Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu	Use at 6 - 12 weeks of age
Polystyrene foam pad	N/A	N/A	The discarded lid (~ 4 x 8 inches or larger) of a polystyrene foam shipping container can be used for this purpose. Sterilize by wiping with ethanol.
Forceps	Fine Science Tools	11050-10	Keep sterile
Scissors	Fine Science Tools	14058-11	Keep sterile
Gauze pads	Fisher Scientific	22-246069	Keep sterile
60 mm2 glass petri dishes	Sigma-Aldrich	CLS7016560	Keep sterile
Scalpel blades	Fisher Scientific	S95937A	Keep sterile
DMEM:F12	Life Technologies	21331-020	Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile
1x Mito + Serum Extender	BD Biosciences	355006	Referred to as "concentrated mitogen supplement" in the manuscript. Keep sterile
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	Keep sterile
Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640)	Life Technologies	11875-093	Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F1051-500ML	Keep sterile
Trypsin/EDTA solution	ThermoFisher Scientific	R-001-100	Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile
6-well tissue culture plates	Thermo Scientific (Nunc)	140675	Keep sterile
0.22 μm syringe filters	Sigma-Aldrich	Z359904	Keep sterile
T75 tissue culture flasks	Thermo Scientific (Nunc)	178905	Keep sterile
Transwells	Sigma-Aldrich	CLS3464	Keep sterile, use for migration assays
Anti-mouse Sca-1	R&D Systems	FAB1226P	use at 10 µl/106 cells
Anti-mouse CD105	R&D Systems	FAB1320P	use at 10 µl/106 cells
Anti-mouse CD29	R&D Systems	FAB2405P-025	use at 10 µl/106 cells
Anti-mouse CD73	R&D Systems	FAB4488P	use at 10 µl/106 cells
Anti-mouse CD44	R&D Systems	MAB6127-SP	use at 0.25 µg/106 cells
Anti-mouse CD45	eBioscience	11-0451-81	use at 5 µl/106 cells
Anti-mouse gp38	eBioscience	12-5381-80	use at 10 µl/106 cells
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250	Keep sterile
Protein arrays	RayBiotech Inc.	AAM-BLM-1-2	Use 1 array per media condition (including negative control), in triplicate