Génération des médias et applications Organ-conditionnés pour l'étude Influences spécifiques d'organes sur le cancer du sein métastatique Comportement

Résumé

This manuscript describes an ex vivo model system comprised of organ-conditioned media derived from the lymph node, bone, lung, and brain of mice. This model system can be used to identify and study organ-derived soluble factors and their effects on the organ tropism and metastatic behavior of cancer cells.

Résumé

Breast cancer preferentially metastasizes to the lymph node, bone, lung, brain and liver in breast cancer patients. Previous research efforts have focused on identifying factors inherent to breast cancer cells that are responsible for this observed metastatic pattern (termed organ tropism), however much less is known about factors present within specific organs that contribute to this process. This is in part because of a lack of in vitro model systems that accurately recapitulate the organ microenvironment. To address this, an ex vivo model system has been established that allows for the study of soluble factors present within different organ microenvironments. This model consists of generating conditioned media from organs (lymph node, bone, lung, and brain) isolated from normal athymic nude mice. The model system has been validated by demonstrating that different breast cancer cell lines display cell-line specific and organ-specific malignant behavior in response to organ-conditioned media that corresponds to their in vivo metastatic potential. This model system can be used to identify and evaluate specific organ-derived soluble factors that may play a role in the metastatic behavior of breast and other types of cancer cells, including influences on growth, migration, stem-like behavior, and gene expression, as well as the identification of potential new therapeutic targets for cancer. This is the first ex vivo model system that can be used to study organ-specific metastatic behavior in detail and evaluate the role of specific organ-derived soluble factors in driving the process of cancer metastasis.

Introduction

Le cancer du sein est le cancer le plus fréquemment diagnostiqué chez les femmes et la deuxième principale cause de décès liés au cancer ^1. taux de mortalité élevé de cancer du sein est principalement due à l'échec de la thérapie conventionnelle pour atténuer et éliminer la maladie métastatique; environ 90% des décès liés au cancer sont dus à des métastases ^2. La compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents de la cascade métastatique est primordiale pour le développement de thérapies efficaces à la fois précoce et le cancer du sein à un stade avancé.

Des recherches antérieures ont permis d' élucider la nature multi - étapes des métastases du cancer du sein et il est émis l' hypothèse que le résultat à la fois la progression du cancer et des métastases dépend en grande partie des interactions entre les cellules cancéreuses et l'environnement hôte ^3. Les observations cliniques indiquent que de nombreux cancers présentent un tropisme d'organe, ie., La tendance à métastaser préférentiellement à particulier organs.In le TASe de cancer du sein, la maladie d'un patient se propage habituellement ou des métastases à 5 sites principaux, y compris les os, les poumons, les ganglions lymphatiques, le foie et le cerveau ^4-6. De nombreuses théories ont été développées pour expliquer ce processus, mais seulement quelques-uns ont résisté à l'épreuve du temps. La théorie de Ewing de métastases, proposée dans les années 1920, l'hypothèse quela distribution des métastases était strictement due à des facteurs mécaniques; dans lequel les cellules tumorales sont réalisées dans le corps par des schémas d'écoulement de sang physiologique normal défini et simplement arrêter dans le premier lit capillaire ils rencontrent ^7. En revanche, 1889 "semences et le sol" hypothèse de Stephen Paget a suggéré que les interactions moléculaires supplémentaires étaient responsables de la survie et la croissance des métastases, de sorte que les cellules cancéreuses ( «graines») ne peuvent se mettre en place et microenvironnements d'organes proliferatein qui produisent des facteurs moléculaires appropriés ( «sol ») ^8. Presque un siècle plus tard, Leonard Weiss sousa pris une méta-analyse des données d'autopsie publiés précédemment et confirmé la prédiction de Ewing que de nombreuses tumeurs métastatiques détectées au moment de l'autopsie ont été trouvés dans les proportions prévues qui seraient attendus si le tropisme d'organe métastatique a été déterminée par des modèles d'écoulement de sang seul. Cependant, dans manyinstances il y avait plus ou moins de métastases formées sur certains sites alors seraient attendus par des facteurs mécaniques proposées d'Ewing ^9. Ces comptes et théories suggèrent que microenvironnements d'organes spécifiques jouent un rôle essentiel dans les modèles de diffusion et la croissance ultérieure et la survie de nombreux cancers, notamment le cancer du sein.

Les efforts de recherche antérieurs ont porté principalement sur ​​les facteurs dérivés de cellules tumorales et leur contribution à l'tropisme organe observé dans les métastases du cancer du sein ^10-12, facteurs mais peu de recherches ont exploré dérivées du microenvironnement organe qui peuvent fournir un créneau favorable pour la mise en placedes métastases du cancer du sein. Cela est en grande partie attribuable aux difficultés techniques de l' étude des composants du microenvironnement d'organes in vitro.

Le présent article décrit un système ex vivo du modèle global pour étudier l'influence des composants solubles du ganglion lymphatique, des os, du poumon et du cerveau sur le comportement métastatique des cellules cancéreuses du sein humain. Des études antérieures ont permis de valider ce système modèle en démontrant que les différentes lignées cellulaires de cancer du sein présentent un comportement malin spécifique organe spécifique lignée de cellules et en réponse aux moyens d'organes conditionné qui correspond à leur potentiel métastatique in vivo ^13. Ce système de modèle peut être utilisé pour identifier et évaluer les facteurs solubles spécifiques organes dérivés qui peuvent jouer un rôle dans le comportement métastatique du sein et d'autres types de cellules cancéreuses, y compris les influences sur la croissance, la migration, la tige-comme le comportement, et l'expression des gènes, ainsi que l'identification dede nouvelles cibles thérapeutiques potentielles pour le cancer. Ceci est le premier ex vivo système modèle qui peut être utilisé pour étudier le comportement métastatique spécifique d'organe en détail et d'évaluer le rôle des facteurs solubles organes dérivés dans la conduite du processus de métastase du cancer.

Protocole

Toutes les études sur les animaux ont été menées conformément aux recommandations du Conseil canadien de protection des animaux, en vertu de protocoles approuvés par le Sous-comité des animaux Utiliser l'Université Western.

1. Isolement d'organes (poumon, cerveau, os, ganglions lymphatiques)

1. Préparer quatre tubes de 50 ml stériles coniques (un pour chaque organe à isoler) contenant environ 30 ml de solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS). Pré-peser chaque tube de PBS en utilisant une balance électronique.
2. Euthanasier 6-12 semaine vieille souris par inhalation de CO _2. Les souris doivent être laissés dans la chambre de CO ₂ pendant environ 1 - 2 min ou jusqu'à ce que la souris cesse de bouger et de respirer. l'euthanasie réussie peut être confirmée par un manque de rythme cardiaque lors d'un contrôle manuellement à l'aide d'un doigt. Évitez la dislocation cervicale que cette méthode peut se rompre les vaisseaux sanguins du cou conduisant à des difficultés à retirer les ganglions lymphatiques axillaires.
   Remarque: Des travaux antérieurs ont spécifiquement utilisésouris nues femelles en bonne santé, Hsd: athymiques Nude- Foxn1 ^{nu 13.}
3. Dans une hotte de culture de tissus stériles, placer la souris sur le dos sur un matelas en mousse de polystyrène, répartir les membres et utiliser des broches pour les maintenir en place.
4. En utilisant des pinces et des ciseaux stériles, couper la peau abdominale à la ligne médiane au niveau des organes génitaux et couper vers le haut vers la bouche. Tirez doucement la peau abdominale des muscles abdominaux et la broche en place sur le coussin de mousse de polystyrène.
5. Localisez le axillaire, brachial, et les ganglions lymphatiques inguinaux.
   Note: Les ganglions lymphatiques sont habituellement entourées par le tissu adipeux. Les ganglions inguinaux sont les plus faciles à trouver car ils se trouvent en surface à la jonction de deux vaisseaux sanguins sur la peau abdominale tiré vers l'arrière. ganglions axillaires et lymphatiques brachial sont situés plus profondément dans le tissu et nécessitent des manœuvres en douceur des tissus.
   1. Après avoir localisé les ganglions lymphatiques, utilisez les ciseaux pour couper doucement et soigneusement la lymphe pasdes de la peau, la graisse et les vaisseaux et les retirer de la souris. Pour confirmer la dissection correcte, rouler la pince sur le tissu enlevé. Si une boule dure existe en roulant la pince sur le tissu, puis un ganglion lymphatique a probablement été enlevé avec succès.
   2. Placez les ganglions lymphatiques prélevés dans le froid de la glace PBS.
6. À l'aide des pinces et ciseaux, ouvrir la cavité abdominale en coupant à travers la paroi abdominale exposée dans un mouvement ascendant vers la poitrine. Découpez soigneusement à travers le sternum, l'exposition de la cavité thoracique.
7. Localisez le diaphragme sous les poumons et couper le diaphragme. Il faut tirer vers les côtes en raison de la tension.
8. Soulevez les poumons par le dessous et couper le tissu sous-jacent vers la trachée. Cela permet aux poumons d'être enlevés librement de la cavité thoracique. Retirez le cœur et les poumons en bloc et dans le froid de la glace PBS. Le cœur peut être retiré des poumons ici ou juste avant le pesage dans l'étape 2.
9. Retirer leépingles, en gardant la souris en place sur le coussin de mousse de polystyrène. Retournez la souris et couper la peau du tout le chemin du bas du dos en face de flanc à flanc.
10. En utilisant un morceau de gaze stérile pour maintenir le torse de la souris, peler la peau du dos de la souris sur les jambes et les pieds de la souris.
11. En utilisant le même morceau de gaze stérile, tenir la jambe en place, soigneusement briser l'articulation de la cheville du pied de la souris et peler la peau sur l'articulation proximale vers l'articulation du genou.
12. Avec des ciseaux, enlever le tibia libre de l'articulation du genou et dans le froid de la glace PBS.
13. Répétez les étapes 1.11) à 1,12) avec membre opposé.
14. En utilisant des pinces, maintenez le fémur en place, couper entourant le tissu musculaire à l'aide des ciseaux et enlever le fémur, le plaçant dans du PBS glacé.
15. Répétez l'étape 1.14) avec membre opposé.
16. L'utilisation d'un nouveau morceau de gaze stérile, maintenir la tête de la souris en place. En utilisant des pinces et ciseaux, retirez délicatement la peau pour exposer les skull. Avec des ciseaux, découpez soigneusement le crâne occipitale du centre haut en ligne droite et vers le bas pour exposer le cerveau postérieur.
17. En utilisant des pinces, scoop sous le cerveau vers l'antérieur et retirer l'ensemble du cerveau. Placez le cerveau dans le froid de la glace PBS.
18. Répéter les étapes 1.1) à 1,17) pendant au moins quatre souris.

2. Organe de pesée

1. Après l'isolement d'organes, peser chaque tube PBS contenant du poumon et les tissus du cerveau en utilisant une balance électronique.
2. Calculer la différence de poids en soustrayant le poids de pré-isolement (PBS uniquement) à partir du poids du tube PBS + organes (poumon et cerveau).
3. Déterminer la quantité de support nécessaire pour remettre en suspension des fragments de tissus provenant de la différence de poids calculée.
   Note: Lung et les tissus du cerveau sont le poids normalisé par resuspension dans un 4: 1 des médias: rapport de tissu (vol / poids).

3. Génération de médias Lung- et conditionné Un cerveau

1. Dans un t stérilequestion culture capot, inverser les tubes PBS contenant du poumon ou du cerveau trois fois pour éliminer le sang résiduel à partir d'organes et Aspirer PBS contenant du sang. Répéter avec le froid PBS frais jusqu'à ce que la solution semble claire avec aucune preuve de sang.
2. Placez les poumons et le cerveau de 60 mm ² boîtes de Pétri en verre séparés. L' utilisation de deux lames de scalpel stériles, les poumons émincer ou cerveaux par tranchage à plusieurs reprises avant et en arrière jusqu'à ce que des fragments de tissus sont d' environ ~ 1 mm ³ dans la taille.
3. des fragments de tissus Remettre en suspension dans un volume approprié (déterminé précédemment à l'étape 2.3) de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM): milieu F12 supplémenté avec 1x concentré complément mitogene et de la pénicilline (50 ug / ml) / streptomycine (50 pg / ml).
4. Ajouter des fragments de poumon ou de tissus du cerveau remis en suspension pour un puits d'une plaque à 6 puits.
5. Incuber les fragments de tissus dans un milieu pendant 24 heures à 37 ° C et 5% de CO _2. Après incubation, collecter des milieux conditionnés pour chaque tissu et futres dilué en ajoutant trois volumes équivalents de milieu frais dans un tube conique de 50 ml.
6. Centrifuger à 1000 xg dans un milieu conditionné dilué pour chaque organe à 4 ° C pendant 15 min pour éliminer les gros débris de tissu. Recueillir surnageant des médias et filtrer à travers un filtre à seringue de 0,22 um.
7. Piscine climatisée médias de chaque organe (ie., Du poumon avec des poumons et du cerveau avec le cerveau) de souris multiples pour tenir compte de la variabilité souris à la souris. Aliquoter et stocker milieux conditionnés à -80 ° C jusqu'à utilisation.

4. Génération des médias Bone Marrow conditionné

1. Dans une culture de tissu hotte stérile, couper l'excès de tissu de l'os et retirer épiphyses (pièces d'extrémité) des os avec des ciseaux.
2. L'utilisation d'un 27 ½ aiguille G, cavité médullaire au ras des os en poussant 1 ml de PBS à travers le centre de chaque os. Cela vous permettra de recueillir des cellules stromales de la moelle osseuse (BMSC) dans un nouveau tube contenant du PBS.
3. Centrifugeuse à 1,000 xg pendant 5 min à 4 ° C et laver BMSC deux fois avec PBS. Remettre en suspension les cellules stromales de la moelle osseuse dans 20 ml de milieu de croissance des cellules du stroma osseux (DMEM: F12 complémenté avec 1 x concentré mitogene supplément, de la pénicilline (50 ug / ml) / streptomycine (50 pg / ml) et 10% de sérum de boven fœtal (FBS) ).
4. Plaque de 10 ml de cellules stromales de moelle osseuse en suspension dans un flacon T75.
   Remarque: Combiner et cellules de la plaque de tous les 2 souris dans chaque flacon T75; pour quatre souris, deux flacons T75 sont nécessaires (environ 1 x 10 ⁷ cellules / flacon).
5. Incuber les cellules osseuses stromales de la moelle osseuse dans le stroma des milieux de croissance cellulaire pendant 24 heures à 37 ° C et 5% de CO _2. Après incubation, retirer les supports des deux flacons T75 et de mettre dans le nouveau flacon T75, étiqueter ce flacon comme "Floater Flask". Ajouter un milieu de croissance de cellules fraîches de stroma os précédentes 2 flacons et incuber les 3 flacons à 37 ° C et 5% de CO _2.
6. Après que les cellules atteignent environ 70% de confluence (environ 5-7jours) de cellules de passage. Pour ce faire, éliminer le milieu et laver les cellules deux fois avec du PBS (3 ml à chaque lavage). Retirer PBS et ajouter 3 ml d'une solution de trypsine / EDTA, en veillant à ce que la trypsine couvre toute la surface du flacon. Après que les cellules se soulèvent le ballon (~ 2 - 3 min), arrêtez trypsinisation réaction en ajoutant 3 ml d'os stromal milieux de croissance cellulaire). Centrifugeuse 900 g pendant 5 min à 4 ° C, jeter les médias, et remettre les cellules dans 10 ml de milieu de croissance de cellules fraîches stromale osseuse.
7. Les cellules de la piscine de tous les flacons et passage 1: 5 en trois nouveaux flacons T75 et incuber à 37 ° C et 5% de CO _2. Après que les cellules une fois atteint à nouveau 70%, répétez l'étape 4.6 et de la piscine et de passage toutes les cellules adhérentes une seconde fois. Re-plaque toutes les cellules à quatre flacons T75 et incuber à 37 ° C et 5% de CO _2. les milieux de croissance des cellules du stroma osseux doit être utilisé pour toutes les étapes.
8. media F12 + 1x mitogène concentré su: Laisser les cellules atteignent la confluence, laver les cellules trois fois avec du PBS et ajouter os stromal collection media cellulaire (DMEMpplement + pénicilline (50 ug / ml) / streptomycine (50 pg / ml); 10 ml / T75), en veillant à ce que ce média est libre de FBS. Collecter les médias de la moelle osseuse conditionné 72 heures plus tard, filtrer à travers un filtre de 0,22 um, piscine, aliquote, et conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation.
9. Si l'on désire confirmer le phénotype des cellules stromales de la moelle osseuse (BMSC) isolées en utilisant des anticorps contre la souris Sca-1, CD105, CD29, et CD73, CD44, en utilisant des techniques de cytométrie débit standard comme décrit précédemment ^13.

5. Génération des médias ganglionnaire conditionné

1. Dans une hotte de culture de tissus stériles, inverser le tube PBS contenant des ganglions lymphatiques trois fois pour éliminer le sang résiduel des ganglions lymphatiques et aspirée sanglante PBS. Répéter avec le froid PBS frais jusqu'à ce que la solution semble claire avec aucune preuve de sang.
2. Placez les ganglions lymphatiques dans des boîtes de Pétri en verre de 60 mm ^2. L'utilisation de deux lames de scalpel stériles, les ganglions lymphatiques hachis par tranchage à plusieurs reprises avant et en arrière jusqu'à ce tissufragments e sont d' environ 1 mm ³ dans la taille.
3. Dans un tube conique, les fragments de tissu de remise en suspension dans 10 ml de Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) milieu supplémenté avec de la pénicilline (50 ug / ml) / streptomycine (50 pg / ml), 5 x 10 ^-5 M β-mercaptoéthanol stérile ( 1,75 ul / 500 ml de milieu) et 10% de FBS.
4. Centrifuger à 900 g pendant 5 min à 4 ° C et remettre en suspension toutes les cellules dans 30 ml de milieu. Ajouter 5 ml de milieu / puits dans une plaque à 6 puits et incuber pendant 7 jours à 37 ° C et 5% de CO _2.
5. Après l'incubation de 7 jours, jeter les médias, laver les cellules adhérentes avec 5 ml PBS chaud et ajoutez 5 ml de milieu frais dans chaque puits. Permettre aux cellules de croître jusqu'à la confluence (environ 5 - 7 jours), trypsiniser, piscine toutes les cellules, et le passage comme décrit à l'étape 4.6. cellules Re-plaque à plaque de 6 puits. Répétez cette étape trois fois.
6. Après trois passages, permettent aux cellules de croître jusqu'à la confluence, laver les puits trois fois avec du PBS et ajouter 2 ml / puits de DMEM: F12 + 1xSupplément concentré mitogene et de la pénicilline (50 ug / ml) / streptomycine (50 pg / ml), en veillant à ce que ce support est dépourvu de FBS. Collecter les médias de nœuds lymphatiques conditionné après 72 heures, piscine, aliquote, et conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation.
7. Si l'on désire confirmer le phénotype des cellules des ganglions lymphatiques de stroma isolées (LNSC) en utilisant des anticorps dirigés contre le CD45 et gp38 de souris, en utilisant des techniques de cytométrie en flux standards comme décrit précédemment ^13.

6. Utilisation d'Organ conditionné médias pour dosages en aval liés à Métastases Comportement des cellules cancéreuses

1. Une fois que les médias d'organes conditionné a été généré comme décrit dans les étapes 1 - 5, de l'utiliser pour effectuer différentes cellules en aval et des analyses de biologie moléculaire afin de déterminer l'influence des facteurs d'organes dérivés solubles sur le comportement métastatique des cellules cancéreuses. Des exemples d'analyses classiques (décrits par ailleurs dans la littérature) comprennent des réseaux de protéines ^13, les dosages de croissance cellulaire ^{13, la migration cellulaire Dosages 13, tumorsphere formation 14 et RT-PCR 15. Les milieux de base originaux utilisés pour générer les médias d'organe-conditionné (ie, DMEM inconditionnée:. F12 supplémenté avec 1x concentré supplément de mitogène et de la pénicilline (50 pg / ml) / streptomycine (50 pg / ml) doit être utilisé comme témoin négatif .}

Résultats

Génération des médias Organ-conditionné

Une vue d' ensemble diagramme / schématique du procédé d'isolement d'organes et de génération de milieu conditionné est présenté à la figure 1, avec des images photographiques représentatives de la procédure représentée sur la figure 2. Il convient de noter que , lorsque ce protocole a d' abord été en c...

Discussion

Métastase est un processus complexe par lequel une série d'événements cellulaires sont ultimement responsables de l' invasion des tissus et de la tumeur lointaine création ^4,30,31. L'ex vivo système de modèle présenté ici peut être utilisé pour étudier deux aspects importants de la progression métastatique: le cancer homing des cellules ou de migration à un organe spécifique ( "y arriver") et la croissance de cet organe ( «il y en croissance»). De nombreuses ét...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 ml conical tubes	Thermo Scientific (Nunc)	339652	Keep sterile
1x Phosphate-buffered saline	ThermoFisher Scientific	10010-023	Keep sterile
Nude mice	Harlan Laboratories	Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu	Use at 6 - 12 weeks of age
Polystyrene foam pad	N/A	N/A	The discarded lid (~ 4 x 8 inches or larger) of a polystyrene foam shipping container can be used for this purpose. Sterilize by wiping with ethanol.
Forceps	Fine Science Tools	11050-10	Keep sterile
Scissors	Fine Science Tools	14058-11	Keep sterile
Gauze pads	Fisher Scientific	22-246069	Keep sterile
60 mm2 glass petri dishes	Sigma-Aldrich	CLS7016560	Keep sterile
Scalpel blades	Fisher Scientific	S95937A	Keep sterile
DMEM:F12	Life Technologies	21331-020	Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile
1x Mito + Serum Extender	BD Biosciences	355006	Referred to as "concentrated mitogen supplement" in the manuscript. Keep sterile
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	Keep sterile
Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640)	Life Technologies	11875-093	Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F1051-500ML	Keep sterile
Trypsin/EDTA solution	ThermoFisher Scientific	R-001-100	Warm in 37 °C water bath before use, keep sterile
6-well tissue culture plates	Thermo Scientific (Nunc)	140675	Keep sterile
0.22 μm syringe filters	Sigma-Aldrich	Z359904	Keep sterile
T75 tissue culture flasks	Thermo Scientific (Nunc)	178905	Keep sterile
Transwells	Sigma-Aldrich	CLS3464	Keep sterile, use for migration assays
Anti-mouse Sca-1	R&D Systems	FAB1226P	use at 10 µl/106 cells
Anti-mouse CD105	R&D Systems	FAB1320P	use at 10 µl/106 cells
Anti-mouse CD29	R&D Systems	FAB2405P-025	use at 10 µl/106 cells
Anti-mouse CD73	R&D Systems	FAB4488P	use at 10 µl/106 cells
Anti-mouse CD44	R&D Systems	MAB6127-SP	use at 0.25 µg/106 cells
Anti-mouse CD45	eBioscience	11-0451-81	use at 5 µl/106 cells
Anti-mouse gp38	eBioscience	12-5381-80	use at 10 µl/106 cells
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250	Keep sterile
Protein arrays	RayBiotech Inc.	AAM-BLM-1-2	Use 1 array per media condition (including negative control), in triplicate